Name: 用于实时细胞分析仪的阵列金电极再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 了解实时细胞分析仪阵列金电极的再生方法，使用低毒性试剂处理A549细胞并清洗电极表面。该技术可显著降低实验成本，支持实验室可持续发展，适用于多次重复使用的金基芯片。

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本工作得到国家自然科学基金（U1703118）、江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）项目、江苏省“双创计划”、化学生物传感与计量学国家重点实验室开放基金（2016015）、生物大分子国家重点实验室开放基金（2017kf05）以及江苏省特聘教授项目的支持。

注意：通常情况下，再生过程包括胰蛋白酶消化以及用乙醇和水进行冲洗的步骤。消化时间需根据所用细胞的数量进行调整，而所用细胞的类型和数量则可能因实验目的不同而有所差异。建议使用光学和电化学方法检测再生后的微芯片，以优化再生条件。实验过程中可能涉及可溶性和不可溶性化学物质，本文详细说明了这两种典型情况下的再生操作流程。
1. 再生溶液的制备
注意：所有溶液均需在无菌条件下配制和操作。
<ol>
	<li>配制新鲜的 0.25% (g/v) 胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶可直接购买，或按以下步骤新鲜配制。
	<ol>
		<li>将 0.25 g 胰蛋白酶溶解于 100 mL pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>在 4 oC 下搅拌溶液，直至胰蛋白酶完全溶解。以低速搅拌，注意避免产生气泡。</li>
		<li>在生物安全柜中使用 0.22 µm 滤器过滤该溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用纯乙醇配制 75% 乙醇。取 75 mL 纯乙醇倒入容量瓶中，加入去离子水至总体积为 100 mL。必要时进行进一步灭菌处理。</li>
</ol>
2. 电子培养板中A549细胞的孵育与增殖
注意：电子板类型16和L8均采用光刻技术在孵育孔底部印制的阵列式金微电极制成。电子板16包含16个孔，而电子板L8包含8个孔。电子板16的孔为圆形，而电子板L8的孔为圆角矩形。每个电子板L8孔的体积约为830 µL，每个电子板16孔的体积约为270 µL。
<ol>
	<li>A549 细胞培养
	<ol>
		<li>在细胞培养皿中使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 Roswell Park Memorial Institute-1640 培养基（RPMI-1640）培养 A549 细胞。</li>
		<li>当细胞密度达到约 75% 时进行传代，用 1 × PBS 洗涤贴壁细胞层，并在 37 oC 下用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化 1 分钟。以 179 × g 离心 5 分钟以去除胰蛋白酶。将细胞重悬于 10 mL 培养基中，用于后续培养或其他实验。 
		注：此处将细胞重悬于培养基中的溶液称为细胞悬液缓冲液。</li>
		<li>取 10 µL 样品，使用血细胞计数板计数细胞数量。用 RPMI-1640 培养基进一步稀释细胞悬液缓冲液，制备浓度为 30,000–80,000 个细胞/mL 的细胞悬液缓冲液用于实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>增殖/细胞毒性实验及数据采集
	<ol>
		<li>向电子板 16 的每个孵育孔中加入 50 µL（电子板 L8 为 150 µL）细胞培养基，在生物安全柜中静置 30 分钟以平衡环境。手动将电子板 16 插入 CO2 培养箱内 37 oC 下的实时细胞分析仪中。</li>
		<li>在计算机上启动实时细胞分析仪操作程序。在其默认的实验模式设置页面中，选择“实验模型”并命名当前运行的检测。</li>
		<li>在其“布局”页面中，选择实验所涉及的相应孔位，并在编辑框中输入细胞类型、数量和药物名称等信息。在其“时间表”页面中，添加实验步骤，然后设定每一步的运行时间（例如 12、24 或 48 小时）以及实时数据采集的时间间隔。 
		注：此处步骤 1 和步骤 2 的采集间隔分别为 1 分钟和之后的 15 分钟。</li>
		<li>保存文件后，点击“开始”按钮，在其“细胞指数”页面测量培养基的背景阻抗，所得数据将自动扣除。在其“孔图”页面可查看所有孔的曲线。在其“绘图”页面添加孔位后，将显示时间-细胞指数的图形。</li>
		<li>进行细胞增殖实验时，首先点击“暂停”按钮暂停程序。取出电子板，在室温下每孔加入 100 µL A549 细胞悬液缓冲液。将板置于生物安全柜中静置 30 分钟，使细胞沉降到孵育孔底部。</li>
		<li>&#160;手动将电子板插入实时细胞分析仪主机中，点击“开始”按钮继续实验。 
		注：在“绘图”页面，分析仪在整个实验过程中持续记录细胞指数值或曲线。</li>
		<li>实验完成后，进入“绘图”页面并打开实验文件。选择所有被检测的孵育孔，可在添加药物或更换培养基前最后一次对所得细胞指数曲线进行平均化或归一化处理，以减少不同检测间的差异。在“数据分析”页面可计算 EC50 或 IC50 值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 电子平板的再生
注意：每次洗涤步骤中，均使用移液器将电子板中的溶液充分混匀（5-10 次）。
<ol>
	<li>案例1：用于细胞毒性评估的 抗 抗癌药物
	<ol>
		<li>按照第2节所述方法，将A549细胞接种于电子培养板上。</li>
		<li>首先将抗癌药物盐酸多柔比星（DOX）溶解于细胞培养基中。使用移液器将DOX缓慢加入细胞中（DOX的终浓度为30 µg/mL）。按照第2节所述记录CI值。 
		注意：实验结束后立即对电子板进行了再生。本实验中，由于阿霉素（DOX）为可溶性化学物质，按照该方案进行电子板的再生操作相对简便，无需额外步骤。</li>
		<li>再生
		<ol>
			<li>从实时细胞分析仪工作站中取出含有细胞的电子培养板。将使用过的电子培养板置于室温下的无菌生物安全柜中，用移液器充分混匀培养基。吸除全部培养基。</li>
			<li>用 200 µL 去离子水在室温下冲洗电子板 3 次。</li>
			<li>在37℃培养箱中，用0.25%新鲜配制的胰蛋白酶消化电子板上剩余的细胞1–2小时（每孔200 µL） oC. 消化完成后，在室温下于生物安全柜中用移液器将孵育液吹打混匀5-10次，并将全部溶液移出。</li>
			<li>用200 µL乙醇和200 µL水分别冲洗电子板，具体步骤如下：去离子水冲洗2次，100%乙醇冲洗2次，75%乙醇冲洗2次，再去离子水冲洗2次。将电子板倒置在无菌纱布或纸巾上，于室温下沥干残留水分。</li>
			<li>在室温下，于生物安全柜中对再生的电子板进行紫外线灭菌1-2小时。 
			注意：电子板 L8 再生时，所有溶液的体积加倍。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>案例2：使用介孔材料进行药物递送
	<ol>
		<li>使用平均孔径为5.6 nm的棒状介孔二氧化硅材料作为药物递送载体，如先前报道所述20. 
		注意：此处采用电子板来监测药物释放对细胞的作用效果。
		<ol>
			<li>将介孔材料加入电子板各孔的孵育溶液中。由于硅材料不溶且会在电子板中沉淀，需按以下步骤清洗板孔：</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照案例1中所述执行步骤3.1.3.1-3.1.3.3。</li>
		<li>在生物安全柜中，于室温下用 200 µL 去离子水冲洗微芯片一次。</li>
		<li>用 200 µL 无水乙醇在室温下冲洗微芯片 2 次。</li>
		<li>用 200 µL 75% 乙醇在室温下冲洗微芯片一次。</li>
		<li>向每个孔中加入 250 µL 75% 乙醇，并用封板膜在室温下密封电子板。</li>
		<li>以 114 × g 离心 2 分钟，倒掉电子板中的液体。将电子板倒置于无菌纱布或滤纸上，于室温下沥干残留水分。</li>
		<li>重复步骤 3.2.5 至 3.2.7 一次。</li>
		<li>在生物安全柜中，于室温下对再生的电子板进行紫外线灭菌1-2小时。 
		注意：清洗L8电子板时，所有溶液的体积加倍。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 再生效果的评估
<ol>
	<li>再生电子板表面的光学特性
	<ol>
		<li>使用钢勺小心拆卸含有排列好的金微电极的新鲜或再生电子板的孵育孔底部。戴上塑料手套，用钢勺小心地将含有微芯片的部分从电子板中刮出。</li>
		<li>将两部分均置于玻璃载玻片中心，使用配备CCD检测器的拉曼显微镜采集相应的拉曼光谱21. 
		注意：光谱仪配备有633 nm激光器，光谱在500–3500 cm⁻¹波数范围内以每30秒激光照射间隔记录-1光学图像由拉曼显微镜获取，使用10倍目镜和50倍物镜。 图1A 和 图1C 也使用安装的拉曼显微镜装置获得。</li>
		<li>为评估抗癌药物摄取后贴壁细胞在新鲜和再生电子板上的存活情况，使用共聚焦激光扫描显微镜监测A549细胞吸收的阿霉素（DOX）分子的自发荧光。
		<ol>
			<li>为了记录细胞（新鲜及再生电子平板上的 A549 细胞）对吸收的 DOX 的自发荧光，使用 63X 物镜&#160;油镜，激发波长为485 nm。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再生电极的电化学行为 
	注意：由于手动拆解商用电子板较为困难，且不利于表面电学状态的准确评估，因此本方案的再生效率评估采用常规金电极/玻碳电极（GCE）作为测试平台，并在该平台上进行电化学阻抗谱（EIS）分析。金电极与GCE的直径均为3 mm。电化学数据通过电化学分析仪在三电极系统中获取，阻抗测量采用幅值为10 mV的交流（AC）信号，在100 kHz至0.01 Hz的宽频率范围内进行。
	<ol>
		<li>测量前，使用抛光布上的氧化铝悬浊液将金电极和玻碳电极抛光至镜面，随后在水中超声处理以去除残留颗粒。</li>
		<li>在 0.5 M H 中活化金电极2SO4. 在含有1 mM K3[Fe(CN)6]的10 mM KCl电解质溶液中，获取裸金电极和GCE的EIS数据3[Fe(CN)6如所述]22.</li>
		<li>按照2.1.2和2.1.3步骤制备A549细胞储备液。取10 µL细胞悬液滴加于金电极（Au electrode）和玻碳电极（GCE）表面。将接种细胞的金电极和玻碳电极置于37 oC 培养箱中孵育 3 小时。在含有 1 mM K₃[Fe(CN)₆] 的 10 mM KCl 电解液中，获取细胞修饰的金电极和玻碳电极（GCE）的电化学阻抗谱（EIS）数据。3[Fe(CN)6].</li>
		<li>使用该方案再生电极并测量电化学阻抗谱。
		<ol>
			<li>将细胞修饰的金电极和玻碳电极（GCE）浸入0.25%胰蛋白酶溶液中0.5–2小时。用去离子水轻轻冲洗金电极和GCE共4次。用无水乙醇轻轻冲洗电极共4次。将金电极和GCE浸入75%乙醇中约5分钟。用75%乙醇轻轻冲洗芯片共4次。</li>
			<li>在含有1 mM K3[Fe(CN)6]的10 mM KCl电解质溶液中，获取再生金电极和GCE的EIS数据3[Fe(CN)6].</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+monitoring+of+cell-based+assays%3A+Combining+impedance+analysis+with+SPR+for+multiparametric+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling.</a> Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们在表1中总结了若干可用于微芯片再生的方法17,23,24,25,26。这些方法通常需要较为剧烈的实验条件，才能实现芯片的完全再生，原因在于分子间存在较强的相互作用，例如SPR芯片中使用的免疫复合物。然而，这些剧烈的实验条件可能对RTCA中所用的阵列化金微芯片表面性质造成严重损害。因此，在本研究提出的再生策略开发过程中，温和且高效的方法成为主要考虑因素。此外，环境问题也同样重要，因为这些一次性微芯片常与靶向癌细胞联合使用。
在本实验方案中，我们介绍了一种用于再生商用阵列式金微芯片的通用方法，该芯片用于实时细胞分析（RTCA）。本方案基于胰蛋白酶消化，并使用乙醇和水进行冲洗。额外的离心步骤有助于在再生过程中有效去除检测中使用的...

由于其实验流程高效且劳动强度较低，无标记细胞分析技术在过去十年中发展迅速，已广泛应用于分析和筛选领域，例如蛋白质组学研究。1,2药物递送3, 等等。4,5 与传统的以细胞分析为目标的生化方法相比，采用Giaever及其同事先前开发的原型进行的无标记实时细胞检测6 基于记录细胞附着微芯片表面电信号变化的原理，可对细胞生长或迁移进行连续且定量的测量。依据该策略，已开发出一种基于电阻抗检测原理的实时细胞电子传感（RT-CES）系统。7,8 最近，一种用于实验室研究的商用实时细胞分析仪（RTCA）已上市。9.
商用实时细胞分析仪主要读取细胞在微芯片表面培养过程中因细胞增殖、迁移、活性、形态及贴壁状态等生理变化所引起的电学阻抗信号10,11。这些电信号进一步被分析仪转换为一个无量纲参数——细胞指数（Cell Index, CI），用于评估细胞状态。微芯片阻抗的变化主要反映电极/溶液界面处覆盖细胞区域的局部离子环境。因此，细胞分析仪的分析性能在很大程度上依赖于其核心传感单元——一次性微芯片（i.e.，即所谓的电子培养板，e.g.，96/16/8孔板），该芯片由光刻技术在培养孔底部印刷的阵列式金微电极构成。金微电极以“线中圆”（circle-on-line）形式排列（图1），覆盖了培养孔底部大部分表面积，从而实现对贴壁细胞的动态且灵敏的检测3,12,13,14。当芯片表面细胞覆盖面积增加时，CI值上升；而当细胞暴露于毒性物质导致发生凋亡时，CI值则下降。尽管实时细胞分析仪已被广泛用于细胞毒性11和神经毒性15的检测，并能比传统终点法提供更丰富的动力学信息，但一次性电子培养板是其中成本最高的耗材。
迄今为止，尚无可用的方法用于电子板的再生，这可能是由于再生过程涉及较为剧烈的条件，例如使用食人鱼溶液或乙酸16,17,18，这些条件可能会改变金微芯片的电学状态。因此，开发一种温和且高效的方法以去除附着在金芯片表面的细胞及其他物质，将有助于实现电子板的再生。我们近期开发了一种利用非腐蚀性试剂再生一次性电子板的方案，并通过电化学和光学方法对再生后的芯片进行了表征19。通过使用常规且温和的实验室试剂（包括胰蛋白酶和乙醇），我们建立了一种通用方法，可在不产生不良影响的前提下再生商用电子板，并已成功应用于RTCA所用的两种主要类型电子板（16孔和L8型）的再生。

<table><tbody><tr><td>大鼠：Sprague-Dawley</td><td>查尔斯河实验室（Charles River）</td><td>货号# 400</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗大鼠 CD11b 单克隆抗体（克隆株 OX42）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>货号 MCA275R</td><td>平移：1:1,000；染色：1:500</td></tr><tr><td>山羊多克隆抗Iba1&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>货号 AB5076</td><td>染色：1:500</td></tr><tr><td>兔多克隆抗Ki67抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>货号 AB15580</td><td>染色：1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 驴抗小鼠 594</td><td>Invitrogen</td><td>货号 11055</td><td>染色：1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 驴抗山羊 488</td><td>Invitrogen</td><td>货号 A-21203</td><td>染色：1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 驴抗兔 647</td><td>Invitrogen</td><td>货号 A-31573</td><td>染色：1:500</td></tr><tr><td>Triton-X（免疫细胞化学染色中的去垢剂）</td><td>Thermo Fisher</td><td>货号 28313</td><td></td></tr><tr><td>硫酸乙酰肝素</td><td>盖伦实验室用品</td><td>货号 GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>货号 M3149</td><td></td></tr><tr><td>脱脂乳蛋白胨</td><td>Sigma</td><td>货号 P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;2</td><td>Peprotech</td><td>货号 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-34</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>货号# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>绵羊羊毛胆固醇</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>货号 700000P</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>货号 354233</td><td></td></tr><tr><td>油酸</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>货号 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)二十碳二烯酸（芥酸）</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>货号 20606</td><td></td></tr><tr><td>钙黄绿素AM染料</td><td>Invitrogen</td><td>货号 C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶同源二聚体-1</td><td>Invitrogen</td><td>货号 E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>沃辛顿</td><td>货号：DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>货号 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>货号 T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>货号 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>货号 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>货号 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>货号 A9165</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>货号 16634</td><td></td></tr><tr><td>去铁转铁蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>货号 T1147</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma</td><td>货号 S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（高糖）</td><td>Gibco</td><td>货号 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>货号# 0100-20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>货号 A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 培养板&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>货号 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;储备试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;重组&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;使用的浓度&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;储存&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>脱铁转铁蛋白</td><td>10 mg/mL，溶于PBS中&amp;nbsp;</td><td>1:100</td><td>-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>5 mg/mL，溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>1:1,000</td><td>-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>2.5 mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>1:25,000</td><td>-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>200 &amp;mu;g/mL 在 PBS 中&amp;nbsp;</td><td>1:100</td><td>-80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGF-β2</td><td>20 &amp;mu;g/mL in PBS&amp;nbsp;</td><td>1:10,000</td><td>-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>100 &amp;mu;g/mL in PBS&amp;nbsp;</td><td>1:1,000</td><td>-80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>绵羊羊毛胆固醇</td><td>1.5 mg/mL，溶于100%乙醇&amp;nbsp;</td><td>1:1,000</td><td>-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>硫酸乙酰肝素</td><td>1 mg/mL，溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>1:1,000</td><td>-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>油酸/芥酸</td><td>贡多酸：0.001 mg/mL；油酸：0.1 mg/mL，溶于100%乙醇&amp;nbsp;</td><td>1:1,000</td><td>-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>肝素</td><td>50 mg/mL，溶于PBS中&amp;nbsp;</td><td>1:100</td><td>-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;溶液&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;配方&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>灌注缓冲液</td><td>50 &amp;mu;DPBS 中的 g/mL 肝素&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; （含 Ca 的 PBS）&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;+ +&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>冰冻时使用</td></tr><tr><td>Douncing 缓冲液</td><td>200 &amp;mu;0.4% DNase I 溶于 50 mL DPBS 中&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;</td><td></td><td>冰冻时使用</td></tr><tr><td>铺板缓冲液</td><td>DPBS 中含 2 mg/mL 牛奶固体蛋白胨&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小胶质细胞生长培养基（MGM）</td><td>DMEM/F12，含100单位/毫升青霉素、100 &amp;mu;g/mL 链霉素，2 mM 谷氨酰胺，5 &amp;mu;g/mL N-乙酰半胱氨酸，5 &amp;mu;g/mL 胰岛素，100 &amp;mu;g/mL 脱铁转铁蛋白，以及 100 ng/mL 亚硒酸钠</td><td></td><td>使用预冷的MGM培养基将小胶质细胞从免疫平皿上冲洗下来。</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白包被</td><td>含 2 的 MGM &amp;mu;g/mL 胶原蛋白 IV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>髓鞘分离缓冲液</td><td>9 mL Percoll PLUS，1 mL 不含Ca的10x PBS&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, 9 &amp;mu;L 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 &amp;mu;L 1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>添加后充分混匀&amp;nbsp; CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>含TGF-β2/IL-34/胆固醇的生长培养基（TIC）&amp;nbsp;</td><td>含人 TGF-b2 2 ng/mL、小鼠 IL-34 100 ng/mL、1.5 &amp;mu;g/mL 羊毛胆固醇，10 &amp;mu;0.1 g/mL 肝素硫酸酯 &amp;mu;微克/毫升油酸，以及0.001 &amp;mu;g/ml 十一碳烯酸</td><td></td><td>确保将胆固醇加入已预热至37℃的培养基中 &amp;deg;C，且添加量不超过1.5 &amp;mu;g/mL，否则会析出沉淀。含胆固醇的培养基不得过滤。将TIC培养基与10% CO₂平衡&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 在加入细胞前孵育30分钟至1小时，以确保pH值处于最佳状态。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

用于实时细胞分析仪的阵列式金微电极的再生

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

无标记细胞实验因其无需使用实验动物而在生物化学研究中具有优势。由于该方法能够比传统生物化学实验提供更动态的生理条件下细胞信息，基于电学阻抗原理的无标记实时细胞检测技术在过去十年中受到越来越多关注。然而，由于检测成本相对较高，其实际应用可能受到限制，其中细胞分析仪需使用昂贵的一次性金微芯片作为耗材。在本实验方案中，我们开发了一种通用策略，用于再生适用于商用无标记细胞分析仪的阵列式金微电极。再生过程包括胰蛋白酶消化、乙醇和水冲洗以及旋转步骤。该方法已通过测试，证明可有效实现商用电子检测板的再生和重复使用至少三次，有助于研究人员降低实时细胞检测的高昂运行成本。

金微芯片的表面特性本方案中所采用的再生步骤已在 图1. 图2 显示了通过光学显微镜观察的新鲜和再生电子板的微观表面形貌。如图所示 图2A 和 图 2C，显微观察表明，新鲜电子板与处理后电子板的微芯片表面在光学性质上几乎没有差异。利用细胞内阿霉素分子的自发荧光来方便地评估细胞状态，我们观察到在再生后的金微芯片上培养的细胞具有相似的均一性图2B 和 图2D此外，孵育后的癌细胞在电子芯片上呈现出清晰的细胞形态，表明芯片具有可重复使用性。 图3 显示了新鲜与再生电子芯片的拉曼光谱。新鲜与处理后电子芯片...

本方案描述了一种通用策略，用于再生市售的阵列式金微电极，该电极专为无标记细胞分析仪设计，旨在降低基于微芯片检测的高昂运行成本。再生过程包括胰蛋白酶消化、乙醇和水冲洗以及离心步骤，可实现微芯片的重复使用。

无标记细胞实验方法在生物化学研究中具有优势，因为它无需使用实验动物。由于其具备……能力，……

本实验的总体目标是再生用于实时细胞分析仪（RTCA）的商用电子板。该方法有助于解决一次性金基芯片再生领域中的关键问题，包括RTCA中所用电子板的再生。该技术的主要优势在于，再生过程可使用温和、易得且低毒性的实验室试剂完成。我们最初在使用基于金芯片的实时细胞分析仪时萌生了该方法的想法。按照文本方案所述，首先在细胞培养皿中孵育并增殖 A549 细胞，以开始本实验流程。向电子检测板 L8 的每个孵育孔中加入 150 微升细胞培养基。将该板置于生物安全柜中平衡 30 分钟。30 分钟后，手动将电子板 L8 插入置于 37 摄氏度 CO2 培养箱中的实时细胞分析仪内。接着，在计算机上启动实时细胞分析仪操作程序。在默认的实验模式设置页面中，选择实验模型，并为正在运行的检测命名。在其布局页面中，选择实验所包含的相应孔位，并在编辑框中输入细胞类型、数量和药物名称等信息。在其时间表页面中，添加实验步骤，然后选择每一步的运行时间以及实时数据采集的间隔时间。点击“开始”以测量培养基的背景阻抗。实验文件将被保存。所得数据将自动进行减法处理。在绘图页面中添加孔位后，将显示时间-细胞指数的曲线图。进行细胞增殖实验时，首先单击暂停按钮以暂停程序。然后取出电子板，在室温下每孔加入100微升A549细胞悬浮液。将板置于生物安全柜中静置30分钟，使细胞沉降到培养孔底部。手动将电子板插入实时细胞分析仪工作站，然后点击开始按钮以继续实验。在绘图页面，分析仪会在整个实验过程中持续记录细胞指数值或曲线。实验完成后，进入绘图页面并打开实验文件。然后选择所有经过检测的培养孔以及最终的细胞指数曲线，在加入药物或更换培养基前最后一次进行平均或归一化处理，以减少不同实验之间的差异。在数据分析页面，可计算 EC50 或 IC50 值。按照文本方案完成抗癌药物的细胞毒性评价后，从实时细胞分析仪工作站中取出含有细胞的电子培养板。将使用过的电子培养板置于室温下的无菌生物安全柜中，用移液器充分混匀培养基，然后用移液器吸除全部培养基。在室温下，用 200 微升去离子水冲洗电子板三次。将电子板上残留的细胞在 37 摄氏度的培养箱中用 0.25% 新鲜配制的胰蛋白酶消化一至两小时。消化完成后，在室温下的生物安全柜中，用移液器将培养液吹打混匀 5 至 10 次，然后移除溶液。用 200 微升去离子水冲洗电子板两次。然后用 200 微升 100% 乙醇洗涤两次，再用相同体积的 75% 乙醇洗涤两次。最后再用 200 微升去离子水冲洗两次。将电子芯片倒置在无菌纱布或滤纸上，于室温下沥干残留水分。随后将再生的电子芯片置于生物安全柜中，在室温下进行紫外线灭菌1至2小时。按照文本方案中所述使用介孔材料进行药物递送实验后，用胰蛋白酶消化残留细胞，操作方法同前。由于移液器在实验中经常使用，操作人员需注意避免划伤移液头和微芯片表面。在室温下的生物安全柜中，用200 µL去离子水冲洗微芯片一次。然后在室温下，用200 µL无水乙醇冲洗微芯片两次。接下来，在室温下用200微升75%乙醇冲洗微芯片一次。在每个孔中加入250微升75%乙醇，并在室温下用封板膜密封电子板。以114 ×g离心2分钟后，弃去液体。将电子芯片倒置在无菌纱布或纸巾上，于室温下倾倒剩余液体。重复用75%乙醇冲洗并离心。随后在生物安全柜中，于室温下对再生的电子芯片进行一至两小时的紫外灭菌。通过拆卸孵育孔的底部（如文本方案中所述），评估再生电子板表面的光学特性。为了评估A549细胞在新鲜和再生电子板上摄取抗癌药物后附着细胞的存活能力，使用共聚焦激光扫描显微镜监测细胞吸收的阿霉素（DOX）分子的自发荧光。记录细胞吸收的DOX自发荧光时，采用63倍油镜，并以485纳米为激发波长。接下来，通过以下步骤评估再生电极的电化学行为：首先使用抛光布上的抛光液将金电极和玻碳电极抛光至镜面状态。然后将电极在水中进行超声处理，以去除任何颗粒物。接着，在0.5摩尔的硫酸溶液中活化金电极。在含有1毫摩尔铁氰化钾的10毫摩尔氯化钾电解质溶液中，获取裸金电极和玻碳电极的电化学阻抗谱（EIS）数据。随后，将10微升细胞悬液滴加到GCE中金电极的表面。加入细胞后，将GCE中的金电极置于37摄氏度培养箱中孵育3小时，然后按照文本方案所述，获取经细胞修饰后电极的EIS数据。为了再生电极，将修饰有细胞的金电极浸入含0.25%胰蛋白酶的GCE中0.5至2小时。用纯水轻轻冲洗两个电极各四次。然后，用无水乙醇轻轻冲洗电极各四次。接下来，将金电极浸入75%乙醇中的GCE中约五分钟。五分钟后，用75%乙醇轻轻冲洗芯片四次，然后按照文本方案获取再生电极的EIS数据。为了评估阵列金电子板的再生效率，对新鲜和处理过的电子板均进行了显微观察。在微芯片表面的光学特性方面未发现明显的差异。利用阿霉素分子的荧光来评估细胞在金微芯片再生前后细胞的状态。相似的均一性以及清晰的细胞形态表明该芯片具有可重复使用性。再生方案用于细胞增殖的实际检测。从测试用电子芯片的多个培养孔中获得的生长曲线显示出良好的一致性，表明商用芯片成功实现了再生。此处展示的是，再生后的电子芯片L8被用于介孔二氧化硅材料的细胞毒性评估。与对照组相比，介孔材料处理样品的细胞指数下降，表明该材料具有轻微的细胞毒性。介孔材料进一步包封并释放抗癌药物阿霉素后，导致A549细胞的生长曲线显著下降。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。在进行该操作时，需要注意的是，不同芯片之间的台式水槽消化时间可能有所不同。完成该步骤后，可采用其他方法，如共聚焦激光扫描显微镜，甚至光谱学、电化学阻抗谱等，以回答更多问题，例如评估再生效应。

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