Name: 基于 rna 的液体活检: 血浆 miRNA 特征分类器 (MSC) 在肺癌筛查中的经验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习使用实时PCR技术测量血浆中24种循环microRNA水平，以评估50岁以上重度吸烟者的肺癌风险。该方法可同时分析8个样本，约10小时完成，有助于提高低剂量CT筛查的成本效益并减少假阳性。

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作者感谢 Paola Suatoni、Elena Bertocchi、Carolina Ninni、Annamaria Calanca 和 Chiara Banfi 在试验中对志愿者的组织工作以及行政支持；感谢 Claudio Jacomelli 和 Claudio Citterio 在数据管理方面的协助。本研究由意大利癌症研究协会资助［研究者基金编号 15928（授予 UP）、14318（授予 GS）和 12162（“癌症风险评估与早期诊断创新工具”特别项目，5x1000 计划）］；意大利卫生部［基金编号 RF-2010］；美国国家癌症研究所基金 UO1 CA166905。MB 获得了 Fondazione Pezcoller 奖学金的支持。

该方案已获得本机构研究伦理委员会的批准。
1. 血浆样本采集
<ol>
	<li>使用喷雾涂层K2EDTA的真空采血管采集10 mL全血样本，并在室温下保存。 
	注意：为尽量减少溶血，应在2小时内分离血浆。避免将全血储存在低温（i.e.，4 °C）下，以防热休克和细胞裂解导致非特异性miRNA释放。</li>
	<li>在1小时内，通过第一次离心步骤分离血浆，条件为1,258 × g、4 °C离心10分钟。</li>
	<li>将血浆上清液转移至15 mL离心管中，注意避免接触淋巴细胞环。</li>
	<li>将血浆进行第二次离心，条件为1,258 × g、4 °C离心10分钟。</li>
	<li>将1 mL血浆分装至1.5 mL冻存管中，避免收集管底的血浆部分。</li>
	<li>除留取一份用于溶血评估外，其余所有分装样本均储存于−80 °C。分子分析应在5周内完成。</li>
</ol>
2. 通过分光光度法测定评估溶血
<ol>
	<li>血浆分离步骤完成后，立即在分光光度测定用比色皿中，将血浆样本用1×PBS进行1:10稀释（例如，将100 µL血浆加入900 µL 1X PBS中，混匀以实现均质化。 
	注意：在进行分光光度法检测前，血浆样本不应冷冻，因为样本的冻融过程（尤其是脂血样本）可能形成絮状沉淀，干扰分光光度法分析。</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计在375 nm、414 nm、541 nm和576 nm处测定吸光度，以750 nm为基线校正点，光程为10 mm。使用1 mL 1×PBS进行空白测定。</li>
	<li>计算 414 nm 与 375 nm 处吸光度的比值；若高于 1.4，则视为样本发生溶血，需重新采血（QC1） 表1).</li>
</ol>
3. 血浆总RNA提取
<ol>
	<li>配制OMG溶液，每毫升匀浆液中加入20 µL 1-硫代甘油。由于1-硫代甘油具有黏性，应小心移液以确保准确量取。使用前将OMG溶液置于冰上或2–10 °C环境中冷却。 
	注意：工作液在 2-10 °C 下可稳定保存 1 个月。</li>
	<li>将275 µL无核酸酶水加入DNase I冻干粉小瓶中，轻轻混匀（勿涡旋振荡）以重悬。为便于观察，向重悬后的DNase I中加入5 µL蓝色染料，并将溶液分装至无核酸酶的离心管中，每管为一次性使用剂量。将重悬后的DNase I储存于-30 °C至-10 °C。</li>
	<li>从 200 µL 血浆开始，加入 200 µL 冰冷的 OMG 溶液。</li>
	<li>涡旋15-30秒以确保完全均质化。若出现泡沫，将样品置于冰上静置。</li>
	<li>向匀浆样品中加入 200 µL 裂解缓冲液和 25 µL 蛋白酶 K，涡旋振荡 20 秒。</li>
	<li>在预先加热至 37 °C 的恒温混匀仪中孵育样品 15 分钟。</li>
	<li>为每份样本在仪器的托盘上装载一个试剂盒，并将塞子放置到正确位置。</li>
	<li>将裂解液转移至仪器卡盒的相应位置。</li>
	<li>向卡盒的适当位置加入 5 µL DNase I 溶液。</li>
	<li>向每个洗脱管底部加入 60 µL 无核酸酶水。</li>
	<li>选择 &#34;RSC miRNA 组织&#34; 方法并开始自动纯化程序。总RNA样品可在−80 °C保存。</li>
</ol>
4. 基于Taq的RT
<ol>
	<li>使用针对目标 miRNA 的 Taq RT 引物池，结合 Taq MicroRNA 反转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA。</li>
	<li>根据试剂盒说明书，在 1.5 mL 微离心管中冰上配制 12 µL 反转录反应混合液，其中包含 6 µL 定制的 Taq RT 引物池。</li>
	<li>加入 3 µL 总 RNA，终体积为 15 µL，在冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>将反转录反应液放入已设定如下程序的热循环仪中：16 °C 反应 30 分钟，42 °C 反应 30 分钟，85 °C 反应 5 分钟，然后保持在 4 °C。 
	注意：cDNA 可在 -15 至 -20 °C 下保存至少一周。</li>
</ol>
5. 预扩增
<ol>
	<li>取2.5 µL每种RT产物，加入12.5 µL Taq Master Mix 2x、3.75 µL Custom Taq混合液和6.25 µL无核酸酶水，总体积为25 µL。</li>
	<li>使用热循环仪按照以下热循环程序进行预扩增反应：95 °C 预变性10 min，55 °C 2 min，72 °C 2 min，随后进行12个循环（95 °C 15 s，60 °C 4 min），最后在99.9 °C 保持10 min，然后在4 °C 保存。</li>
	<li>加入175 µL 0.1X TE缓冲液（pH 8.0）稀释产物。 
	注意：稀释后的产物可在-15至-20 °C保存至少一周。</li>
</ol>
6. 在定制 Taq Array microRNA 芯片上进行 RT-qPCR 反应
<ol>
	<li>使用384孔微流控定制Taq阵列microRNA芯片，同时对8个样本中的24种特定miRNA（每个miRNA点样两次）的血浆水平进行检测。这24种miRNA的MiRBase ID（v21）分别为：hsa-miR-101-3p、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-451a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-660-5p 和 hsa-miR-92a-3p。</li>
	<li>在0.5 mL离心管中，将1.13 µL稀释后的PreAmp样本与56.25 µL的2X Taq Universal Master Mix以及55.69 µL无核酸酶水混合。</li>
	<li>将最多8份PCR反应混合液加载至定制Taq阵列microRNA芯片上。</li>
	<li>以311 × g离心2分钟。</li>
	<li>使用阵列芯片封膜仪密封定制芯片。</li>
	<li>使用实时PCR系统运行实时反应，循环参数设置如下：94.5 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（97 °C变性30秒，59.7 °C退火延伸60秒）。</li>
</ol>
7. 数据外推与比率生成
<ol>
	<li>使用软件获取原始 Ct 值，设置自动基线以去除背景信号，并为所有检测和样本设定固定的阈值为 0.15。剔除扩增曲线不佳和/或被动参比信号不佳的孔位。</li>
	<li>将原始 Ct 值导出为 &#34;.xls&#34; 格式，并使用两个重复孔的 Ct 均值进行后续分析。</li>
	<li>将 miRNA 的表达水平与临床研究样本的历史测量数据进行相关性分析（表 2）。如果每张定制微流控芯片上至少有 50% 的样本的皮尔逊相关系数 &#60; 97.5，则需重复该芯片检测（见 表 1 中的 QC2）。</li>
	<li>计算所有 miRNA 之间的 −ΔCt 值，该值相当于 miRNA 比值的 log2 值。</li>
</ol>
8. 通过相关miRNA特征评估溶血
<ol>
	<li>使用以下 miRNA 比值及其相应的临界值（log2 值）生成与溶血相关的 miRNA 特征谱，适用于短期储存的血浆样本（在 −80 °C 下储存 1–5 周）：miR-126/451 &#60; −0.07，15b/451 &#60; −3.67，221/451 &#60; −3.18，30b/451 &#60; −1.1，126/486-5p &#60; −0.33，15b/486-5p &#60; −3.86，221/486-5p &#60; −3.17，30b/486-5p &#60; −1.42，126/92a &#60; 1.8，15b/92a &#60; −1.8，221/92a &#60; −1.04，30b/92a &#60; 0.87，126/16 &#60; −2.85，15b/16 &#60; −6.33，221/16 &#60; −5.9，30b/16 &#60; −3.68。</li>
	<li>若至少有 50% 的比值（16 个中至少 8 个）超过各自临界值，则将样本归类为溶血样本（见表 1中的 QC3）。</li>
</ol>
9. 风险等级的定义：高、中、低
<ol>
	<li>定义构成 MSC 的四种 miRNA 比值特征，如图 3所示：疾病风险（RD）、侵袭性疾病风险（RAD）、疾病存在（PD）和侵袭性疾病存在（PAD）。</li>
	<li>针对每个特征，确定在短期储存血浆样本（−80 °C 下储存 1–5 周）中超过相应截断值的比值数量。判定为阳性所需的超出比值数量为：RD 和 PD 需 27 个比值中超过 9 个，RAD 和 PAD 需 28 个比值中超过 14 个（图 3A）。</li>
	<li>根据以下标准为每个样本分配相应的 MSC 风险等级：低风险，若 RDneg ∩ PDneg ∩ RADneg ∩ PADneg；中等风险，若 RDpos ∪ PDpos ∩ RADneg ∩ PADneg；高风险，若 RADpos ∪ PADpos（图 3B）。</li>
</ol>

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Gabriella Sozzi、Mattia Boeri 和 Ugo Pastorino 是三项专利申请的共同发明人，这些专利已授权给 Gensignia Life Sciences，涉及本文披露的 miRNA 特征。其余所有作者声明，其提交的此项工作不存在利益冲突。

方法学流程中的陷阱与挑战 
由于 BioMILD 是首个前瞻性分析循环 miRNA 作为诊断工具的研究，数据分析所使用的阈值和截断值均来自回顾性研究系列。为了克服血浆样本储存时间间隔不同的问题，可对参数进行优化，以期提高 MSC 的性能。然而，在开始 miRNA 分析之前，必须仔细评估整个流程中的多个方面，包括纳入标准、样本采集与处理，以及用于数据分析的生物信息学算法。以下部分将聚焦于本文所述工作流程中最关键的环节，指出各步骤中的主要问题，并提出相应的解决策略。
研究人群 
BioMILD 筛查试验的入组标准为：年龄在 50 至 75 岁之间，当前或既往（戒烟时间少于 10 年）有重度吸烟史，吸烟量至少为 30 包年，且在过去 5 年内无癌症病史。在此人群中，肺癌的估计患病率和年发病率分别约为 1% 和 0.7%。为了应用本方案所述的 MSC 检测，所分析的人群应保持类似的特征。特别是，上述 QC2 步骤涉及与来自相似人群的历史数据进行比较。虽然相关性低于 97.5 可能提示存在技术问题，但另一方面，大多数循环 miRNA 水平异常、提示肺癌风险升高的个体实际上低于该阈值。换句话说，若将本方案中报告的参数用于肺癌风险更高的群体进行 QC2 步骤，可能会排除本应可接受的样本。因此，应针对不同分析人群，根据预期结果定义新的、适当的参考参数。
血液采集与溶血 
生物样本的采集是一个关键的分析前步骤，因为该过程可能影响样本的质量和特性，从而改变最终的分析结果。对于血液样本，应采集新鲜血液并尽快处理。采血后样本不应在 4 °C 下储存，也不应冷冻，因为冻融过程可能引起细胞裂解（溶血）和 RNA 降解。为最大程度减少溶血，建议在血液采集后 2 小时内分离血浆31。
溶血主要是由于红细胞（RBCs）破裂，导致其内容物释放到周围环境中。这可能对循环miRNA检测造成问题，因为红细胞内含物的释放会显著改变血液中的microRNA谱，从而可能影响基于血浆分析的准确性30。
能够识别血浆样本中极低水平的溶血对于以循环miRNA作为生物标志物的研究至关重要。溶血最初可通过肉眼观察进行评估，因为在经过两次离心步骤后，血浆颜色可能从黄色到严重溶血样本的红色不等。然而，在分子生物标志物研究背景下，仅靠肉眼观察可能不够敏感。
一种简单的分析前方法是通过分光光度法测定主氧合血红蛋白峰在波长（λ）= 414 nm 处的吸光度，以识别溶血血浆样本，但需适当校正其他可能干扰因素的影响。为此，我们将 414 nm 处的峰吸光度值相对于 375 nm 处的吸光度值进行归一化处理，后者可反映样本中的脂质含量33。此外，或者更优的是联合使用，还可采用一种不受脂血干扰的溶血评分（hemolysis score, HS）34。该基于分光光度法的检测程序可识别至少 6.1 mg/dL 的游离血红蛋白。另外，也可通过检测红细胞特异性miRNA来识别溶血样本。由于即使极低程度的溶血也会显著升高红细胞特异性miRNA水平32，Fortunato et al. 鉴定出一种基于16个miRNA比值的特异性溶血相关特征谱，可有效对血浆样本中的溶血情况进行分类33。上述所有检测方法可联合使用：吸光度比值414/375和/或HS可用于分析前阶段，有助于节约后续成本；而检测溶血相关miRNA则可在分析后阶段作为质量控制步骤使用。
循环miRNA的分离与RNA纯度 
RNA提取过程对后续分析的成功具有重要影响。当起始样本量较低（如血浆）时，提取过程必须尽可能高效，以确保miRNA的准确定量。血浆中含有高浓度的多种蛋白质（包括核酸酶）及其他成分，这些物质可能干扰后续的逆转录定量PCR（RT-qPCR）等酶促反应，从而影响循环miRNA的检测。在这些研究中已采用多种提取方法，但通常而言，采用有机溶剂提取后结合基于二氧化硅的RNA富集方法，比单独使用TRIzol更能有效去除血浆中的抑制物35。然而，在过去几年中，手动提取已逐渐被自动化提取所取代。与手动提取方案相比，自动化系统的主要优势在于污染风险更低、重复性更高以及更节省时间。此外，与手动方案相比，自动化提取方法从血液样本中获得的miRNA含量最高，提取效率也最高36。
标准化问题 
血浆miRNA水平的标准化仍然是一个有争议的问题。实际上，样本质量或数量的差异可能干扰因疾病存在或风险所导致的miRNA表达水平真实变化的识别，从而引起数据解释的模糊和结论的误导。迄今为止，由于缺乏共识，已出现了多种不同的标准化策略37。
血浆样本中提取的总RNA通常低于紫外分光光度法或基于荧光的分光光度法等标准定量方法的检测阈值，因此无法进行RNA质量标准化38。因此，逆转录反应应选择固定体积而非固定质量的洗脱RNA作为起始输入量39。
用于组织样本中miRNA分析的看家转录本（如RNU48和RNU6）不适合用于细胞外miRNA检测的标准化，因为它们在循环中并不总是可检测到，这归因于RNase介导的降解40，并且在不同疾病中也表现出特异性失调37。目前尚不清楚是否有任何循环miRNA可有效作为参考对照。例如，miR-16常被提议作为看家miRNA，但多项研究显示其在癌症患者的血浆样本中存在表达失调28,37。此外，miR-16的水平受溶血影响显著30。
尽管在高通量检测中，通过测量多个miRNA并以平均表达值进行标准化已被广泛接受41，但当需要分析的miRNA数量有限时，这种标准化方法无法适用。为规避标准化问题，Boeri et al. 此前建立了一种基于24个miRNA之间相互比值的算法28。尽管该方法在诊断工具开发中非常有用，但难以有效区分可能在肿瘤发生中起作用的miRNA，因而无法明确识别可作为校准标准的miRNA。另一种有效的策略由Bianchi et al. 所采用，该团队开发了用于肺癌早期检测的血清miR-Test，其方法基于对一组6个在不同样本及患者类别间变化较小的“管家血清miRNA”&#34;housekeeping serum-miRNAs&#34;的几何平均值进行标准化42。
基于miRNA的液体活检特征及其潜在应用 
基于血浆的MSC是一种用于重度吸烟者肺癌早期诊断的分子无创检测方法。MSC检测可在低剂量螺旋CT（LDCT）发现肺癌之前识别出中高风险个体，具有较高的灵敏度（SE，87%）和阴性预测值（NPV，99%）。具体而言，MSC可辅助LDCT筛查，将假阳性率从单独使用LDCT时的19.7%显著降低至3.7%29。在仅针对肺癌患者的研究中，MSC检测也显示出良好的预后评估能力，可单独或联合其他临床病理参数作为疾病监测工具43,44。从潜在角度来看，MSC检测有望提高肺癌诊断算法的一致性，从而提升筛查的成本效益。
除MSC外，已有其他用于早期肺癌检测的非侵入性检测方法被报道。Bianchi et al. 提出了一种基于34个miRNA特征的循环miR-Test45，随后将其简化为13个miRNA特征42。用于发现和验证的血清样本来自在意大利米兰欧洲肿瘤研究所（IEO）开展的“吸烟者持续观察”（Continuous Observation of Smoking Subjects, COSMOS）低剂量CT（LDCT）筛查试验。miR-Test在高风险志愿者中检测肺癌的准确率达到78%。在构成miR-Test的13个血清miRNA与构成MSC的24个miRNA中，仅有5个miRNA重叠（miR-92a、miR-30b、miR-30c、miR-148a和miR-140-5p）。这种差异可能源于起始样本类型的不同（血清 vs. 血浆）以及数据分析方法的差异。事实上，在miR-Test中，作者选择了6个在血清中表现为看家基因的miRNA，其中3个也包含在MSC的miRNA比值中（miR-15b、miR-19b和miR-197）。尽管如此，基于血浆的MSC与基于血清样本的miR-Test均进一步验证了基于miRNA的液体活检在肺癌检测中的应用价值。
利用miRNA表达谱分析来鉴定肺癌生物标志物的研究也已在痰液样本上开展46。痰液易于采集，且其中miRNA的表达水平极为稳定。然而，肺癌筛查志愿者通常年龄超过50至55岁，且多为伴有慢性阻塞性肺疾病（COPD）等共病的重度吸烟者，因此难以获取痰液样本。事实上，在各类体液中，血浆是研究miRNA作为肺癌生物标志物（但不限于肺癌）潜在作用的最佳替代样本之一。
总体而言，本文所述方法可适用于多种疾病的研究，对所研究的病理类型（从癌症、神经系统和心血管疾病到糖尿病等）以及临床应用目的（用于诊断、预后或治疗反应的生物标志物）均无限制。

肺癌是全球最常见的癌症，约占所有癌症诊断病例的25%1。尽管在过去20年中，由于烟草使用减少，肺癌死亡率持续下降，但肺癌仍然是男性和女性癌症死亡的首要原因。预计在2017年，美国和欧洲的癌症死亡总数中分别约有25%和20%由肺癌导致1,2。
由于早期疾病通常不会出现症状，大多数肺癌在晚期才被诊断出来。这导致治疗干预的可能性有限，且治疗效果较差3。因此，许多科研工作致力于寻找一种有效的检测方法，以实现肺癌的早期发现。
多种筛查试验表明，胸部X线检查在肺癌筛查中并无价值，而低剂量计算机断层扫描（LDCT）在检出早期肺癌方面优于X线检查4。此外，已有研究显示，在当前及既往重度吸烟者中，采用LDCT进行筛查可使肺癌死亡率降低高达20%5。这些数据支持在高风险人群中开展肺癌筛查，该人群的定义符合多个专业学会指南中的标准4,6。
值得注意的是，在关于低剂量计算机断层扫描（LDCT）筛查的主要担忧中，存在假阳性结果率高和过度诊断的问题。因此，科学界正在寻求一种策略以克服这些问题，并提高LDCT筛查的特异性。开发无创性互补生物标志物可能对此有所帮助。迄今为止，已有大量候选生物标志物正在研究中，例如miRNA、游离DNA、基因甲基化、小分子蛋白质以及其他标志物7。
基于血液的生物标志物，包括免疫应答生物标志物和循环miRNA，是已进入较高级别验证阶段的标志物8。免疫应答生物标志物基于以下认识：肺癌患者体内会针对肿瘤细胞内和表面抗原产生免疫应答9。例如，Ajona et al. 研究了经典补体途径降解产物C4d在肺癌诊断与预后评估中的作用10。此外，一种 commercially available 的血清自身抗体检测方法，可检测七种肿瘤相关抗原，在非小细胞肺癌患者中已得到验证，其灵敏度为36%，特异性为91%11。免疫应答生物标志物具有研究价值，但其潜在的临床应用仍需进一步的验证研究。
miRNA 是一类内源性小分子非编码 RNA，在动物和植物界中具有保守的作用机制和重要的生物学功能。miRNA 的主要功能是调控蛋白质的翻译过程：通过抑制大量靶基因的表达来实现调控作用12。已有大量研究证实，miRNA 表达水平的异常与大多数人类癌症的发病机制密切相关12,13,14。此外，肿瘤细胞和基质细胞均可将 miRNA 释放到体液（如血浆和血清15,16、尿液17以及唾液18）中，这些 miRNA 可通过包裹于微囊泡内或与 RNA 结合蛋白结合而保持稳定。因此，循环 miRNA 可能反映了机体对肿瘤的应答情况以及肿瘤与其微环境之间的动态相互作用19。综上所述，这些发现使循环 miRNA 成为一种极具前景的人类癌症检测生物标志物。
循环miRNA可通过多种方法进行检测：微阵列平台20、定量逆转录PCR（RT-qPCR）21以及高通量测序（NGS）14,22。近年来，基于上述技术的多种表达谱研究已相继建立。微阵列是一种高通量技术，可在单次实验中同时分析数千种miRNA。然而，与RT-qPCR或NGS相比，其动态范围和特异性较低。此外，微阵列属于非定量方法，因此需要进一步的实验验证。基于序列的检测方法能够识别未知miRNA，尤其适用于发现阶段的研究。另一方面，NGS方法目前仍较为昂贵，且需要专用设备和专业的生物信息学分析人员，从而限制了其在大规模验证队列及临床环境中的应用23。目前，在诊断或临床背景下，RT-qPCR是检测循环miRNA最常用的平台24。现有多种可用于miRNA分析的RT-qPCR技术，其中茎环结构逆转录结合TaqMan PCR的方法应用最为广泛25。该技术具有极高的灵敏度和准确性（可实现单核苷酸分辨），并具备宽广的动态范围；但仅适用于已知miRNA的检测。
Mestdagh 等人开展的 microRNA 质量控制研究（miRQC 研究）et al. 基于前述三种技术，系统评估了若干市售 miRNA 表达谱分析平台的性能26。通过分析组织和血清样本中的 196 个 miRNA，从可重复性、灵敏度、准确性、特异性以及差异表达一致性等方面对不同平台的表现进行了评价。结果表明，基于高通量测序（NGS）和微阵列技术的平台具有更高的可重复性和特异性，而基于逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）的平台则在准确性、灵敏度和检出率方面表现更优，尤其适用于 RNA 起始量较低的样本（如体液）。因此，RT-qPCR 似乎是应用于常规临床诊断的最合适方法。
2011年，Sozzi et al. 分析了来自首次低剂量计算机断层扫描（LDCT）筛查试验（INT-IEO试验）志愿者的血浆样本中的miRNA谱27，并基于24种循环miRNA之间的相互比值构建了四个miRNA特征。这些特征能够在LDCT检出疾病时或检出前长达2年内，区分无病个体与患有任何类型或致死性肺癌的患者28。在后续一项研究中，该研究团队首次描述了miRNA特征分类器（MSC），该分类器通过整合上述四个miRNA特征，将患者分为高、中、低三个风险等级。其临床实用性在MILD筛查试验中超过1,000名受试者的大型回顾性数据集中得到验证；MILD试验是一项随机研究，比较每年一次、每两年一次LDCT筛查组与观察组的效果29。事实上，MSC与LDCT联合使用可使LDCT的假阳性率降低约5倍，且三个MSC风险分组与总体生存率相关。 
随后，在2013年，位于意大利米兰的&#34;Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori&#34;启动了一项实施低剂量计算机断层扫描（LDCT）联合基于血浆的MSC检测的前瞻性筛查试验（BioMILD）。参加BioMILD试验的志愿者接受LDCT检查并抽取血液，血液随即被处理以分离血浆，用于采用定制微流控卡片进行miRNA谱型分析。LDCT与MSC结果的联合应用构成了特定的筛查算法24。
本研究描述了BioMILD试验中所采用的完整方法学流程，包括从血液样本采集、血浆分离、RNA提取，到使用定制的RT-qPCR微流控卡片进行24种miRNA表达谱分析的全过程。由于该流程具有高度的一致性和可重复性，也可用于其他疾病中基于miRNA的液体活检技术的开发。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;1x PBS&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE-17-516</td><td></td></tr><tr><td>20xTE 缓冲液，pH 8.0</td><td>分子探针</td><td>T11493</td><td>将20X储存液稀释，以在无核酸酶水中获得最终浓度为&amp;nbsp;0.1X的溶液</td></tr><tr><td>无核酸酶水&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxwell RSC miRNA 组织提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>AS1460</td><td>该试剂盒包含匀浆液、DNase I、蛋白酶K、裂解缓冲液和提取柱。对于1-硫代甘油，应避免吸入以及与皮肤和眼睛接触。请在通风橱中使用。</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 反转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>定制 TaqMan RT 引物混合液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4459649</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp 预扩增主混合液 2X&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>定制 TaqMan&amp;nbsp; 预扩增混合液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4459657</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II，不含UNG 2x&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4440048</td><td></td></tr><tr><td>定制 TaqMan Array microRNA 芯片&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4449137</td><td>在加样前将定制 TaqMan Array microRNA 芯片恢复至室温</td></tr><tr><td>Vacutainer 安全锁式采血套装&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>367286-364815</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer 塑料喷雾涂层 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA 管&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>紫色 BD Hemogard 封盖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PS 半微量比色皿&amp;nbsp;</td><td>VWR/PBI</td><td>&amp;nbsp;643-0326</td><td>光程 10 mm</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 冻存管&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359033</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>在开始血浆采集前，将离心机预冷至 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3S+ 离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-37520</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer T-摇床</td><td>Euroclone&amp;nbsp;</td><td>A00564</td><td>在开始RNA&amp;nbsp;提取前，将Thermo Mixer预热至37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Maxwell RSC 仪器</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700 热循环仪&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 实时荧光定量PCR系统&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 RUO 软件&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>芯片架/封膜机</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331770</td><td></td></tr></tbody></table>

基于微小rna的液体活检：血浆微小rna特征分类器（msc）在肺癌筛查中的应用经验

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

开发一种微创检测方法（如液体活检），用于在临床前阶段早期发现肺癌，对于改善这种致命疾病的预后至关重要。微小RNA（miRNA）是一类具有组织特异性的短链非编码RNA，可调控基因表达，并可能作为肿瘤与其周围微环境之间相互作用所产生的生物信号的细胞外信使。因此，它们可能是用于肺癌早期检测的理想候选标志物。本文提出了一种方法学流程，旨在通过使用定制的微流控芯片结合实时定量PCR技术，对肺癌筛查试验中志愿者血浆样本中的循环miRNA检测进行前瞻性验证。此外，由于溶血相关miRNA的释放以及一些普遍存在的技术问题可能影响分析结果，本文还介绍了标准操作程序中包含的质量控制步骤。该方案具有良好的可重复性，并能提供可靠的定量结果；然而，在使用大规模临床样本系列时，应谨慎评估分析前和分析过程中的各项技术参数。

BioMILD 试验是一项前瞻性研究，旨在通过在大量重度吸烟人群中测试联合使用低剂量计算机断层扫描（LDCT）与微小RNA（MSC）方法作为一线筛查手段的有效性，以实现肺癌的早期检测。根据检测24种血浆循环miRNA之间比值的miRNA检测结果，为每位志愿者分配一个风险等级。如已有大量文献报道30,31,32，溶血是循环miRNA分析中的一个关键问题，因为血细胞非特异性释放miRNA可能导致假阳性或假阴性结果。在本研究所提出的方法学流程中，已描述了一个分析前质量控制步骤（QC1，见表1），用于识别发生溶血因而无法用于分析的血浆样本。图1展示了溶血血浆样本（图1A）与非溶血血浆样本（图1B）的分光光度分析结果，及其相应的A414/A375比值。在临床实践中，分子检测结果对志愿者的管理至关重要，该QC1步骤可提示重复采血，并在大多数情况下成功获得合格样本。
分子处理完成后，应准确评估RT-qPCR的性能，以识别任何技术问题。图2A显示了一个由于被动参比信号较弱而导致性能较低的RT-qPCR结果。此时建议将预扩增产物重新加载至一张新的微流控芯片上。当RT-qPCR结果良好时（如图2B所示），则进入第一个分析后质量控制步骤，以确保miRNA表达值与历史测量数据具有可比性（见表1中的QC2）。如果QC2步骤未通过，则可能在逆转录或预扩增反应过程中出现了技术问题，建议从逆转录步骤开始重复整个分子处理流程。
最后的质量控制步骤（见表1中的QC3）在分子水平上评估溶血情况。通过比较4种红细胞特异性miRNA（mir-16、mir-451、mir-486-5p和mir-92a）与4种非溶血相关miRNA（mir-126、mir-15b、mir-221和mir-30b）的表达水平，得到由16个（4×4）miRNA比值组成的溶血相关miRNA特征谱。结果为阳性的样本被判定为发生溶血，而阴性样本则进入最终的MSC风险等级分类，具体见方案第9节及图3。
<img alt="吸收光谱分析，A414/A375 比值，四条光谱图比较光学特性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1： 新鲜血浆样本的分光光度分析。 （A）2 个溶血和（B）2 个非溶血血浆样本的分光光度图谱，测定波长 A414 与 A375 之间的吸光度比值。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="24 种 miRNA 和单个 miRNA 的扩增曲线；基因表达 qPCR 结果示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：微流控芯片分析中 RT-qPCR 的性能表现。 扩增曲线与多组分图谱比较了（A）质量较差和（B）质量良好的微流控芯片。每个图中均展示了全部 24 种 miRNA 及一个代表性 miRNA。多组分图谱显示了这些 RT-qPCR 反应中出现的被动参比信号。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="采用颜色编码数据分析结果和样本标识的基因表达热图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：用于风险分层的 MSC 算法。 代表性结果基于 BioMILD 筛查试验中招募的志愿者的 6 份血浆样本。(A) 针对在 -80 °C 下储存至少 1 周至最多 5 周的血浆样本，疾病风险（RD）、侵袭性疾病风险（RAD）、疾病存在（PD）、侵袭性疾病存在（PAD）的 miRNA 比值特征及其相应的截断值（log2）。(B) 结合四个特征，将可分析样本分为高（H）、中（I）和低（L）MSC 风险等级。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了BioMILD筛查试验中采用的详细方案，用于进行循环microRNA特征分类检测，以实现肺癌的早期检测。

基于微小RNA的液体活检：血浆微小RNA特征分类器（MSC）在肺癌筛查中的应用经验

开发一种微创检测方法（如液体活检），用于临床前阶段早期肺癌的检测，对于改善肺癌...至关重要

本实验的总体目标是通过检测24种血浆循环microRNA的水平，评估50岁以上重度吸烟者发生肺癌的风险。这些方法可通过减少假阳性结节的数量并可能降低过度诊断的风险，提高低剂量计算机断层扫描（low-dose computed tomography）在早期肺癌筛查中的成本效益。该技术的主要优势在于，分泌型microRNA可利用常规分子生物学实验室的标准设备进行简便检测。我们最初在研究肿瘤微环境在肺癌发展中的作用时，提出了这一方法的想法。微小RNA反映了宿主的反应以及肿瘤与其微环境之间的动态相互作用。对该方法进行可视化展示，对于更好地理解此类分子分析所需遵循的标准操作流程至关重要。开始本实验方案时，使用真空采血管采集10毫升全血样本。在室温下保存。切勿将全血置于低温（如4°C）下保存，以避免热休克和细胞裂解。这使我们转向特定的微小RNA释放。在1小时内离心血浆以分离其中成分，同时务必避免与淋巴细胞环接触。将上清液转移至15毫升离心管中。随后，在相同条件下对上清液进行离心。取1毫升此血浆上清液分装至1.5毫升冻存管中，注意避免吸取管底的血浆组分。开始RNA提取时，向每个样本的200微升血浆中加入200微升预冷的OMG溶液。为确保充分均质化，涡旋振荡15至30秒。为均质化样本，向每个样本中加入200微升裂解缓冲液和25微升蛋白ASK，涡旋振荡20秒。然后，将样品置于37摄氏度的恒温混匀仪中孵育15分钟。接着，选择RSC mi-RNA组织方法，并在核酸自动提取仪的载样盘上为每个样品装载一个试剂盒，正确放置活塞。将裂解液转移至指定位置，并向仪器试剂盒中相应位置加入5 µL DNase I溶液。向每个洗脱管底部加入 60 µL 无核酸酶水。启动运行以开始自动纯化程序。将总 RNA 样本储存于 -80 °C。使用 Taq microRNA 逆转录试剂盒将 RNA 转换为 cDNA 时，需选用针对目标 miRNA 的 Taq RT 引物工具。在置于冰上的 1.5 毫升离心管中，根据试剂盒说明书配制逆转录反应体系。然后每份样品加入 3 µL 总 RNA，使终体积为 15 µL。冰上孵育5分钟。最后，将样品加入热循环仪中，进行逆转录反应。然后，取2.5 µL每份逆转录反应产物，与2× Taq Master Mix和Custom Taq引物混合液混合。加入无核酸酶水至终体积为 25 微升。使用特定的热循环程序在热循环仪中进行预扩增反应。然后通过加入 175 微升 0.1 × TE（pH 8.0）稀释每种产物。首先，将1.13 µL稀释后的预扩增样品与2X Taq Universal Master Mix在0.5 mL离心管中混合，然后加入无核酸酶水。为同时检测八个样本中24种特定miRNA的血浆水平，使用384孔微流控定制Taq阵列miRNA芯片。在卡片上加入最多八个含有PCR反应混合液的反应体系。将定制卡片在311 ×g条件下离心2分钟，并使用阵列卡片封膜仪进行封膜。最后，将卡片放入实时PCR系统中，运行实时PCR反应。使用适当的软件进行数据外推和分析，并获取原始CT值。为所有检测和样本设置自动基线以消除背景信号，并将阈值固定为0.15。必须进行预分析质量控制步骤，以识别不可分析的溶血血浆样本，因为在这些样本中，血细胞可能非特异性释放miRNA，导致假阳性结果。通过分光光度法分析血浆样本，测定波长 A414 与 A375 处吸光度比值，可区分溶血不可分析样本与非溶血样本。为识别任何技术问题，需评估 RT-QPCR 的表现。若四个质量微流控芯片显示 RT-QPCR 性能较低，则应将预扩增产物重新加载至新的微流控芯片。高质量的微流控芯片可实现良好的性能，随后需经过两个分析后质量控制步骤。完成质量控制步骤后，应用微小RNA特征分类器，生成由四个miRNA比值特征组成的MSC。疾病风险、侵袭性疾病风险、疾病存在与否以及侵袭性疾病存在与否。通过整合这四个特征，最终将风险水平定义为低、中或高。一旦掌握该技术，除一周在-80摄氏度下储存血浆外，整个过程可在十小时内完成。同时分析八个样本。该微小RNA特征分类器迄今已在来自兰开斯特生物医学筛查试验中超过4,000名志愿者的10,000多个样本上进行了测试。这些检测有望提高诊断算法的一致性。它们还降低了筛查成本。观看本视频后，您应能充分理解如何检测循环miRNA水平，并将其用作癌症诊断及其他严重疾病的生物标志物。

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癌症研究

基于 rna 的液体活检: 血浆 miRNA 特征分类器 (MSC) 在肺癌筛查中的经验

本视频介绍了利用抗体微阵列检测特定基因表达，以研究转染miRNA的肺癌细胞中蛋白质表达水平的技术。在本视频展示的实验方案中，我们采用抗体微阵列来鉴定联合miRNA治疗在抑制细胞周期和血管生成中的活性。...

抗体芯片：一种研究经miRNA处理的肺癌细胞中蛋白质表达的技术

microRNA（miRNA）是具有组织特异性的微小非编码RNA，可调控基因表达，有望成为肺癌早期检测的理想候选标志物。在本视频展示的实验方案中，我们将从患者血液样本中分离microRNA，用于肺癌的早期筛查。...

miRNA 提取：一种从血浆样本中提取 miRNA 的方法

血浆分离的外泌体可作为一种无创且可重复的方法，用于生物标志物的检测和随访，以实现早期发现和疾病进展监测。本视频介绍了从非小细胞肺癌患者血浆样本中分离外泌体的实验方案，该方法可用于后续的DNA和蛋白质提取。...

外泌体分离：一种从非小细胞肺癌患者血浆中分离外泌体的技术

关键词：外泌体，非小细胞肺癌，血浆，分离技术，生物标志物

本视频介绍了使用有机提取法结合玻璃纤维柱富集技术，从结直肠癌患者血浆样本中提取循环microRNA的方法。miRNA在血清和血浆等生物体液中具有良好的稳定性，使其成为癌症诊断、预后评估以及治疗决策与监测的理想循环生物标志物。该方法将有助于发现能够预测患者临床结局的新型循环生物标志物。...

循环miRNA提取：通过有机提取和小RNA富集从血浆样本中分离miRNA的方法

我们描述了一种实时PCR方案，用于分析脑脊液（CSF）中的microRNA。除RNA提取步骤外，该方法可推广应用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。...

利用定量实时聚合酶链式反应进行脑脊液微小RNA谱分析

循环microRNA最近已成为多种癌症及其他疾病的有前景的新型生物标志物。本文旨在讨论三种不同的基于探针的实时PCR平台和方法，这些平台和方法可用于定量并确定循环microRNA的丰度。...

基于探针的实时PCR方法用于microRNA的定量检测

本方案描述了利用商业化的外泌体分离试剂盒，结合蛋白酶K和RNase处理，从非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中释放的外泌体进行miRNA谱分析的可行性，以避免游离miRNA的污染，并评估其在NSCLC中的生物标志物特征。...

非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中外泌体miRNA的qPCR分析：一种可行的液体活检工具

我们介绍了一种用于评估癌症患者血浆样本中循环微小RNA（miRNA）表达水平的实验方案。具体而言，我们采用了一种市售的试剂盒进行循环miRNA的提取和逆转录。最后，利用实时荧光定量PCR预点样探针定制板，对24种选定的miRNA进行了检测分析。...

转移性结直肠癌患者循环microRNA定制 panel 的检测

本文中，我们介绍了一种非侵入性液体活检技术的详细方案，包括血液采集、血浆和白细胞层分离、游离DNA（cfDNA）与种系DNA提取、cfDNA或种系DNA的定量，以及cfDNA片段富集分析。...

癌症患者血浆样本中游离DNA的检测

本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA...

通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

学习使用实时PCR技术测量血浆中24种循环microRNA水平，以评估50岁以上重度吸烟者的肺癌风险。该方法可同时分析8个样本，约10小时完成，有助于提高低剂量CT筛查的成本效益并减少假阳性。

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