改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型
2017年9月24日
本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。
本实验方案的总体目标是纯化和分离原代猪脑微血管内皮细胞，以建立一个紧密的体外血脑屏障模型。该方法有助于回答血脑屏障研究领域中的关键问题，例如药物递送、通透性、受体转运以及血脑屏障的紧密性和极性。该模型的主要优势在于能够获得大量原代脑内皮细胞，可用于构建具有高跨内皮电阻（TEER）和低通透性的体外血脑屏障模型。开始操作时，将脑组织置于无菌超净工作台中，用放置于冰上的烧杯内含1升PBS轻柔冲洗脑组织。
接下来，使用精细尖头镊子小心地去除每个脑组织的脑膜。用手术刀逐个刮取脑组织的灰质，并将分离出的组织转移至含有20毫升置于冰上的DMEM/F-12的培养皿中。进行初步剪切时，将灰质组织通过一个50毫升无针头的注射器推挤。
对所有脑组织重复上述步骤，并将收集的灰质材料合并在一起。用DMEM/F-12培养基将分离的灰质材料转移至手持式组织匀浆器的研磨管中。先用松配合的研杵上下移动8次进行匀浆，随后用紧配合的研杵上下移动8次，完成组织匀浆。
接下来，使用带有滤器支架和140微米滤网的500毫升蓝色瓶盖瓶过滤匀浆，以分离毛细血管。将含有毛细血管的滤膜放入含有消化液的培养皿中。随后，将培养皿置于37摄氏度、180转/分钟的摇床中孵育1小时，或每隔10分钟轻轻搅拌一次。
一小时后，用培养皿中的悬液将毛细血管从滤器上冲洗下来。随后，将三个培养皿中的悬液分装至两个50毫升离心管中，并向每管加入10毫升DMEM/F-12以终止消化。在4°C条件下，以250 × g离心细胞悬液5分钟。
随后，吸除上清液，并将每份沉淀重悬于 10 毫升 DMEM/F-12 中。然后，向每支试管中再加入 20 毫升 DMEM/F-12。为了优化肺支气管上皮细胞（PBECs）的贴壁条件，向 T-75 培养瓶中加入包被液，使最终胶原蛋白 IV 的浓度为 150 微克/毫升，纤连蛋白的浓度为 50 微克/毫升，用蒸馏水配制，确保溶液覆盖整个培养表面。
接下来，将毛细血管在37摄氏度水浴中解冻。为去除冻存液，于4摄氏度下以250 × g离心7分钟，使毛细血管沉淀。随后，小心吸除上清液，并将沉淀物重悬于1至2毫升的10毫升分装液中。
随后，将毛细管悬液转移至包被的T-75培养瓶中，轻轻倾斜培养瓶以确保液体在表面均匀分布。将T-75培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中。过夜培养后，为一个T-75培养瓶准备10毫升PBEC生长培养基，添加终浓度为4微克/毫升的嘌呤霉素，并进行换液。
然后，通过用浓度为每毫升500微克的IV型胶原和每毫升100微克的纤连蛋白包被可渗透膜插件，为脑微血管内皮细胞（PBEC）接种做准备，并用蒸馏水处理。向T-75培养瓶中加入2毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5至7分钟，以进行细胞消化。为使脑微血管内皮细胞脱落，轻轻用指尖敲击T-75培养瓶的侧面。
随后，将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在4°C条件下以250 × g离心7分钟，沉淀脑微血管内皮细胞。之后，小心吸除上清液，并用1毫升培养基重悬细胞沉淀。然后，再加入2毫升培养基，使总体积达到3毫升。
使用细胞计数板或自动细胞计数系统手动计数细胞数量。对于非接触共培养，将小室插入前一天已更换星形胶质细胞生长培养基的含星形胶质细胞的孔中。次日，更换含有脑微血管内皮细胞（PBECs）的可渗透膜小室中的培养基。
然后，小心吸出孔中的培养基，并向每孔加入 750 微升分化培养基。接着，小心吸出插入式培养小室中的培养基，每孔插入式培养小室加入 500 微升分化培养基。随后，向每孔星形胶质细胞培养孔中加入剩余的 750 微升分化培养基。
随后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用分化培养基孵育至次日。在使用分化培养基刺激细胞后的第二天，通过用双蒸水冲洗测量室两次，再用70%乙醇冲洗一次（5分钟），最后再用双蒸水冲洗两次，来准备用于TEER测量的组织电阻测量室系统。接下来，将测量室连接至系统，向组织电阻测量室中加入4 mL DMEM/F-12培养基，并在室温下静置约30分钟。
随后，通过将插入物小心地放入组织电阻测量室中进行TEER测量。以下是五天内观察到的PBEC、培养物和星形胶质细胞的相差显微镜图像。初始培养第一天的纯化毛细血管片段显示同时存在毛细血管和污染细胞；在第二天换液并继续培养一天后，PBEC被逐步筛选出来，并开始从毛细血管片段处生长。
通常在第4至第6天达到融合的PBEC单层，此时PBEC呈现纺锤形形态并呈纵向排列。接种于底部小室的大鼠星形胶质细胞通常在5天内增殖形成融合层，并在生长两周后用于非接触共培养模型。一旦掌握该技术，可在7小时内完成操作。
该技术建立后，为研究人员探索紧密且极化的脑血管内皮细胞中的药物递送和受体转运提供了新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建一种体外血脑屏障模型，用于开展无法在体内进行的新研究。
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概述
本方案概述了一种利用原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）建立体外血脑屏障（BBB）模型的优化方法。该模型具有高度的可重复性和紧密性，适用于药物发现研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 药理学
背景
- 血脑屏障对于保护大脑免受有害物质侵害至关重要。
- 了解药物在血脑屏障（BBB）中的递送和通透性对治疗药物的开发至关重要。
- 原代猪脑微血管内皮细胞为研究血脑屏障特性提供了相关的模型。
- 高跨内皮电阻（TEER）表明形成了紧密的屏障。
研究目的
- 纯化并分离原代猪脑微血管内皮细胞。
- 建立可靠的体外血脑屏障模型。
- 研究药物递送机制及受体转运过程。
使用的方法
- 用 PBS 清洗脑组织并去除脑膜。
- 分离灰质并在 DMEM/F-12 中进行处理。
- 使用注射器实现初步破碎。
- 通过 TEER 和通透性评估模型。
主要结果
- 该方案可获得大量具有活性的原代脑微血管内皮细胞。
- 建立的血脑屏障模型表现出较高的跨内皮电阻（TEER）值。
- 观察到低通透性，表明形成了紧密的屏障。
- 该模型适用于药物转运和跨膜运输的研究。
结论
- 该优化方案为血脑屏障建模提供了可靠的实验方法。
- 该模型可促进药物递送及血脑屏障动态研究领域的研究进展。
- 高重复性使其成为未来研究中极具价值的工具。
常见问题
行业重要性概述
建立具有生理相关性的体外血脑屏障模型，对于通过早期预测药物入脑能力和靶点结合情况来降低中枢神经系统药物研发风险至关重要。该模型基于猪脑微血管内皮细胞，具有高跨内皮电阻和低细胞旁通透性的特点，可实现对化合物转运及受体运输的定量评估。其良好的可重复性有助于在先导化合物优化阶段做出推进或终止的决策，从而减少因脑内暴露不足导致的后期研发失败。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可验证关于中枢神经系统靶点可及性及作用机制的治疗假设。
- 操作价值：提供可再生的原代猪脑微血管内皮细胞来源，用于稳定的靶点验证实验。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供定量的因变量测量值（TEER、Lucifer Yellow 通透性），用于实验标准化和阳性结果确认。
- 操作价值：支持可扩展且可重复的化合物筛选实验，并设定明确的屏障紧密度阈值。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过模拟人源血脑屏障特性，用于临床前疗效和安全性评估，与疾病相关系统相契合。
- 操作价值：提供可预测体内结果的转运和运输数据，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期靶点验证到先导化合物筛选直至临床前研究的整个发现过程，为评估中枢神经系统药物特性提供了一个可重复使用的平台。
- Discovery Biology：通过可量化的通透性输出，支持对血脑屏障穿透能力和靶点结合的假设验证。
- Screening：通过标准化、高产量的细胞分离和可重复的屏障形成，实现检测就绪，用于化合物评价。
- Analytics：生成跨内皮电阻和荧光示踪剂通透性读数，实现对不同化合物条件的定量比较。
- Translational Research：通过模拟与物种相关的屏障特性，连接临床前研究连续性，为剂量预测和安全范围提供依据。
- Enterprise Reuse：建立标准化、可扩展的能力，可在多个项目中重复使用，减少重复的模型开发。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低脑暴露机制的不确定性，提高中枢神经系统药物递送的预测可信度。
- 操作价值：通过明确的分离、培养和分化方案，实现标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：改善决策流程（推进或终止项目），提升资金使用效率，并降低因脑部渗透不足导致的后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于定量的转运和转运特征，支持经风险调整的优先排序及推进决策。
实施注意事项
- 需要具备原代细胞分离、组织培养和屏障功能检测技术方面的专业知识。
- 依赖于灌注系统、跨上皮电阻（TEER）测量室以及荧光检测仪器。
- 需要在不同团队间对细胞传代、分化因子处理以及检测读数方案进行标准化。
- 在扩展至疾病模型或与小胶质细胞、周细胞共培养时，需考虑方法的适应性调整。
- 受限于原代细胞的有限寿命以及猪源组织获取的变异性，如方案中所述。
