Name: 利用 CRISPR-Cas9 系统高效生成和编辑人胰细胞无饲养干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白在无饲养层条件下编辑人胰腺细胞来源的无足迹诱导多能干细胞，并表征修饰后的单细胞克隆。该方法可高可靠性生成编辑后的iPSC克隆系，且无嵌合体证据。

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实验室工作得到了安贾莉·南达尔博士的博士后奖学金资助，以及马里兰干细胞研究基金向 BT（TEDCO）提供的探索性研究资助。

1. 重编程方案
<ol>
	<li>从人原代胰腺细胞生成人诱导多能干细胞（iPSC）
	<ol>
		<li>用1.5 mg/mL的冷胶原蛋白包被6孔板，并在37 °C下凝胶化1小时。</li>
		<li>在转导前第-2天，将早期传代的人原代胰腺细胞以约1 - 1.5 × 105个细胞接种于胶原蛋白包被的6孔板中，使用Prigrow III培养基，使转导当天（第0天）每孔细胞数达到约2.5 × 105个或汇合度至少为60%。首次实验时，至少接种2-3孔，以确保第0天有一孔达到理想汇合度。至少保留一孔作为对照用于细胞计数。</li>
		<li>在转导当天（第0天），将每孔所需的1 mL Prigrow III培养基在水浴中预热至37 °C。用1 mL含10%胎牛血清（FBS）的培养基重悬一孔对照细胞，加入1 mL胰蛋白酶/EDTA消化5分钟或直至细胞脱落，进行细胞计数。配制10% FBS培养基的方法：在DMEM中加入10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠和1%非必需氨基酸。</li>
		<li>使用细胞计数仪计数并检测细胞活力，根据细胞数量和病毒滴度计算每种病毒所需体积。对胰腺细胞使用以下感染复数（MOI）：KOS = 5，hc-Myc = 5，hKlf4 = 3。</li>
		<li>将一组保存于-80 °C的仙台病毒载体管置于冰上解冻，小心地将三种仙台病毒载体按计算体积加入1 mL已预热至37 °C的Prigrow III培养基中，轻轻吹打混匀。一个6孔板中的单孔足以用于仙台病毒载体转导以生成重编程细胞。</li>
		<li>吸除细胞中的Prigrow III培养基，缓慢加入重编程病毒混合液至含细胞的孔中。将细胞置于37 °C、5% CO2湿化培养箱中过夜培养。</li>
		<li>次日（转导后24小时），小心弃去病毒混合液，更换为新鲜Prigrow III培养基。继续培养5天，每隔一天更换一次培养基。</li>
		<li>第5天，在预先用0.1%明胶包被的10 cm培养皿中接种MEFs（1.3 × 106个细胞/皿）。在T175培养瓶中培养MEFs至第4天，然后在第5天接种前，用γ射线源对细胞进行6,000拉德照射13，或使用商业来源的MEFs。</li>
		<li>第6天，使用1 mL细胞解离液处理10分钟以解离转导后的细胞，将所有细胞接种至含ROCK抑制剂（5 mM母液，终浓度10 µM）的Prigrow III培养基中的MEF培养皿中，并在37 °C、5% CO2湿化培养箱中过夜培养。</li>
		<li>次日将Prigrow III培养基更换为hESC培养基。配制500 mL hESC培养基：加入DMEM/F-12、20%（v/v）无血清替代物（KOSR）、5 ng/mL bFGF、1 mM L-谷氨酰胺、100 µM非必需氨基酸和100 µM 2-巯基乙醇。此后每天轻柔更换培养基。</li>
		<li>定期观察培养皿，注意出现提示重编程细胞的细胞团或克隆。转化后的细胞形成具有铺路石样形态、大细胞核和明显核仁的克隆性聚集体。标记可能的“iPSC”克隆，并定期检查其生长情况。</li>
		<li>转导后约四周，当克隆已适合挑取或转移时，按此前方法接种1.3 × 106个细胞/明胶预包被皿，制备用于单克隆转移的24孔MEF培养板。
		<ol>
			<li>根据分析证书上的稀释因子分装基质膜（例如，Matrigel）。取一份加入25 mL DMEM/F-12中，用于包被四个6孔板（每孔1 mL），室温（RT）孵育至少1小时后使用。使用无菌移液枪头手动挑取12-24个克隆，吸出后转移至含500 µL hESC培养基的MEF培养板中。</li>
			<li>吸除孔中培养基，轻柔破坏或打散克隆。同时在基质膜包被的24孔板上挑取24-48个克隆。对于膜包被的培养板，使用mTeSR1培养基（添加10 µM ROCK抑制剂）培养24小时，并每日更换。挑取克隆后6-10天内，克隆即可转移至新的24孔和/或12孔&#160;膜包被培养板进行克隆扩增。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>如有需要，使用1 mg/mL胶原酶处理20分钟解离MEF上的克隆，用hESC/mTeSR1培养基洗涤两次，转移至&#160;膜包被的12孔或24孔板中。若步骤1.1.12中已有足够数量且状态良好的克隆在基质膜上生长，可按照制造商说明使用iPSC冻存培养基将MEF上的克隆冻存。</li>
		<li>使用500 µL分散酶处理20分钟，解离步骤1.1.12中接种于膜上的健康克隆，并再次接种至基质膜包被的12孔板中。手动刮除任何已分化的细胞或污染的MEF饲养层细胞，以富集膜上的多能性克隆。&#160;</li>
		<li>6-8天后，通过分散酶溶液解离，在&#160;膜包被的培养板上扩增克隆，并将小细胞聚集体接种至新鲜的&#160;膜包被的6孔或12孔板中。每日更换mTeSR1培养基。通过碱性磷酸酶染色、多能性标志物（OCT3/4和NANOG）免疫染色、多能性表面标志物的FACS分析以及分化实验对重编程克隆进行表征。除非特别注明使用其他包被溶液，所有实验（包括CRISPR编辑）均应在膜包被的培养板上进行培养和扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人iPSC的表征
	<ol>
		<li>碱性磷酸酶染色 
		注：此处使用商业试剂盒。参见材料表。
		<ol>
			<li>将疑似人iPSC接种于24孔板中，每日更换培养基，培养4-5天。</li>
			<li>开始染色程序时，吸除培养基，用1 mL含0.05% Tween 20的1× PBS（PBST）洗涤细胞一次。</li>
			<li>向细胞中加入0.5 mL试剂盒中的固定液，室温孵育2至5分钟。吸除固定液后，用PBST洗涤固定后的细胞。注意不要让孔干燥。</li>
			<li>通过混合溶液A、B和C，新鲜配制碱性磷酸酶底物溶液，每孔加入0.5 mL。将细胞置于避光环境（用铝箔包裹或放入暗盒）中室温孵育5至15分钟。 
			注：密切观察颜色变化，当颜色变得明亮时即终止反应，以避免非特异性染色。</li>
			<li>吸除碱性磷酸酶底物溶液，用2 mL 1× PBS洗涤孔两次以终止反应。</li>
			<li>在显微镜下观察克隆，并使用带相机的明场显微镜以4倍或10倍放大倍数拍摄图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>免疫染色
		<ol>
			<li>将人iPSC接种于24孔板中，每日更换培养基，培养4-5天。</li>
			<li>用PBS短暂洗涤细胞一次，随后用PBS中的4%多聚甲醛（PFA）固定20分钟。</li>
			<li>室温下用PBS洗涤三次，每次10分钟（3×10分钟）。</li>
			<li>用含10%正常山羊或驴血清（NS，根据二抗来源动物选择）的PBS在室温下封闭非特异性位点40分钟。若仅检测胞内表位，则在PBS中加入0.3% TX-100（TX/PBS）以实现通透。</li>
			<li>室温下用PBS洗涤三次，每次5分钟（3×5分钟）。</li>
			<li>将OCT4、NANOG、TUJ1、NKX2-5和SOX17抗体用新鲜配制的含5% NS的PBS稀释，在室温下孵育2小时或4 °C过夜。</li>
			<li>室温下用PBS洗涤三次，每次5分钟。</li>
			<li>将适当的Alexa Fluor 488或568二抗用含5% NS的PBS稀释，室温孵育1小时。</li>
			<li>室温下用PBS洗涤三次，每次5分钟。</li>
			<li>用含DAPI的PBS孵育10分钟，室温下洗涤两次，每次5分钟。使用荧光显微镜拍照。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>荧光激活细胞分选（FACS）
		<ol>
			<li>将人iPSC接种于6孔板中，每日更换mTeSR1培养基，培养至克隆汇合度达80%（每样本至少105个细胞）。</li>
			<li>实验当天，按上述方案分离细胞并解离为单细胞悬液。用含10% FBS的培养基洗涤。</li>
			<li>对于表面标志物检测，将细胞重悬于0.5-1 mL含10% FBS的培养基中，置于冰上。</li>
			<li>对于胞内标志物检测，将细胞重悬于1 mL含4% PFA的PBS中，室温孵育10分钟。用含10% FBS的培养基洗涤。再重悬于含0.1% TX的PBS中，冰上孵育15分钟。再次用含10% FBS的培养基洗涤。最后重悬于0.5-1 mL含10% FBS的培养基中，置于冰上。</li>
			<li>取50 µL细胞悬液加入含推荐量TRA-1-60、TRA-1-81或SSEA-4抗体的50 µL含10% FBS的培养基中，孵育30分钟至1小时。</li>
			<li>用含10% FBS的培养基洗涤两次。</li>
			<li>重悬于含荧光标记二抗的100 µL含10% FBS的培养基中，孵育30分钟。再次用含10% FBS的培养基洗涤两次，重悬于适当体积的含10% FBS的培养基中。可通过加入<1 µg/mL的碘化丙啶染料区分活细胞与死细胞，以评估过程中细胞凋亡情况。&#60;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>三胚层分化
		<ol>
			<li>在含10 µM ROCK抑制剂的mTeSR1培养基中，向两个6孔板中每孔接种1.5-2 × 106个iPSC。</li>
			<li>每日更换mTeSR1培养基，培养2-3天，直至孔内细胞汇合度达80-90%。</li>
			<li>对于外胚层诱导，在6孔板的2-3个孔中加入神经诱导培养基（NIM），具体操作按制造商说明进行。</li>
			<li>对于中胚层诱导，在板中2-3个孔中将培养基更换为含2% B27补充剂（不含胰岛素）和12 µM CHIR99021的RPMI培养基14。接下来24小时仅使用含2% B27补充剂（不含胰岛素）的RPMI培养基。再接下来24小时，在含2% B27补充剂（不含胰岛素）的RPMI培养基中加入5 µM IWP4。72小时后，更换为含2% B27补充剂的RPMI培养基，2-3天内可观察到跳动的心肌细胞。</li>
			<li>对于内胚层诱导，将6孔板中部分孔的培养基更换为MCDB 131培养基，并补充1.5 g/L碳酸氢钠、1× Glutamax、10 mM葡萄糖、0.5% BSA、100 ng/mL GDF8和5 µM CHIR99021，培养24小时。随后在不含CHIR99021的相同培养基中继续培养2-3天15。</li>
			<li>对所有三个胚层均按照步骤2的免疫染色方案进行操作，并检测相关标志物的表达。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 利用 CRISPR-Cas9 对人类iPSC进行基因组编辑
<ol>
	<li>Cas9蛋白与sgRNA的制备
	<ol>
		<li>在无菌条件下将Cas9蛋白分装至微量离心管中，并将分装样品于-80 °C冷冻保存。</li>
		<li>根据麻省理工学院提供的软件（http://www.genome-engineering.org/crispr/）或其他CRISPR向导RNA设计工具，为每个基因设计两条靶向引导RNA。为实现基因敲除，应靶向基因的第一或第二外显子（基于开放阅读框）。选择两条切割位点相近（相距约30–100 bp）的向导RNA，以便使用同一对筛选引物清晰观察到缺失片段。从软件输出结果中选择质量评分较高且脱靶位点较少的向导RNA。使用Primer-Blast程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计筛选引物。筛选引物应距离Cas9切割位点至少100 bp，PCR产物大小最好在400–700 bp之间，以利于PCR扩增。</li>
		<li>设计两条互补的sgRNA寡核苷酸DNA（长度为19–22个核苷酸，取决于向导序列），并在每条末端包含BsaI酶切位点。这些寡核苷酸DNA可由商业公司合成并退火形成双链DNA。退火反应体系为：各取1 µL 100 µM的向导RNA，加入25 µL退火缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5–8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）和23 µL水。将反应体系置于PCR仪中，程序设置为95 °C孵育2分钟，随后在45分钟内逐步降温至25 °C。</li>
		<li>将2 µL退火产物克隆至经BsaI限制性内切酶消化的1 µL实验室自备T7启动子pCR2.1载体（含Cas9结合位点）中，使用T4 DNA连接酶，操作按照制造商说明书进行。</li>
		<li>对克隆的DNA片段进行测序，确认序列正确后，使用T7体外转录试剂盒对阳性克隆进行in vitro转录，生成单导向RNA。使用商业化试剂盒纯化sgRNA，并用无RNase水洗脱。检测RNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hiPSCs的转染
	<ol>
		<li>按照前述方法，将hiPSCs在mTeSR1培养基中培养至细胞融合度为40–50%。</li>
		<li>在核转染前2小时，更换培养基为含有10 µM ROCK抑制剂的2 mL预温mTeSR1培养基。</li>
		<li>一小时后，准备核转染细胞的目的孔：从12孔板中吸出上述制备的&#160;膜上培养基，更换为含10 µM ROCK抑制剂的1 mL预温mTeSR1培养基，置于37 °C孵育。</li>
		<li>按样本数量适当放大比例，为每个样本配制核转染主混合液：每22 µL反应体系中加入16.4 µL P3原代细胞添加剂、3.6 µL核转染试剂盒中的补充剂1、0.5 µg Cas9蛋白以及每种sgRNA各0.5 µg。同时，按照制造商推荐条件将pMAX GFP质粒共转染入细胞，以粗略评估iPSC转染效率。</li>
		<li>吸除含ROCK抑制剂的培养基后，用2 mL室温PBS洗涤每个孔。随后吸除PBS，每孔加入1 mL细胞解离液，于37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>用3 mL mTeSR1培养基重悬细胞，轻柔吹打数次以获得单细胞悬液。将解离后的细胞转移至含5 mL mTeSR1培养基的15 mL离心管中。</li>
		<li>使用细胞计数仪计数细胞，并计算每转染样本所需总体积，以达到0.5 × 106 个细胞/转染。将所需数量的细胞置于15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
		<li>将每份0.5 × 106个细胞重悬于22 µL步骤4中配制的转染主混合液中。迅速将细胞转移至核转染杯条带的一个孔中央腔室中，将条带插入核转染仪，使用CB150程序进行核转染。</li>
		<li>核转染后，立即向每个核转染孔中加入80 µL含10 µM ROCK抑制剂的预温mTeSR1培养基，轻柔吹打混匀。</li>
		<li>将细胞从核转染条带中轻柔转移至步骤3中准备的、已预涂膜并含有含ROCK抑制剂mTeSR1培养基的12孔板孔中&#160;。</li>
		<li>转染后第1天，更换为新鲜mTeSR1培养基（不含ROCK抑制剂）。在核转染后2–3天收集细胞，用于单细胞分选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>靶向hiPSCs的单细胞分离
	<ol>
		<li>分选前一天，通过在明胶包被的培养板中接种2 × 106个细胞/板（使用含10% FBS的培养基）制备96孔MEF饲养层板。核转染后约有70–80%的克隆能够存活，每个基因编辑实验可准备2–3块MEF板。</li>
		<li>过夜孵育后，更换培养基为hESC培养基（如前所述），并补充100 ng/mL bFGF、1× SMC4（添加至培养基中以增强单细胞存活率）和5 mg/mL纤连蛋白，以促进细胞贴壁。</li>
		<li>将12孔板中hiPSCs的培养基由mTeSR1更换为添加1× SMC4的mTeSR1培养基，至少孵育2小时后再进行单细胞分选。</li>
		<li>吸除hiPSCs培养基，用PBS轻柔洗涤细胞。吸除PBS后，每孔加入500 µL细胞解离液，于37 °C孵育10分钟。每孔加入1 mL未添加成分的mTeSR1培养基，轻柔吹打数次，形成单细胞悬液。</li>
		<li>将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，用1 mL mTeSR1培养基重悬细胞。</li>
		<li>在无菌条件下使用配备100 µm喷嘴的流式细胞分选仪，将细胞以每孔一个细胞的方式分选至步骤1中准备的96孔板各孔中。</li>
		<li>分选后第4天应可见克隆形成；此时将培养基更换为添加1× SMC4的hESC培养基。</li>
		<li>分选后第8天，更换为hESC培养基，继续培养2天。</li>
		<li>使用1 mg/mL胶原酶消化20分钟以解离克隆，并将其转移至含ROCK抑制剂的mTeSR1培养基中的24孔膜包被板中。让单细胞克隆生长扩增后，提取其基因组DNA。使用基因特异性引物通过PCR扩增目标DNA片段。</li>
		<li>使用片段分析试剂盒，按照制造商说明将所有克隆的PCR扩增产物在凝胶/染料混合物中电泳，进行目标基因组区域的初步筛选。在PROSize软件中将所得片段大小与同步运行的DNA标准品比较，估算片段长度。对预期“已编辑”克隆进行测序，并分析测序数据以确认编辑或缺失事件。</li>
		<li>为区分单等位基因和双等位基因编辑克隆，对编辑序列进行PCR扩增后克隆至pJET1.2载体中。送测至少8–10个克隆，通过序列分析确认编辑发生在单个或两个等位基因上。</li>
		<li>在通过基因分型鉴定出成功靶向的iPSC克隆后，需进一步检测以确认这些克隆未丧失多能性，也未在此过程中获得染色体异常。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
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BT 是 RenOVAte Biosciences 公司的创始成员。

将人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）极大地推动了基础生物学研究、个性化医学、疾病建模、药物开发和再生医学等领域的发展16。目前许多广泛应用的人类iPSC生成方法依赖于病毒载体，存在整合到宿主基因组的风险，或使用附加体型载体，但重编程效率较低。本文介绍一种利用仙台病毒从人类胰腺细胞高效生成无饲养层iPSC的方法，可实现无“足迹”且高效的重编程。所获得的人类iPSC不含病毒转基因，维持多能性，并避免使用未知的外源因子。在无饲养层条件下生成iPSC时重编程效率较低，因此我们先在饲养细胞上对原代胰腺细胞进行重编程，随后将形成的克隆转移至无饲养层&#160;膜上进行扩增、培养和鉴定。该技术的结合实现了稳定、可靠且更高效的iPSC重编程。
我们还利用该方法从人成纤维细胞及其他原代细胞生成了诱导多能干细胞（iPSCs），这表明仙台病毒可用于重编程多种类型的细胞。重要注意事项包括：待重编程的原代细胞需达到最佳汇合度，&#160;细胞数量过少或过多均会影响重编程效率；应使用处于最佳增殖状态的早期传代原代细胞；谨慎滴定病毒载体，以实现最低程度...

通过过表达重编程因子将人类体细胞重编程为多能状态，已在疾病建模、再生医学和药物开发等领域彻底改变了干细胞研究。目前已有多种非病毒性重编程方法可用于递送重编程因子并生成诱导多能干细胞（iPSCs），但该过程劳动强度大且效率较低1。病毒性方法虽然效率较高，但存在病毒整合和致瘤性的风险2,3,4。在本研究中，我们报道使用细胞质内的仙台病毒递送重编程因子，建立无基因组整合痕迹的诱导多能干细胞系，其基因组中不含有任何病毒载体序列5。仙台病毒是一种RNA病毒，在感染后约经过10代传代即可从细胞质中被稀释清除，同时能高效表达重编程因子，从而实现快速而高效的重编程6,7。所建立的诱导多能干细胞可轻松转换至无饲养层培养基&#160;，以避免使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层细胞8。
本文除了概述仙台病毒介导的重编程方法外，还描述了一种改进的诱导多能干细胞（iPSC）编辑方案，该方案有望为研究提供具有特定基因修饰的无限量人类细胞。我们采用CRISPR/Cas9技术对iPSC进行基因修饰，该技术目前已被广泛应用于多种领域，包括基因敲入和敲除、大规模基因组删除、基因发现的文库筛选、多种模式生物的遗传改造以及基因治疗9,10,11。该技术涉及由酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）来源的Cas9核酸酶与20个核苷酸长度的向导RNA形成复合物，通过与原间隔序列相邻基序（PAM）3'端附近的基因组靶序列进行碱基配对，实现靶点识别。Cas9核酸酶在PAM位点上游约3个核苷酸处诱导产生双链断裂，随后主要通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复，导致开放阅读框中发生插入或缺失，从而实现基因的功能性敲除12。
我们改进的实验方案包含了人胰腺细胞的培养细节，以及在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上进行重编程以提高重编程效率的方法，随后将细胞适应于无饲养层的Matrigel培养体系，对建立的诱导多能干细胞（iPSCs）进行表征，设计并制备CRISPR引导RNA，以核糖核蛋白（RNP）复合物形式递送至iPSCs中，通过单细胞分选获得基因编辑iPSC的克隆系，简便地筛选和鉴定基因编辑事件，并对单细胞克隆进行表征。本研究中，通过导入Cas9蛋白和两个CRISPR sgRNA RNP复合物，诱导产生双链断裂（DSBs），从而高效地实现了基因组片段的删除。该方法利用两个向导RNA靶向开放阅读框区域以生成缺失，依赖非同源末端连接（NHEJ）的高效率，从而显著减少需要表征的克隆数量，并可通过自动化毛细管电泳仪（fragment analyzer）对克隆进行快速的初步筛选。这些高效的基因组编辑方法将人干细胞疾病模型的构建推进为干细胞实验室中的标准和常规操作。最终，精确的基因组编辑将使研究超越干细胞疾病建模的范畴，并有望推动细胞治疗的发展。

<table><tbody><tr><td>仙台病毒载体 - CytoTune-iPS 2.0 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>冰上解冻；货号：1</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0.05%，100 ml；货号：2</td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 (Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>使用 10 &amp;mu;M；货号：3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>货号：4</td></tr><tr><td>血清替代物 (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>货号：5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X；货号：6</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>分装；货号：7</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (Glutamax, 100X)，液体</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100；货号：8</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100；货号：9</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM，1/1,000；货号：10</td></tr><tr><td>Hausser 血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>货号：11</td></tr><tr><td>0.1% 明胶溶液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>37&amp;ordm;C 孵育 1 小时；货号：12</td></tr><tr><td>SSEA-4 抗体</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100；货号：13</td></tr><tr><td>TRA-1-81 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>4745S</td><td>1/200；货号：14</td></tr><tr><td>OCT4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1,000；货号：15</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td>保持低温；货号：16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 荧光染料 488/568（二抗）</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2,000；货号：17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X；货号：18</td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>货号：20</td></tr><tr><td>96 孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>货号：21</td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>货号：22</td></tr><tr><td>解剖显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>货号：23</td></tr><tr><td>挑取操作罩</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>货号：24</td></tr><tr><td>15&amp;nbsp;ml 离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>货号：25</td></tr><tr><td>50&amp;nbsp;ml 离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>货号：26</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>货号：28</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>货号：29</td></tr><tr><td>Prigrow III 培养基</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>货号：31</td></tr><tr><td>Countess&amp;trade; 细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>货号：32</td></tr><tr><td>Faxitron X 射线系统</td><td>Faxitron</td><td>CellRad</td><td>货号：33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>货号：34</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>1 mg/ml 储存液；货号：35</td></tr><tr><td>分散酶</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>货号：36</td></tr><tr><td>适用于人胚胎干细胞的基质胶 (matrigel)</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>稀释时使用冷的 DMEM/F-12；货号：37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R &amp; D</td><td>233-FB</td><td>储存液 10 ug/ml；货号：38</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% 储存液（PBS 配制）；货号：39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21705</td><td>1/100；货号：40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100；货号：41</td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>货号：42</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶检测试剂盒</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>货号：43</td></tr><tr><td>Cas9 蛋白</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>解冻后分装；货号：44</td></tr><tr><td>山羊或驴血清</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>货号：45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>货号：46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>货号：47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>货号：48</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>货号：49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>货号：50</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>货号：51</td></tr><tr><td>Mega Shortscript T7 试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>货号：52</td></tr><tr><td>Mega Clear 试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>货号：53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>货号：54</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>货号：55</td></tr><tr><td>CloneJET 克隆试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>货号：56</td></tr><tr><td>Fragment analyzer&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Advanced Analytical</td><td></td><td>货号：57</td></tr><tr><td>mTeSR1 培养基试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>恢复至室温；货号：58</td></tr><tr><td>冻存培养基 mFreSR&amp;trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>货号：59</td></tr><tr><td>冻存培养基 CryoStor&amp;reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>货号：60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>货号：61</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>货号：62</td></tr><tr><td>人胰腺细胞</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>货号：63</td></tr><tr><td>STEMdiff&amp;trade; 神经诱导培养基</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5835</td><td>货号：64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>货号：65</td></tr><tr><td>2% B27-胰岛素</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>货号：66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>货号：67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>货号：68</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>货号：69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>货号：70</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761-100ML</td><td>货号：71</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>货号：72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>货号：73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>货号：74</td></tr><tr><td>TUJ1 抗体</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>货号：75</td></tr><tr><td>NKX2-5 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>货号：76</td></tr><tr><td>SOX17 抗体</td><td>R &amp; D systems</td><td>AF1924</td><td>货号：77</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>货号：78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-核转染仪&amp;trade;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>货号：79</td></tr><tr><td>FACSAria II（细胞分选仪）</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>货号：80</td></tr></tbody></table>

利用crispr-cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层ipscs

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

胚胎干细胞和诱导性多能干细胞具有自我更新能力，并可分化为机体多种细胞类型。因此，这类多能细胞在再生医学研究中备受关注，目前正用于眼科疾病、糖尿病、心脏病及其他疾病的临床试验。由于其具备向特化细胞类型分化的潜能，加之近年来基因组编辑技术（包括CRISPR/Cas系统）的进展，为定制化改造iPSC基因组以实现多种应用（如疾病建模、基因治疗以及调控分化通路等）提供了更多机遇。在现有的基因编辑技术中，源自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统已成为真核生物基因组位点特异性编辑的首选工具。CRISPR技术易于获取、成本低廉且在实现靶向编辑方面效率极高。该系统需要一种Cas9核酸酶以及一段20个核苷酸长度的向导序列，该序列需与基因组靶位点相邻并紧邻一个3个核苷酸的&#34;NGG&#34;原间隔序列邻近基序（PAM），以引导Cas9定位至目标基因组位点，同时还需要一段通用的Cas9结合骨架RNA（两者合称为单链向导RNA或sgRNA）。本文提供了一套高效生成无饲养层依赖且无痕迹残留的iPSC的逐步操作方案，并介绍了利用Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物对iPSC进行基因组编辑的方法。该基因组编辑方案高效可靠，可通过将针对多个靶点的sgRNA预先与Cas9蛋白形成复合物，并同时导入细胞，从而轻松实现多重编辑。最后，我们描述了一种简化的策略，用于鉴定和表征携带目标编辑的iPSC。综上所述，这些所概述的策略有望显著简化iPSC的制备与编辑流程，以支持其在多种应用场景中的广泛使用。

本文中，我们采用了一种简单而高效的方案，利用可整合或无整合足迹的仙台病毒载体，将人胰腺细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。图1A展示了该重编程方案的示意图。人胰腺细胞为商业购买，使用Prigrow III培养基进行培养，并按前述方法用仙台病毒进行转导。在第0天转导仙台病毒后，转导后的梭形胰腺细胞在约5天内未见任何形态学变化，随后逐渐变圆，细胞核和核仁增大。转导后约一周可见少量早期克隆，但未进行挑取，因为根据我们的经验，这些克隆容易迅速解离，通常属于“早期部分重编程细胞”，无法形成稳定的克隆。转导后约10至15天，出现小而明亮的克隆，并在生长后进行挑取（图1B，右上）。人iPSC克隆结构紧凑、细胞排列紧密、边缘清晰（被认为是“完全重编程细胞”）（图1B，第23天，中下）；而“部分重编程细胞”则结构松散，克隆内存在间隙（<str...

本方案详细描述了在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹诱导多能干细胞（iPSCs）的过程，随后利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白进行基因编辑，并对经修饰的单细胞克隆进行表征分析。

利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

胚胎干细胞和诱导性多能干细胞能够自我更新并分化为机体内的多种细胞类型。因此，这类多能细胞备受关注……

本实验的总体目标是在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹的诱导性多能干细胞（iPSCs），随后利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白对细胞进行基因编辑，最终对经过修饰的单细胞克隆进行表征。该方法有助于解答人类干细胞基因组编辑领域中的关键问题，例如无足迹iPSCs的生成以及利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白进行基因编辑。该技术的主要优势在于能够以高可靠性获得经过编辑的iPSC单克隆细胞系，且未发现嵌合现象。在六孔板中包被冷胶原蛋白后，于第2天将早期传代的人原代胰腺细胞以Prigrow III培养基接种，使转导当天（即第0天）每孔细胞数达到约2.5 × 10⁵个，或汇合度至少达到60%。在转导当天，根据文本方案收获细胞并进行计数后，将一套Sendai病毒载体管置于冰上解冻，并小心地将每管计算好的体积加入1 mL预温的Prigrow III培养基中。轻轻吹打混匀溶液。吸弃细胞中的Prigrow III培养基，缓慢向孔中加入重编程病毒混合液。随后将细胞置于37摄氏度培养箱中过夜培养。转导24小时后，小心弃去细胞上的病毒混合液，更换为新鲜的Prigrow III培养基。第6天，向细胞中加入1 mL细胞解离溶液，孵育10分钟。随后，使用含ROCK抑制剂的Prigrow III培养基，将所有细胞接种至前一天准备好的MEF饲养层培养皿中。将细胞在37摄氏度条件下过夜孵育。定期观察培养板，留意细胞团块或克隆的出现，这些是重编程细胞的标志，会形成具有铺路石样形态、大细胞核和明显核仁的克隆性集落。标记可能的诱导多能干细胞（iPSC）克隆，并定期检查其生长情况。在制备24孔MEF板并进行转导后约四周，根据分析证书上的稀释系数，分装基质膜试剂以制备基质膜。挑取24-48个克隆，将其转移至涂有基质膜的24孔板中，并加入mTeSR1培养基。将培养板孵育24小时，每天更换培养基。更多细节请参见文本方案。向接种在基质膜上的健壮集落中加入 500 µL dispase 以使其脱离。细胞孵育 20 分钟后，再次接种于包被基质膜的 12 孔板中。根据文中方案，通过碱性磷酸酶染色、免疫染色和 FACS 分析对克隆进行扩增与鉴定。根据文本方案合成单向导RNA（SGRNA）后，对HIPSC进行转染时，每个样品按22 mcL反应体系配制核转染主混合液，其中包含0.5 mcg Cas9蛋白和0.5 mcg每种SGRNA。吸除含有ROCK抑制剂的培养基后，用2 mL RTPBS洗涤ISPCs的每个孔。随后吸除PBS，并加入1 mL细胞解离溶液。将培养板在37摄氏度下孵育10分钟。用3 mL mTeSR1培养基重悬细胞，并轻轻吹打数次以获得单细胞悬液。将解离的细胞转移至含有5 mL mTeSR1培养基的15 mL离心管中。向核转染预混液中加入 16.4 µL P3 原代细胞添加剂和 3.6 µL 核转染试剂盒中的添加剂一。计数并离心细胞后，将每份 0.5 × 10⁶ 个细胞重悬于 22 µL 前述制备的转染预混液中。迅速将细胞转移至 Nucleocuvette 条带中某一孔的中央腔室。然后，将细胞条带放入核转染仪中，使用程序 CB150 进行核转染。核转染后，迅速向每个含有转染细胞的孔中加入 80 µL 预热的、含 10 µM ROCK 抑制剂的 mTeSR1 培养基。用移液器轻轻吹打混匀。轻轻将细胞从条带上转移至含有 mTeSR1 培养基并添加 rock 抑制剂的基质膜预包被 12 孔板的孔中。在制备 MEF 培养板后的第二天，将 HIPSCs 的培养基从 mTeSR1 更换为补充了 1XSMC4 的 mTeSR1 培养基，孵育至少两小时，然后进行单细胞分选。吸除 HIPSCs 的培养基，并用 PBS 轻柔洗涤细胞。然后向每个孔中加入500 μL细胞解离溶液，于37摄氏度孵育10分钟。每孔加入1 mL mTeSR1，轻轻吹打数次以形成单细胞悬液。将单细胞分选至预先准备好的96孔板的各个孔中。分选后第4天，应可见克隆形成。此时，将培养基更换为添加了1X SMC4的HESC培养基。根据文本方案提取并扩增目标DNA后，使用片段分析试剂盒，按照生产商说明书，将所有克隆的PCR扩增目标基因组区域通过含凝胶染料的混合液进行电泳分析。根据文本方案确认多能性诱导多能干细胞（iPSC）克隆。在仙台病毒转导前，胰腺细胞呈现典型的梭形形态。转导后第12天，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上出现细小、致密的克隆，形态类似于人类多能性细胞克隆。通常情况下，完全重编程的人类诱导性多能干细胞（iPSC）集落具有非常清晰的边界，可在第23至30天进行挑选。此处展示的是第23天的一个已解离的集落。图中显示的是胰腺细胞经仙台病毒重编程后，在无饲养层条件下挑取并培养的iPSC集落的典型相差图像。右侧为碱性磷酸酶染色呈红色的iPSC克隆。通过本组图中所示的多能性标志物OCT4和NANOG免疫染色结果，确认了iPSC的身份。在本实验中，iPSC经细胞表面标志物染色后，对单细胞悬液进行流式细胞术分析。绿色峰代表胰腺来源的诱导性多能干细胞（IPSCs），紫色峰包含IPSC阴性细胞。在进行此操作时，必须始终注意保持细胞分选和细胞培养过程中的无菌条件。完成此操作后，可进一步开展其他方法，如在IPSCs和胚胎干细胞（ESCs）中进行基因靶向操作，并可通过精确的遗传修饰来回答更多科学问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何可靠地生成无足迹且无饲养层的诱导多能干细胞，并实现基因组的双等位基因编辑。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

利用 CRISPR-Cas9 系统高效生成和编辑人胰细胞无饲养干细胞

基因组编辑工具（如CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统）显著提高了在人诱导性多能干细胞（hiPSCs）中进行基因靶向的效率。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性hiPSC报告细胞系的实验方案。...

利用CRISPR/Cas9与Cas9双切口酶系统高效构建hiPSC神经谱系特异性敲入报告细胞系

人类多能干细胞（hPSCs）的基因组编辑可以快速高效地完成。本文展示了一种可靠的实验方案，以编辑AAVS1安全港位点以表达EGFP并引入抗生素抗性为例，对hPSCs进行基因工程改造。...

基因编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。...

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9技术在人诱导性多能干细胞中对内源性表达的蛋白质进行荧光标记的实验方案。通过荧光激活细胞分选富集可能经过编辑的细胞，并建立单克隆细胞系。...

利用CRISPR/Cas9在人类诱导多能干细胞中进行内源性蛋白标记

本文介绍了一种利用电穿孔管对哺乳动物细胞进行高效CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的基因编辑的实验方案。...

通过电穿孔转染CRISPR/Cas9核糖核蛋白实现精确基因编辑

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

学习利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白在无饲养层条件下编辑人胰腺细胞来源的无足迹诱导多能干细胞，并表征修饰后的单细胞克隆。该方法可高可靠性生成编辑后的iPSC克隆系，且无嵌合体证据。

利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

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