用于改进斑马鱼幼鱼实验操作的长期活体成像装置

本成像装置制备的总体目标是构建一个可调节的平台，用于对活体斑马鱼幼虫的伤口愈合过程进行显微分析。该方法有助于回答伤口愈合领域的一些关键问题，例如胶原纤维重组和细胞反应在损伤后组织再生过程中所起的作用。该技术的主要优势在于，创伤诱导和成像均在同一装置内完成，同时该装置不会阻碍尾部的再生生长。

此外，可独立修改 zWEDGI 的多个功能区室，以适应不同的幼虫发育阶段和多种实验方案。首先，根据文本方案中描述的几何形状和特性，对装置的 PDMS 部分进行建模。使用光敏树脂 3D 打印机打印模具后，用细刷、喷雾瓶中的变性酒精和压缩空气清洁模具。

轻轻擦洗并去除未固化的树脂，特别是微通道区域的任何材料。然后将模具在紫外光后固化装置中每侧各后固化60分钟，因为未固化的树脂对斑马鱼幼鱼具有毒性。使用200目的砂纸，在平面上打磨模具的型腔侧面，直至所有顶面均与砂纸接触。

使用400目和600目砂纸依次轻轻打磨，使模具所有几何表面形成光滑、齐平的表面。然后使用百分表测量打磨后型腔的深度，以确认其接近设计深度。将模具和玻璃盖片放入盛有水的超声波清洗器中清洗30分钟，或用流动水冲洗，以清洁表面。

使用异丙醇和过滤压缩空气清洁并吹干模具和盖片。准备一个洁净台作为装置制备的场所，以尽量减少空气中微粒造成的污染。将PDMS基础剂与活化剂按5:1的比例倒入塑料杯中混合均匀以制备PDMS。

用木质压舌板充分搅拌约两分钟，像揉面团一样将凝胶反复折叠搅拌。随后将混合物置于真空干燥器中脱气 25 至 45 分钟，直至所有气泡完全消失。然后，使用 10 毫升注射器，向每个 3D 打印模具的型腔中注入约 0.75 毫升 PDMS，直至模具略微溢出并形成弯月面。

将注满的模具脱气45分钟，以去除填充过程中可能产生的额外气泡。将玻璃盖片置于装有PDMS的模具顶部，以一定角度按压盖片，防止夹入气泡。在放置玻璃盖片时，让多余的PDMS被挤出。

然后，使用小型棘轮夹具将盖片紧密固定在模具上。为提高效率，可使用多夹具装置。将PDMS器件与夹紧的模具置于烘箱中，在100摄氏度下固化至少90分钟。

然后，将模具从烤箱中取出，静置冷却至可安全操作。将含有固化PDMS器件的模具用台钳夹紧，使模具的结构面朝上，与工作台面平行。使用平头镊子从模具上开始剥离PDMS器件，先将PDMS拉片从模具中释放。

然后，使用镊子沿模具边缘操作。PDMS 必须在 100 摄氏度下至少固化 90 分钟，否则会保持黏性并粘附在模具上。判断设备是否已充分固化的一个良好迹象是：你会在模具与 PDMS 装置之间的界面处观察到一个气泡，这表明装置将能够轻松脱模。

使用过滤的压缩空气和镊子，握住拉片并向装置下方吹入空气，从而将装置轻轻从模具中抬起。接着，将PDMS装置倒置放置在玻璃底培养皿盖的内侧，使限位隧道楔形部分接触塑料表面。然后，将带有倒置zwEDGI的培养皿盖及对应的玻璃底培养皿放入等离子清洗仪中，使内侧玻璃面朝上。

将等离子清洗室抽真空，直至压力达到500毫托。将射频（RF）功率调至高，使器件和培养皿暴露于射频下约两分钟。然后缓慢释放腔室压力，并将器件和培养皿放回洁净室的超净工作台中。

从培养皿盖上取下PDMS装置。然后，将PDMS zWEDGI小心地翻转并正确放置在玻璃表面，使其对准玻璃底培养皿的中心孔。为确保PDMS与玻璃充分贴合，使用镊子的尾端在微通道的微小结构周围施加压力，将PDMS从中心向边缘抚平。

轻轻按压PDMS装置，确保装置下方没有气泡滞留。向培养皿中加入70%乙醇，使用微量移液器冲洗通道，包括约束隧道内的通道。随后移除乙醇，用双蒸水冲洗装置两到三次，然后静置使其自然晾干。

用脱脂牛奶填充通道，并在室温下孵育装置10分钟，以尽量减少幼虫对培养皿玻璃盖玻片的黏附。然后，将装置在双蒸水中轻轻浸没数次以清洗，并将其倒置晾干。根据文本方案麻醉幼虫后，使用几微升三卡因E3溶液预润湿装置的通道。

使用宽孔径的移液枪头吸取单个幼虫，并将其放入加样通道中。然后，用移液枪头或类似工具将幼虫在加样室中调整方向，使其背侧朝向加样室较平直的一侧，尾部朝向固定隧道。小心地从损伤室中吸出液体，使幼虫缓缓流入固定隧道内。

在保持幼虫周围湿润的同时，移除大部分液体。在移除大部分液体的过程中，必须将幼虫正确地定向放入固定通道中，但幼虫周围需保留足够的液体。

在加入琼脂糖后可调整方向，但必须在琼脂糖凝固前完成。用移液器将1%低熔点琼脂糖（LMP agarose）加入三卡因E3溶液中，覆盖幼鱼头部，填满加样室，并让琼脂糖在幼鱼处于正确位置时凝固。根据需要向损伤室中添加三卡因E3溶液，以保持湿润。

然后，对剩余的两个通道重复此加样过程。使用注射器针头，小心移除从限制隧道渗入损伤室的琼脂糖。若需进行损伤处理、短期成像或隔离伤口处理，可在琼脂糖上方再加入更多的三卡因E3溶液。

为了在损伤室中对幼虫进行损伤，使用无菌手术刀片在脊索后方横切尾鳍。如有需要，可补充三卡因E3，并盖上培养皿盖子。将含有麻醉后幼虫的 zWEDGI 装置安装到倒置显微镜上，并置于可容纳60毫米玻璃底培养皿的载物台插入装置中。

将幼虫的尾部置于最上方的通道中，必要时旋转培养皿，使尾部处于所需位置。根据具体实验要求对幼虫进行成像。实验结束后，将 zWEDGI 培养皿从显微镜上取下。

根据文本方案移除幼虫和琼脂后，使用乙醇和蒸馏水清洁 zWEDGI（如前所述），并将装置倒置以自然风干。将带盖的装置存放在阴凉、干燥处。此处展示的是利用多光子显微镜对尾鳍中胶原纤维进行二次谐波（SHG）成像的图像，用以说明 zWEDGI 的成像能力。

在损伤之前，二次谐波成像（SHG）检测到胶原纤维从脊索向外辐射延伸至鳍尖。损伤后不久，随着伤口松弛，收缩后鳍尖与鳍中心之间的距离增加。zwEDGI技术能够随时间采集三维数据，从而更全面地展现细胞外基质结构动态变化的过程。

数据采集的三维特性使得可以利用渲染软件进行空间重建。这些重建图像及后续的旋转选项表明，鳍的收缩与舒张不仅发生在图像采集的 XY 平面内，还发生在 Z 轴方向上，因为尾部会从收缩状态的向上卷曲变为扁平。一旦可重复使用的模具打印完成， fabrication 技术可在三到四小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要确保在固化PDMS之前没有气泡残留在其中，并且在尝试从模具中取出器件之前需进行足够长时间的固化。完成该操作后，还可进行其他方法，如局部药物施加、抗体标记或RNA与蛋白质纯化，以回答更多问题，例如药物或抑制剂的存在如何影响伤口愈合。该技术建立后，为伤口愈合领域的研究人员探索斑马鱼幼鱼中的胶原蛋白动态、免疫细胞反应以及组织再生开辟了道路。

观看本视频后，您应能够充分了解如何制备zWEDGI，并将其用于斑马鱼幼鱼的损伤处理及活体成像。请务必注意，光聚合3D打印树脂对人类具有危害性，且对斑马鱼具有毒性。操作未固化的3D打印部件时，必须采取预防措施，例如佩戴手套并使用面罩；在用PDMS填充模具之前，应确保打印件上残留的所有树脂均已完全固化。