角膜组织工程：一种 体外 人角膜基质-神经相互作用模型

本方案的总体目标是研究人角膜基质细胞与神经元细胞在其天然细胞外基质中的细胞间相互作用。该方案可进一步拓展用于研究角膜疾病和角膜营养不良，例如圆锥角膜、糖尿病性角膜病变和福克斯营养不良。通过识别特定角膜疾病或营养不良过程中基质与神经相互作用的潜在机制和缺陷，该方法有助于解答人角膜生物学领域中的关键科学问题。

该技术的主要优势在于，允许细胞在体外分泌自身的细胞外基质，从而提供一种比传统方法更优且更准确的人角膜组织体内模型。该技术的应用前景涵盖角膜疾病的治疗，因为对细胞间以及细胞与细胞外基质相互作用的评估，将确保角膜组织的精确模拟，并有助于实现更精准的药物研发。目前，该方法还可为角膜神经损伤与再生研究提供重要见解。

它还可应用于其他系统，例如药物筛选与开发。收到人角膜组织样本后，将组织转移至含有两毫升无菌杜氏磷酸盐缓冲液的21.5平方厘米培养皿中。将角膜隆起面朝上放置，并以45度角使用剃刀刀片刮除上皮层。

接下来，将角膜圆顶面朝下翻转，彻底刮除基质层上的内皮细胞。用DPBS清洗基质组织。保持基质组织块处于湿润状态，并使用10号手术刀片将基质组织切成小块。

使用无菌镊子将间质组织块转移至不含培养基的 T25 培养瓶中。将外植块置于 37 摄氏度环境下，使其贴附于培养瓶底部，持续约 30 至 40 分钟。在精确切割间质组织后，小心将培养瓶转移至培养箱中。

需要静置 30 至 40 分钟，然后缓慢加入培养基。此步骤至关重要，以确保组织块完全贴壁，并防止其脱落。组织块贴壁后，缓慢向培养瓶中加入含有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素-抗真菌剂的 Eagle's 最低必需培养基，注意不要扰动组织块。

将锥形瓶轻轻放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。保持组织块不受干扰，直至细胞开始从组织块中分离并迁移到锥形瓶中。大约经过两到四周后，细胞应达到100%汇合度。

当细胞达到100%融合时，移除培养基，用DPBS洗涤细胞，进行传代。向细胞中加入胰蛋白酶，于37摄氏度孵育。约五分钟后，在光学显微镜下观察细胞，以确认其已脱落。

通过加入新鲜培养基终止蛋白水解，并将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。在1000 × g离心，使细胞沉淀。小心移除上清液，避免扰动沉淀，然后将细胞重悬于新鲜培养基中。

细胞计数后，将约1×10⁶个细胞接种至含新鲜培养基的T75培养瓶中，用于进一步扩增。为构建三维结构，首先传代并计数人角膜成纤维细胞，然后将约1×10⁶个人角膜成纤维细胞（HCF）接种到具有0.4微米孔径的聚碳酸酯膜插入式培养皿中。在构建物上方加入1.5毫升新鲜培养基。

然后将另外1.5毫升相同的培养基用移液器加入每个构建物的底部。24小时后，在每个构建物的顶部和底部各加入1.5毫升培养基，并添加0.5毫摩尔的维生素C。在37°C和5%二氧化碳条件下培养三周，每隔一天添加含有维生素C的新鲜培养基。

这将刺激细胞分泌并组装其自身的细胞外基质。三周后，在先前组装的3D结构顶部加入8×10³个SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞。此步骤中精确计算细胞数量至关重要，并且在启动细胞分化前需静置24小时。

孵育24小时后，通过向细胞中加入含10%胎牛血清和10微摩尔维甲酸的1.5毫升EMEM培养基，启动SH-SY5Y细胞的分化。然后将含有维生素C的1.5毫升培养基加入构建物底部。维甲酸对光敏感，因此该步骤应在避光条件下进行。

五天后，当细胞进入分化阶段时，在构建物顶部加入含有2纳米BDNF和1%抗生素-抗真菌剂的1.5毫升无血清培养基。在构建物底部加入新鲜的维生素C补充培养基。继续培养细胞额外两天，然后进行后续分析处理。

这是一张高倍透射电子显微镜图像，显示了三维自组装结构，其中包含聚碳酸酯膜以及位于其上方的角膜基质细胞。该图像展示了位于上方的已分化神经元细胞，呈现出基质-神经元细胞的排列方式。图像中的箭头指示的是神经元细胞。

在进行该操作时，必须始终注意保持角膜组织湿润，尤其是在切割外植体时，并确保手术器械和刀片处于无菌状态。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立并使用该体外模型，以研究人角膜基质细胞与神经元细胞在其天然细胞外基质中的细胞相互作用。请务必注意，操作BDNF、视黄酸以及手术刀片时可能存在极高危险性，因此在执行该操作时，应始终采取预防措施，例如穿戴适当的防护服。