2018年3月12日
该协议描述了一个通用的战略, 以重新生成商业阵列金电极装备的无标签的细胞分析仪, 旨在节省高运行成本 ofmicrochip 的化验。再生过程包括胰蛋白酶消化, 用乙醇和水冲洗, 和一个纺纱步骤, 使微晶片的重复使用。
该程序的总体目标是再生配备实时细胞分析仪 (RTCA) 的商用电子板。这种方法可以帮助回答一次性金基芯片再生领域的关键问题,包括 RTCA 中使用的电子计划的再生。该技术的主要优点是可以使用温和且容易获得的低毒性实验室试剂进行再生程序。
当我们开始使用 Real-Time Cell Analyzer 时,我们第一次有了这种方法的想法,这种方法的成本是金基芯片。按照文本方案中的说明,从细胞培养皿中 A549 细胞的孵育和增殖开始此过程。向电子板 L8 的每个孵育孔中加入 150 μL 细胞培养基。将板在生物安全罩中放置 30 分钟以达到平衡。
30 分钟后,将电子板 L8 手动插入 CO2 培养箱中 37 摄氏度的实时细胞分析仪中。接下来,在计算机上启动 Real-Time Cell Analyzer作程序。在默认实验模式设置页面上,选择 Experiment Model (实验模型),然后为正在运行的分析命名。
在其布局页面上,选择实验中包含的相应孔,并在编辑框中输入细胞类型、编号和药物名称等信息。在其计划页面上,添加实验步骤,然后选择每个步骤的运行时间和实时数据采集的间隔。单击 Start 测量介质的背景阻抗。
将保存实验文件。结果数据将自动减去。在绘图页面上,添加井,将显示时间单元索引的图形。
对于细胞增殖实验,首先单击暂停按钮以暂停程序。然后取出电子板,在室温下每孔加入 100 微升 A549 细胞悬液缓冲液。将板在生物安全罩中放置 30 分钟,让细胞沉降到孵育孔的底部。
手动将电子板插入实时细胞分析仪站。然后单击 start (开始) 按钮继续实验。在绘图页面上,分析器在整个实验过程中连续记录细胞索引值或曲线。
实验完成后,进入 plot 页面,打开 实验文件。然后选择所有测试的孵育孔和得到的细胞指数曲线,这些曲线可以在添加药物或更换培养基之前最后一次平均或归一化,以减少检测之间的差异。在数据分析页面上,可以计算 EC50 或 IC50
。按照文本方案中的说明进行抗癌药物的细胞毒性评估后,从实时细胞分析仪站中取出含有细胞的电子板。将用过的电子板置于室温下的无菌生物安全罩中,并使用移液器充分混合培养基。然后使用移液器吸出整个培养基。
在室温下用 200 微升去离子水冲洗电子板 3 次。用 0.25% 新鲜制备的胰蛋白酶在 37 摄氏度的培养箱中消化电子板上的剩余细胞 1 至 2 小时。消化完成后,在室温下在生物安全罩中工作,用移液管将孵育溶液混合 5 到 10 次,然后取出溶液。
用 200 微升去离子水冲洗电子板两次。然后用 200 微升 100% 乙醇洗涤两次,然后用相同体积的 75% 乙醇洗涤两次。最后,再用 200 微升去离子水冲洗两次。
将电子板倒置在无菌纱布或纸巾上,在室温下倒出剩余的水。然后在生物安全罩中,在室温下对再生电子板进行紫外线灭菌 1 至 2 小时。如文本方案中所述,使用介孔材料使用板进行药物递送后,像以前一样用胰蛋白酶消化剩余的细胞。
由于实验中经常使用移液器,因此该人员应注意避免划伤尖端和微芯片的表面。在室温下,在 Bio-safety 通风橱中用 200 微升去离子水冲洗微芯片一次。然后在室温下用 200 微升无水乙醇发酵微芯片两次。
接下来,在室温下用 200 微升 75% 乙醇冲洗微芯片一次。在每个孔中加入 250 微升 75% 乙醇,并在室温下用密封膜密封电子板。将电子板以 114 倍 G 旋转 2 分钟后,清空电子板。
将电子板倒置在无菌纱布或纸巾上,在室温下倒出剩余的液体。重复 75% 乙醇冲洗,然后旋转。然后在生物安全罩中,在室温下对再生电子板进行紫外线灭菌 1 至 2 小时。
按照文本协议中的描述,首先通过拆卸孵育井的底部来评估再生电子板表面的光学特性。为了评估新鲜和再生电子板上吸收抗癌药物后贴壁细胞的活力,使用共聚焦激光扫描显微镜监测 A549 细胞吸收的 DOX 分子的自发荧光。为了记录细胞吸收的 DOX 的自发荧光,请使用 63 倍油物镜和 485 纳米作为激发波长。
接下来,首先在抛光布上用发光浆料将金电极和玻碳电极抛光到镜面状表面,从而评估再生电极的电化学行为。然后在水中对电极进行超声处理以去除任何颗粒。接下来,在 0.5 摩尔硫酸中激活金电极。
在 10 毫摩尔氯化钾电解质溶液(含有 1 毫摩尔法氰化钾)中获得裸金电极和玻碳电极的电化学阻抗谱或 EIS 数据。现在,将 10 微升细胞悬液滴在 GCE 中的金电极表面。添加细胞后,将 GCE 中的金电极在 37 摄氏度的培养箱中孵育 3 小时,然后获得用细胞修饰的电极的 EIS 数据,如文本方案中所述。
为了再生电极,将金电极浸入用 0.25% 胰蛋白酶中的细胞修饰的 GCE 中 0.5 至 2 小时。用水轻轻冲洗两个电极四次。然后,用无水乙醇轻轻冲洗电极四次。
接下来,将金电极浸入 GCE 中,溶于 75% 乙醇中约 5 分钟。五分钟后,用 75% 乙醇轻轻冲洗芯片四次,然后获得再生电极的 EIS 数据,如文本方案中所述。为了评估阵列金电子板的再生效率,对新鲜和处理的电子板进行了显微镜观察。
未发现微芯片表面的光学特性存在虚拟差异。阿霉素分子的 throescence 用于评估再生前后金微芯片上的细胞状态。相似的均一性和明确的细胞形态证明了芯片的可重复使用性。
再生方案适用于细胞增殖的真实测试。从测试电子板的多个孵育孔中获得的生长曲线显示出良好的一致性,表明商业芯片的成功再生。此处显示的再生电子板 L8 使用介孔二氧化硅材料进行了细胞毒性评估测试。
与对照相比,介孔材料处理样品的细胞指数降低,表明材料具有轻微的细胞毒性。介孔材料进一步包埋和释放抗癌药物阿霉素导致 A549 细胞生长曲线急剧下降。一旦掌握,如果执行得当,这项技术可以在四个小时内完成。
在尝试此过程时,请务必记住,类型接收器消化时间可能因芯片而异。按照这个程序,可以执行其他方法,如共聚焦激光扫描显微镜,甚至光谱学、电化学阻抗谱,以回答其他问题,如评估再生效应。
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本协议概述了一种用于再生在实时细胞分析仪(RTCA)中使用的商业金微电极的方法。再生过程旨在通过一系列温和处理允许反复使用,从而降低与一次性微芯片相关的成本。
Disposable gold microchips in real-time cell analysis impose significant recurring costs that limit assay scalability in drug discovery workflows. This regeneration protocol enables cost-effective reuse of commercial electronic plates, supporting sustainable and scalable label-free impedance-based cell assays. By reducing consumable expenses, the method improves capital efficiency and supports higher-throughput screening in early discovery stages.
The method fits within the discovery continuum by enabling reusable impedance-based readouts from early compound screening through follow-up mechanistic validation, reducing the need for repeated chip procurement.