Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

该方案的总体目标是研究人角膜基质细胞和天然细胞外基质中的神经元细胞之间的细胞相互作用。该方案可以扩展到研究角膜疾病和营养不良，例如圆锥角膜、糖尿病性角膜病和 Fuchs 营养不良。这种方法可以通过确定特定角膜疾病或营养不良期间基质神经相互作用的潜在机制和缺陷，帮助回答人类角膜生物学领域的关键问题。

该技术的主要优点是允许细胞在体外分泌自己的细胞外基质，从而为体内实际人类角膜组织提供更好、更准确的模型。该技术的意义延伸到角膜疾病的治疗，因为细胞间和细胞外基质相互作用的评估将确保角膜组织的准确表示，并允许更有针对性的药物开发。现在，这种方法可以提供对角膜神经损伤和再生的见解。

它也可以应用于其他系统，例如药物筛选和开发。收到人角膜组织样本后，将组织转移到一个 21.5 平方厘米的培养皿中，其中装有 2 毫升无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水。将角膜圆顶面朝上放置，并使用剃须刀片以 45 度角刮掉上皮层。

接下来，将角膜圆顶面朝下翻转，从基质上彻底刮掉内皮。用 DPBS 洗涤基质组织。用 DPBS 保持基质块湿润，并使用 10 号手术刀片将基质组织切成小块。

使用无菌镊子将基质块转移到没有培养基的 T25 培养瓶中。让外植体在 37 摄氏度下粘附在培养瓶底部约 30 至 40 分钟。精确切割基质组织后，小心地将培养瓶转移到培养箱中。

等待 30 到 40 分钟，然后慢慢添加媒体。此步骤对于允许外植体完全粘附并防止其分离至关重要。粘附后，向培养瓶中缓慢添加含有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素-抗真菌剂的 Eagle 最低必需培养基，而不会干扰外植体。

将培养瓶轻轻放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中。保持外植体不受干扰，直到细胞开始在培养瓶中分离和迁移。大约 2 到 4 周后，细胞应达到 100% 汇合。

100% 汇合后，通过去除组织培养基并用 DPBS 洗涤细胞来传代细胞。向细胞中加入胰蛋白酶，然后在 37 摄氏度下孵育。大约 5 分钟后，在光学显微镜下观察细胞以确认它们已分离。

通过添加新鲜培养基停止蛋白水解，并将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。以 1000 x g 离心管以沉淀细胞。小心去除上清液，不要干扰沉淀，并将细胞悬浮在新鲜培养基中。

进行细胞计数后，将大约 1 乘以 10 的比例接种到 T75 培养瓶中的六个细胞中，并加入新鲜培养基以进一步扩增。要组装 3D 构建体，首先传代并计数人角膜成纤维细胞，然后将大约 10 乘以 10 到 6 个 HCF 接种到具有 0.4 微米孔的聚碳酸酯膜插入物上。在构建体的顶部添加 1.5 毫升新鲜培养基。

然后将另外 1.5 毫升相同的培养基移液到每个构建体的底部。24 小时后，在每个构建体的顶部和底部添加 1.5 毫升培养基，补充 0.5 毫摩尔维生素 C。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育三周，每隔一天添加一次含有维生素 C 的新鲜培养基。

这将刺激细胞分泌和组装自己的细胞外基质。三周后，将 8 乘以 10 添加到先前组装的 3D 构建体顶部的第三个 SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞中。在此步骤中计算准确的细胞数量至关重要，并在开始细胞分化前留出 24 小时。

孵育 24 小时后，用 1.5 毫升含 10% FBS 和 10 微摩尔视黄酸的 EMEM 刺激细胞，启动 SH-SY5Y 细胞分化。然后将 1.5 毫升含有维生素 C 的培养基添加到构建体的底部。视黄酸对光敏感，因此此步骤应在黑暗中进行。

五天后，当细胞达到分化期时，在构建体顶部加入 1.5 毫升含有 2 纳摩尔 BDNF 和 1% 抗生素抗真菌剂的无血清培养基。将新鲜的补充维生素 C 的培养基添加到构建体的底部。在处理前将细胞再培养两天以进行进一步分析。

这是 3D 自组装结构的高倍率透射电子显微镜图像，显示了聚碳酸酯膜和位于顶部的角膜基质细胞。该图像显示了位于顶部的分化神经元细胞，它们表现出基质-神经元细胞排列。图像中的箭头显示了神经元细胞。

在尝试此程序时，重要的是要记住在切割外植体时始终保持角膜组织湿润，并保持手术器械和刀片无菌。观看此视频后，您应该对如何设置和使用此体外模型来研究人角膜基质细胞和天然细胞外基质中的神经元细胞之间的细胞相互作用有很好的了解。不要忘记，使用 BDNF、视黄酸和手术刀片可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着合适的防护服。