利用磁力镊子对G-四链体进行单分子操控

本实验的总体目标是利用磁镊技术，在单分子水平上直接测量G-四链体（简称G4）的折叠与去折叠过程，以及结合蛋白对这一过程的调控作用。该方法有助于回答G4领域中的关键科学问题，例如G4的折叠动态行为及其与结合蛋白之间的相互作用调控机制。该技术的主要优势在于，磁镊结合抗漂移技术，能够对单个分子的纳米级折叠动态进行长达数天的稳定测量。

让我们从这条信息开始：该方法能够揭示G4结构稳定性的分子机制，以及解旋酶在G4上的活性；它还可用于研究与G4结合蛋白或配体相关的相互作用，这些研究可能具有潜在的治疗应用价值。此外，该方法也可用于探测外部的蛋白质-DNA相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用。实验操作首先按照文本方案中所述，准备流动通道中的G4 DNA。

通过使用T4 DNA连接酶，将形成G4结构的单链DNA、两侧的单链DNA以及一个双链DNA手柄进行连接，从而制备G4 DNA。对于磁镊实验装置，启动磁镊程序。此处，磁镊由实验室自主编写的LabVIEW程序控制。

接下来，在安装通道之前对齐磁铁中心。使用10倍物镜通过显微镜的光学通路调节磁铁的X轴和Y轴。使用计算机控制的电动操纵器沿Z方向移动磁铁，并在磁铁附着到显微镜的盖玻片上时，将磁铁与盖玻片之间的距离设为D等于零。

通过操纵器编程磁体的运动，以实现对力的控制，包括恒定力和随时间变化的力。使用高亮度发光二极管光源，通过物镜对微珠进行背向散射照明。利用电荷耦合器件相机以每秒100赫兹的采样率采集微珠图像。

进行拴系成束时，将200倍稀释的M280顺磁珠轻轻流入检测溶液中的通道内。孵育混合物10分钟，使磁珠通过硫醇标记的ent与固定在SMCC编码表面的生物素标记DNA分子结合。使用200微升标准反应溶液轻轻洗去未拴系的磁珠。

接下来，将通道安装到显微镜载物台上。使用100倍油浸物镜在底部表面寻找微珠。在表面选择一个参考微珠和一个可移动的拴系微珠。

构建参考微珠和拴系微珠在不同离焦平面的初始图像库。实验前，使用物镜压电驱动器获取参考微珠和拴系微珠在不同离焦平面的图像，各平面间距为 20 至 50 纳米。将这些图像存储为两个独立的微珠图像库，并分别以离焦距离作为索引。

实验过程中，通过微珠的质心确定其在 XY 平面上的位置。通过将当前微珠图像与库中存储的图像进行比较，确定拴系微珠的高度变化。采用微珠图像傅里叶变换功率谱的自相关函数分析。

实验过程中，使用Pizeo通过低频反馈控制锁定物镜与库中存储的特定参考微珠图像之间的距离，使被捕获的微珠图像与库中存储的特定图像具有最佳相关性。通过施加约65皮牛的力来判断拴系的分子是否为单个双链DNA分子：若该分子发生特征性的DNA过度拉伸转变，则表明其为单个双链DNA分子。

重复该过程，直至找到单个双链DNA系链。基于微珠的波动，对力与磁铁位置之间的关系（即所谓的力-距离曲线）进行校准。此外，双链DNA在接近65皮牛时发生的过度拉伸转变也可用于力的校准。

对于力斜坡实验，在0.2皮牛顿每秒的加载速率下进行力增加扫描，随后以-0.2皮牛顿每秒的速率进行力减小扫描。每次拉伸循环后，将DNA分子在1皮牛顿的力下保持30秒，以允许单链DNA重新折叠为G4结构。对于力跃实验，将力在54皮牛顿下循环30秒（在此条件下，折叠的G4结构可被解折叠），然后在1皮牛顿下循环60秒，以允许G4-15T重新折叠。最后，使用自行编写的Matlab程序分析解折叠力。

此处展示的是一个锚定 G4 四链体的力增加和力减小曲线的典型示例。在力增加扫描中，延伸长度的跳跃表明 G4 发生了解折叠转变，发生在约 52 皮牛顿。然而，在存在 RHAU 的情况下，G4 在力增加扫描过程中直至 60 皮牛顿仍保持折叠状态，表明 RHAU 的结合增强了 G4 的力学稳定性。

在 RHAU 和 ATP 存在的情况下，G4 的解折叠力分布向较低的力值偏移，表明 RHAU 以 ATP 依赖的方式使 G4 结构不稳定。在力跃变循环过程中，微球高度的代表性曲线显示，施加于分子的力在 54 皮牛顿（持续 30 秒，足以使折叠的 G4 解折叠）和 1 皮牛顿（持续 60 秒，允许其重新折叠）之间循环变化。在 54 皮牛顿的力下，折叠态 G4 的平均寿命约为 6.4 秒，该值通过将寿命直方图拟合为指数衰减函数得出。

当引入RHAU解旋酶时，在54皮牛顿的力下持续30秒，拴系DNA的延伸长度始终保持在折叠状态的水平，表明RHAU能强烈稳定G-四链体结构，抵抗机械解折叠。而在加入RHAU和ATP后，DNA的延伸长度达到单链DNA解折叠状态的水平，表明G-四链体结构被破坏。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用超稳定磁镊技术测量核内ACS junction结构的解折叠与重折叠动力学过程。该技术的应用为核酸结构与结合蛋白领域的研究人员探索结构稳定性、折叠动力学以及核酸与结合蛋白相互作用提供了重要途径。