利用 CRISPR-Cas9 系统高效生成和编辑人胰细胞无饲养干细胞

本协议详细描述了在无饲养条件下从人类胰腺细胞中生成无足迹诱导多能干细胞 (干细胞), 其次是使用 CRISPR/Cas9 均一进行编辑和修饰单细胞克隆。

该程序的总体目标是在无饲养层条件下从人胰腺细胞生成无足迹的诱导多能干细胞或 IPSC，然后使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白编辑细胞，最后表征修饰的单细胞克隆。该方法可以帮助回答人类干细胞基因组编辑领域的关键问题，例如生成无足迹的 IPSC 和使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白进行编辑。该技术的主要优点是可以高可靠性生成编辑后的 IPSC 的克隆系，并且没有嵌合体的证据。

用冷胶原包被六孔板后，在第 2 天在 Prigrow III 培养基中对人原代胰腺细胞进行早期传代接种，以达到 5 个细胞的大约 2.5 x 10 或每孔至少 60% 的汇合度在转导当天或第 0 天。在转导当天，根据文本方案收获和计数细胞后，在冰上解冻一组仙台病毒载体管，并小心地将每管的计算体积添加到 1 mL 预热的 Prigrow III 培养基中。轻轻移液以混合溶液。

从细胞中吸出 Prigrow III，然后缓慢地将重编程病毒混合物添加到孔中。然后将细胞在 37 摄氏度的培养箱中孵育过夜。转导后 24 小时，小心丢弃细胞上的病毒混合物，并用新鲜的 Prigrow III 培养基替换。

第 6 天，向细胞中加入 1 mL 细胞分离溶液，并孵育 10 分钟。然后，使用含岩石抑制剂的 Prigrow III，将所有细胞接种在前一天制备的 MEF 培养皿上。将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜。

定期观察板是否出现细胞团块或集落，表明重编程细胞，这些细胞将形成具有鹅卵石形态和大细胞核和核仁的克隆聚集体。标记可能的 IPSC 菌落并定期检查它们的生长情况。在制备 24 孔 MEF 板后，转导后近 4 周，根据分析证书上的稀释因子等分制备基质膜。

挑选 24-48 个菌落，并将它们转移到基质膜包被的 24 孔板上，用 mTeSR1 完成。将板孵育 24 小时，并每天更换培养基。有关其他详细信息，请参阅文本协议。

加入 500 mcL 分散酶以分离铺在基质膜上的稳健菌落。孵育细胞 20 分钟后，再次将它们接种在基质膜包被的 12 孔板上。根据文本方案，使用碱性磷酸酶染色、免疫染色和 FACS 分析扩增和表征克隆。

为了在根据文本方案合成 SGRNA 后转染 HIPSC，通过在 22 mcL 反应体积中混合 0.5 mcg Cas9 蛋白和 0.5 mcg 每个 SGRNA 来为每个样品制备成核预混液。吸出含有岩石抑制剂的培养基后，使用 2 mL RTPBS 洗涤 ISPC 的每个孔。然后吸出 PBS 并加入 1 mL 细胞分离溶液。

将板在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。将细胞重悬于 3 mL mTeSR1 培养基中，并轻轻上下移液以产生单细胞悬液。将解离的细胞转移至含有 5 mL mTeSR1 培养基的 15 mL 离心管中。

向 Nucleofection 预混液中加入 16.4 mcL 的 P3 原代细胞补充剂和 3.6 mcL 来自 Nucleofector 试剂盒的补充剂 1。对细胞进行计数和离心后，将每个单位的 0.5 x 10 重悬于第 6 个细胞中，加入 22 mcL 先前制备的转染预混液中。将细胞快速转移到 Nucleocuvette 试纸条的一个孔的中心腔室中。

然后，将试纸条放入 Nucleofector 装置中，并使用程序 CB150 对细胞进行成核处理。核转染后，向核转染细胞的每个孔中快速加入 80 mcL 预热的 mTeSR1 培养基，其中含有 10 微摩尔岩石抑制剂。通过上下移液轻轻混合。

轻轻地将细胞从条带转移到基质膜预包被的 12 孔板的孔中，该板含有含岩石抑制剂的 mTeSR1 培养基。在制备 MEF 板后的第二天孵育时，在单细胞分选前至少两小时更换从补充有 1XSMC4 的 mTeSR1 到 mTeSR1 的 HIPSC 上的培养基。从 HIPSC 中吸出培养基，并使用 PBS 轻轻洗涤细胞。

然后向每个孔中加入 500 mcL 细胞分离溶液，并在 37 摄氏度下孵育细胞 10 分钟。通过向每个孔中加入 1 mL mTeSR1 并轻轻上下移液数次来生成单细胞悬液。将单个细胞分选到先前制备的 96 孔板的各个孔中。

分选后 4 天，菌落形成应该很明显。此时，用补充有 1X SMC4 的 HESC 培养基替换培养基。根据文本方案提取和扩增目标 DNA 后，根据制造商的说明，使用片段分析仪试剂盒通过凝胶染料混合物运行所有克隆的 PCR 扩增目标基因组区域。

根据文本协议确认多能 IPSC 克隆。在仙台病毒转导之前，胰腺细胞表现出典型的纺锤形形态。第 12 天时，MEF 上出现小的紧密集落，类似于人多能细胞集落。

通常，完全重编程的人 IPSC 集落具有非常清晰的边界，可以在 23 至 30 天被拾取。此处显示了第 23 天的解离菌落。这里展示的是仙台病毒对胰腺细胞进行重编程后，在无饲养层条件下采摘和培养后 IPSC 集落的典型相差图像。

碱性磷酸酶染色的红色 IPSC 集落位于右侧。IPSCs 通过多能性标志物 OCT4 和 NANOG 的免疫染色得到确认，如这些面板中所示。在本实验中，用细胞表面标志物对 IPSCs 进行染色，并对单细胞悬液进行 FACS 分析。

绿色峰代表胰腺 IPSC，紫色峰包含 IPSC 阴性细胞。在尝试此程序时，请务必记住保持无菌或无菌条件以进行细胞分选和细胞培养。按照此程序，可以执行其他方法，例如 IPSC 和 ESC 中的基因靶向，并且可以通过进行精确的基因修饰来回答其他问题。

观看本视频后，您应该对如何可靠地生成无足迹和无饲养层的 IPSC 以及进行双等位体基因组编辑有很好的了解。