Name: 改善斑马鱼幼虫实验操作的长期活体成像装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 了解zWEDGI装置在斑马鱼幼虫伤口愈合研究中的应用，该装置支持高分辨率长期活体成像，可同时实现尾部截断与再生过程观察，为研究胶原纤维重组和细胞响应提供实时动态分析平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢莫格里奇研究所（Morgridge Institute for Research）和光学与计算仪器实验室（Laboratory for Optical and Computational Instrumentation）对本项目的主要资助。我们还感谢美国国立卫生研究院（NIH）基金编号 R01GM102924（AH 和 KWE）的资助。KH、JMS、RS、AH 和 KWE 构思并设计了本研究。KH 和 JMS 在 DL、KP 和 RS 的支持下完成了所有实验。KH、JS、RS、AH 和 KWE 对论文的撰写作出了贡献。

注意：zWEDGI 基础设计适用于受精后 2 至 4 天（dpf）的斑马鱼幼鱼，并遵循威斯康星大学麦迪逊分校实验动物资源中心的指导原则。
1. 模具的设计与3D打印
<ol>
	<li>使用3D建模软件对装置的PDMS部件进行所需几何形状和属性的建模5。创建一个空白模具与PDMS部件的装配体，并通过在模具中生成与PDMS部件相对应的空腔，从而为PDMS部件制作负模。将模具保存为用于3D打印的.stl文件（图2，步骤1.1）。 
	注意：此处展示的模具设计（图1）的立体光刻格式（.stl）文件可从 https://morgridge.org/designs/ 下载。</li>
	<li>使用光敏树脂3D打印机打印模具（图2，步骤1.2）。如有可能，在一次打印中制作多个模具，以便单批PDMS可同时成型多个装置。 
	注意：示例中采用高分辨率模式打印，光束直径为0.075 mm，层厚为0.05 mm，使用光敏树脂材料5。
	<ol>
		<li>使用细毛刷、喷瓶中的变性酒精和压缩空气轻轻刷洗并去除未固化的树脂，清除微通道区域内的任何残留物。</li>
		<li>将模具在紫外后固化装置中每侧各后固化60分钟，因为未固化的树脂对斑马鱼幼体具有毒性10。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在平整表面上使用200目砂纸打磨模具的空腔面，直至所有密封面均与砂纸接触（包括加样通道结构和模具边缘）。随后依次使用400目和600目砂纸轻柔打磨，使所有结构表面形成平滑齐平的表面（图2，步骤1.3）。打磨后使用百分表测量空腔深度，以确认其接近设计深度。
	<ol>
		<li>将模具和盖片（直径1¾英寸、厚度¼英寸的硼硅酸盐玻璃或丙烯酸材质；每个模具配一个玻璃盖片）放入盛有水的超声波清洗机中清洗30分钟，或用流动水冲洗进行清洁。</li>
		<li>用压缩空气吹干，并用异丙醇和过滤后的压缩空气清洁模具和盖片。在洁净台中进行装置制备操作，以最大限度减少空气中颗粒物的污染。将清洗后的模具和玻璃盖片置于洁净台内或加盖培养皿中，待用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. zWEDGI 装置的 PDMS 制备
<ol>
	<li>将PDMS（聚二甲基硅氧烷）按5:1（基础剂与活化剂比例）的比例，取184型硅弹性体基础剂和活化剂倒入塑料杯中。用木制搅拌棒充分混合2分钟，搅拌时将凝胶反复翻转，如同揉面。制作5个模具时，使用10 g基础剂和2 g活化剂。
	<ol>
		<li>将混合物置于真空干燥器中脱气25–45分钟，直至所有气泡完全消失。</li>
		<li>使用10 mL注射器向每个3D打印模具的型腔中注入约0.75 mL PDMS，注至模具略微溢出并形成弯月面为止（图2，步骤2.1）。</li>
		<li>将注满PDMS的模具再次置于真空环境中脱气45分钟，以去除填充过程中可能产生的额外气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将玻璃盖片覆盖在装有PDMS的模具上，以一定角度按压盖片，防止夹入气泡（图2，步骤2.2）。在放置玻璃盖片时，允许多余的PDMS被挤出。</li>
	<li>使用小型棘轮夹具将盖片紧密固定在模具上。 
	注意：此操作可在PDMS固化后形成平整表面，并在3D打印结构与玻璃盖片齐平处形成通孔。或者，为增加一次可固化的器件数量，可构建多夹具装置（例如，图2，步骤2.3）。</li>
	<li>将夹紧后的PDMS器件置于100 oC烘箱中固化90分钟（图2，步骤2.4）。从烘箱中取出模具，冷却至可安全操作的温度。若夹具为金属材质，应将模具与盖片组件从夹具中取出，以防金属残留热量持续加热导致PDMS过度固化。 
	注意：器件在仍微热且未完全固化时最容易脱模。然而，一旦模具从烘箱中取出并移除盖片，器件可在脱模前静置数天。若在从固化烘箱取出后立即进行脱模，应将器件置于带盖培养皿中，以减少污染，同时允许其完全固化。</li>
</ol>
3. 将 zWEDGI 等离子体键合至玻璃培养皿
<ol>
	<li>将含有PDMS装置的模具用台钳夹紧，使模具的结构面朝上，与工作台面平行。
	<ol>
		<li>使用平头镊子从模具上松开PDMS拉片，开始取出PDMS装置。用镊子沿模具边缘操作（类似于将蛋糕从烤盘中取出）（图2，步骤3.1）。</li>
		<li>用过滤的压缩空气和镊子轻轻抓住拉片，并向装置下方吹气，将装置从模具中缓慢取出。操作时应缓慢进行，让空气帮助PDMS与模具分离，特别注意在薄壁隧道区域操作镊子时要格外小心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将PDMS装置倒置放置在玻璃底培养皿盖的内侧，使限位隧道楔形部分接触塑料表面（图2，步骤3.2）。</li>
	<li>将带有倒置zwedgi装置的培养皿盖及其对应的玻璃底培养皿放入等离子清洗仪中，使内侧玻璃面朝上（图2，步骤3.3）。
	<ol>
		<li>抽真空至等离子清洗腔室压力达到500 mTorr。</li>
		<li>将射频（RF）功率设为高，使装置和培养皿暴露于射频下约2分钟。缓慢释放腔室压力，然后将装置和培养皿移回洁净工作台。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从培养皿盖上取下PDMS装置。将PDMS zwedgi装置翻转至正确方向，小心地将其对准玻璃底培养皿的中心孔位放置（图2，步骤3.4）
	<ol>
		<li>使用镊子尾部轻轻按压PDMS装置，确保其下方无气泡残留。在微通道的微小结构周围施加压力，并将PDMS平滑地压向边缘（图5C）。 
		注：PDMS与玻璃之间的完全接触可确保等离子键合更牢固。zwedgi装置也可通过等离子键合固定于其他类型的玻璃底培养皿，例如玻璃底6孔板（图2C）。</li>
		<li>在将装置培养皿从洁净工作台取出前，先在其上方盖上盖子。 
		注：一旦装置固定于玻璃表面，该实验流程可暂停，直至准备使用时再继续。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通道准备与幼虫装载
注意：斑马鱼的一般饲养操作按照《斑马鱼手册》进行，该手册可在线获取，网址为 http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html。成年斑马鱼及胚胎的培养条件如前所述1。实验使用野生型 AB 品系。有关活体幼鱼成像的具体要求，请遵循所在机构的动物护理规程。
<ol>
	<li>使用微量移液器通过固定隧道，以每通道至少&#160;100 µL 70%乙醇冲洗通道。吸除乙醇后，用双蒸水冲洗2至3次。静置晾干。</li>
	<li>将脱脂牛奶（以水稀释至1%浓度）加入通道中，室温孵育10分钟，以减少幼鱼与培养皿玻璃盖玻片之间的黏附。随后，将装置轻轻浸入双蒸水中数次进行冲洗。倒置静置晾干。 
	注意：本步骤可暂停。zwedgi装置的此步预处理可在使用前数天完成。请在室温下加盖保存。</li>
	<li>通过混合100 µL已熔化的2%低熔点（LMP）琼脂糖与100 µL 2x&#160;Tricaine（0.4 mg/mL Tricaine - 乙基-3-氨基苯甲酸酯）溶于E3缓冲液11中，制备1%低熔点琼脂糖溶液，并预先将混合液加热至38 oC。将1%琼脂糖/Tricaine溶液置于加热金属块中维持在38 oC，防止凝固。 
	注意：进行多光子显微成像11时，应使用无色素斑马鱼品系（如casper12），或在E3培养基中添加0.2 mM N-苯基硫脲培养幼鱼，以抑制色素形成11，从而减少色素对近红外波长的吸收。 
	警示：N-苯基硫脲具有毒性。请遵循所在机构的废弃物处理规定。</li>
	<li>将幼鱼置于含0.2 mg/mL Tricaine（Tricaine/E3）的E3缓冲液中麻醉11。等待幼鱼完全静止且对触碰刺激无反应。</li>
	<li>用数微升Tricaine/E3预润湿通道。
	<ol>
		<li>使用宽口移液器吸头吸取单个幼鱼，将其放入加样通道（图3A）。用移液器吸头或类似工具调整幼鱼在加样腔中的方向，使其背侧朝向加样腔较平直的一侧，尾部朝向固定隧道（图3B）。</li>
		<li>小心从损伤腔中抽出液体，使幼鱼流入固定隧道（图3C）。在保持幼鱼周围湿润的同时，吸除大部分液体（图3D）。可轻微倾斜培养皿朝向损伤腔，以辅助该过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将约38 oC的含Tricaine/E3的1% LMP琼脂糖覆盖幼鱼头部，并填满加样腔（图3E）。待琼脂糖凝固，使幼鱼保持在正确位置。根据需要向损伤腔中补充Tricaine/E3以维持湿润。对剩余两个通道重复上述加样过程。</li>
	<li>使用注射器针头小心去除从固定隧道渗入损伤腔的多余琼脂糖（图3F）。根据实验需求，在琼脂糖上方添加Tricaine/E3（用于损伤操作、短期成像或伤口处理隔离），或加满整个培养皿（用于长期成像）。盖上培养皿盖以防止蒸发。此时可对幼鱼进行成像（未损伤状态）或实施损伤处理。</li>
</ol>
5. 幼虫的造伤与成像
<ol>
	<li>使用无菌手术刀片，在脊索后方横切尾鳍11 在伤口室中（图3G，H）。根据需要添加额外的三卡因/E3，并盖上培养皿盖。 
	注意：或者，根据所关注的发育时间窗口，可对幼虫进行损伤处理，随后将其置于 E3 溶液中恢复，并在 28.5 °C 培养箱中继续培养 oC）直至达到所需的成像时间，然后按照上述方法将其载入通道中。</li>
	<li>将麻醉后的幼虫安装到 zWEDGI 装置中，并置于倒置显微镜的载物台插件上，该插件可容纳 60 mm 玻璃底培养皿。将幼虫尾部定位至最上方的通道中，根据需要旋转培养皿，使尾部处于理想位置。根据具体实验要求进行成像。 
	注意：zwEDGI 可广泛应用于高分辨率光学显微成像，包括宽场荧光显微镜和激光扫描显微镜。在对斑马鱼幼鱼进行成像时需考虑多项参数，但具体的成像参数取决于所用仪器、样本及实验条件。本文中，幼鱼尾部在自行搭建的多光子显微镜上进行成像5,11 使用以下参数：40倍长工作距离水浸物镜，890 nm 激光激发，445/20 nm 发射滤光片，分辨率为 512 × 512。</li>
</ol>
6. 实验结束
<ol>
	<li>从显微镜上取下 zWEDGI 培养皿。通过将 zWEDGI 置于冰水浴中或 4 oC 环境下至少 20 分钟，处死幼鱼，并确认其心跳和循环已停止。 
	注意：由于幼鱼被维持在独立的隔间中，可通过镊子或移液器轻轻牵拉琼脂，单独回收每条幼鱼。可将琼脂从头部区域移除，幼鱼可用于后续操作，如固定后进行抗体染色，或用于 RNA 或蛋白质提取。</li>
	<li>在取出幼鱼和琼脂后，按照步骤 4.1 所述方法，用乙醇和蒸馏水清洗 zWEDGI，并倒置晾干。将其存放于阴凉干燥处并加盖保存。下次使用前根据需要重新涂布脱脂牛奶（步骤 4.2）。 
	注意：zWEDGI 可重复使用多次，直至 PDMS 开始从玻璃表面剥离。</li>
</ol>

<ol><li>Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+redox%2C+Src+family+kinase%2C+and+calcium+signaling+integrate+wound+responses+and+tissue+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish.</a> J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).</li>
<li>Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+fin+primordia+of+zebrafish+larvae+regenerate+by+a+similar+growth+control+mechanism+with+adult+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration.</a> Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).</li>
<li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetic+morpholino+approach+using+cardiac+ventricular+injection+to+transfect+multiple+difficult-to-target+tissues+in+the+zebrafish+larva%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva.</a> JoVE. (88), (2014).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+C+%22Live+Imaging+in+Zebrafish%3A+Insights+into+Development+and+Disease%22">Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease</a>. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).</li>
<li>Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. , (2016).</li>
<li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> JoVE. (95), (2015).</li>
<li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> JoVE. (26), (2009).</li>
<li>Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCORE+imaging%3A+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li>
<li>Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+biocompatibility+of+3D+printed+photopolymers+using+zebrafish+embryo+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays.</a> Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).</li>
<li>LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+microscopy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation microscopy in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+Adult+Zebrafish+as+a+Tool+for+In+Vivo+Transplantation+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+9+modulates+collagen+matrices+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair.</a> Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

zWEDGI 装置的目的是通过稳定和定向斑马鱼，使其位于高分辨率显微镜物镜的小工作距离内，从而实现三维时间序列成像。在满足这些设计要求的同时，该装置也改进了传统的基于琼脂的活体成像制备方法。zWEDGI 的制备包含三个关键步骤（如下所述），若任一步骤操作不当，均可能导致装置缺陷：
PDMS 制备（图 5A）
为防止产生气泡，在向模具中加入PDMS后应对模具进行脱气处理。脱气完成后，需检查所有气泡是否均已消除，并特别注意玻璃圆片的放置方式。放置玻璃圆片时必须倾斜操作，以确保PDMS内部及下方不会截留空气。在整个操作过程中，灰尘可能带来干扰。为防止灰尘污染，每一步清洁操作都应彻底执行，并在各步骤之间将部件存放于洁净罩内。在进行紫外固化前，应检查模具是否存在多余的树脂，以免形成粗糙表面。打磨时，应确保砂纸接触所有几何区域，使所有表面保持平整（图2，步骤1.3）。在将PDMS注入模具前，务必先用异丙醇清洁并用空气吹干...

斑马鱼幼虫的再生能力 斑马鱼 使其成为研究伤口反应以及愈合与再生的理想模式生物1,2,3,4获得多种转基因斑马鱼品系以及斑马鱼在解剖结构上的透明性进一步增强了其在 体内 伤口反应事件以及长期再生过程的研究4因此，利用高分辨率延时荧光显微镜研究这些生物学过程需要一种活体成像斑马鱼装置，该装置可在维持斑马鱼幼体存活的同时，提供高稳定性并最大限度减少其运动。该装置的关键在于能够有效造伤，同时确保愈合与再生过程不受装置干扰。
标准的活体成像稳定方法是在活体成像过程中将幼虫包埋于琼脂糖中，但该方法会限制幼虫生长和伤口再生5 并且可能增加死亡率，因为幼虫在四小时后开始出现心脏应激和组织坏死的迹象4因此，通常需要去除目标区域的琼脂糖，以允许正常的发育和再生6，这会使幼虫在切除琼脂糖时面临潜在损伤。此外，使用琼脂糖包埋技术时，操作者必须在琼脂糖凝固前的短时间内完成幼虫的定位。5,6,7快速操作幼虫不仅需要操作者具备熟练技巧，还可能对幼虫造成损伤。尽管已有用于稳定幼虫以进行活体成像的方法被提出以克服这些缺点，例如带脊状结构的琼脂孔3 或凹痕8，使用硅基真空润滑脂与PVC管材或其他材料构建成像室6，以及旋转培养管9，这些方法中的许多都费时费力、操作繁琐、通常不可重复使用，并且无法实现环境操控（如药物处理、损伤） 等等鱼被固定后。
因此，zWEDGI 装置（图 1）被设计用于克服琼脂糖包埋法在斑马鱼幼鱼长期活体成像中存在的一些缺点，同时允许对样本进行操作。zWEDGI 包含三个半开放的分隔腔室（图 1A），可用于装载、固定、造伤及对受精后 2 至 4 天的斑马鱼幼鱼进行成像。该装置由聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）制成，并放置于 60 mm 玻底成像培养皿的盖玻片上。本文所述设计主要用于伤口愈合研究，但由于采用了模块化设计和标准化制造技术，zWEDGI 的设计可进行修改，适用于多种实验操作，尤其适用于需要在最小限制条件下进行实验干预和长期成像的实验流程。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;制备模具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solidworks Professional Accedemic Research 三维建模软件</td><td>Dassault Systemes</td><td>SPX0117-01</td><td>Fisher Unitech</td></tr><tr><td>Viper Si2 SLA 3D 打印机</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23200-902</td><td>3D Systems Inc.</td></tr><tr><td>Accura 60 光敏树脂</td><td>3D Systems Inc.</td><td>24075-902</td><td>3D Systems Inc.</td></tr><tr><td>变性酒精</td><td>Sunnyside</td><td>5613735</td><td>Menards</td></tr><tr><td>紫外后固化装置</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23363-101-00</td><td>3D Systems Inc.</td></tr><tr><td>TouchNTuff 丁腈手套</td><td>Ansell</td><td>92-600</td><td>McMaster Carr</td></tr><tr><td>220B、400B、600 目 T414 蓝背砂纸&amp;nbsp;</td><td>Norton</td><td>66261139359, 54, 52</td><td>MSC</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃圆片，直径 2&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>MIL-G-47033</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>Branson</td><td>1510R-MTH</td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇擦拭酒精</td><td>Hydrox</td><td>54845T43</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>10 盎司透明塑料杯</td><td>WNA Masterpiece</td><td>557405</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>6&quot; 工艺棒</td><td>Perfect Stix</td><td>Craft WTD-500</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;制备 zWEDGI PDMS 装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件&amp;nbsp;</td><td>Dow-Corning</td><td>4019862</td><td>Ellworth Adhesives&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>305219</td><td>Vitality Medical Inc</td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>F42027-0000</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>4 英寸棘轮式条形夹具</td><td>Pittsburgh</td><td>68974</td><td>Harbor Freight</td></tr><tr><td>实验室烘箱</td><td>Quincy Lab Inc.</td><td>20GC</td><td>Global Industrial</td></tr><tr><td>镊子套装</td><td>Aven</td><td>549825</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>压缩空气过滤喷嘴</td><td>Innotech</td><td>TA-N2-2000FT</td><td>Cleanroom Supply</td></tr><tr><td>真空台钳</td><td>Wilton Tool Group</td><td>63500</td><td>MSC Industrial</td></tr><tr><td>55 mm 玻璃底培养皿；30 mm 微孔 #1.5 盖玻片</td><td>Cellvis</td><td>D60-30-1.5-N</td><td>Cellvis</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Harrick Plasma</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;装载幼虫&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetteman P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇（使用前用水稀释至 70%）</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-5A</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>脱脂奶粉粉末</td><td></td><td>2902887</td><td>MP Biomedicals</td></tr><tr><td>双蒸水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-苯基硫脲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>三卡因（乙基-3-氨基苯甲酸酯）</td><td></td><td>C-FINQ-UE</td><td>Western Chemical</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>加热块（干浴孵育器）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-2</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>E3 缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大孔移液枪头，200 µL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-134</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>通用移液枪头，200 µL</td><td>Fisherbrand</td><td>21-197-8E</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>#15 手术刀片&amp;nbsp;</td><td>Feather</td><td>2976</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>25G 注射器针头</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>BD305122</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 成像软件</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于改进斑马鱼幼鱼实验操作的长期活体成像装置

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

斑马鱼幼体是发育生物学和伤口愈合研究中的重要模式生物。此外，斑马鱼幼体也是在时空维度上以细胞分辨率进行动态生物学现象活体高分辨率显微成像的宝贵系统。然而，传统的琼脂糖包埋活体成像方法可能阻碍幼体发育和组织再生。因此，本文介绍了一种名为 zWEDGI（斑马鱼伤口与固定装置，用于生长与成像）的装置，该装置经过设计与制造，具有功能分区结构，可固定幼体以进行高分辨率显微镜观察，同时允许在装置内完成尾鳍截断操作，并支持尾部后续不受限制的发育与再生。该装置可在维持幼体存活的同时实现伤口处理和长期成像。由于 zWEDGI 模具采用 3D 打印技术制造，其几何结构具有可定制性，可根据多种斑马鱼成像应用需求进行便捷修改。此外，zWEDGI 具备多种优势，包括实验过程中可接触幼体以进行造伤或试剂添加、多个幼体平行排列以实现高效成像，以及装置的可重复使用性。

zWEDGI PDMS 微流控装置是一种功能分区装置，专为斑马鱼幼鱼尾鳍损伤修复与再生过程的活体成像所需的四项主要功能（如下所列）而设计。选择 PDMS 用于 zWEDGI 的制备，不仅因为其易于获取且是生物相容性方面的行业标准材料，还因其在模具成型中具有良好的加工性能。此外，PDMS 在装置成型后可实现重复使用，并避免产生坚硬或锋利的边缘。zWEDGI 装置具体可实现以下功能：1）将幼鱼装载入装置中，2）以适合成像的正确方向固定幼鱼，3）对尾鳍进行损伤处理，以及 4）显微成像，下文将对这些步骤进行详细描述。
加载中
zwedgi 设计包含 3 个通道，每个通道用于固定一条幼虫图1B）。对于幼虫的装载和初始定位，开放的装载室宽度为 3 mm（<strong class="x...

本文描述了 zWEDGI（斑马鱼损伤与固定装置，用于生长与成像），这是一种分区装置，旨在对斑马鱼幼体进行定向和固定。该设计允许进行尾部横切，并可长期采集伤口愈合与再生过程的高分辨率荧光显微图像。

斑马鱼幼体是发育生物学和伤口愈合研究的重要模式生物。此外，斑马鱼幼体也是一个有价值的系统，用于……

本成像装置制备的总体目标是构建一个可调节的平台，用于对活体斑马鱼幼虫的伤口愈合过程进行显微分析。该方法有助于回答伤口愈合领域的一些关键问题，例如胶原纤维重组和细胞反应在损伤后组织再生过程中所起的作用。该技术的主要优势在于，创伤诱导和成像均在同一装置内完成，同时该装置不会阻碍尾部的再生生长。此外，可独立修改 zWEDGI 的多个功能区室，以适应不同的幼虫发育阶段和多种实验方案。首先，根据文本方案中描述的几何形状和特性，对装置的 PDMS 部分进行建模。使用光敏树脂 3D 打印机打印模具后，用细刷、喷雾瓶中的变性酒精和压缩空气清洁模具。轻轻擦洗并去除未固化的树脂，特别是微通道区域的任何材料。然后将模具在紫外光后固化装置中每侧各后固化60分钟，因为未固化的树脂对斑马鱼幼鱼具有毒性。使用200目的砂纸，在平面上打磨模具的型腔侧面，直至所有顶面均与砂纸接触。使用400目和600目砂纸依次轻轻打磨，使模具所有几何表面形成光滑、齐平的表面。然后使用百分表测量打磨后型腔的深度，以确认其接近设计深度。将模具和玻璃盖片放入盛有水的超声波清洗器中清洗30分钟，或用流动水冲洗，以清洁表面。使用异丙醇和过滤压缩空气清洁并吹干模具和盖片。准备一个洁净台作为装置制备的场所，以尽量减少空气中微粒造成的污染。将PDMS基础剂与活化剂按5:1的比例倒入塑料杯中混合均匀以制备PDMS。用木质压舌板充分搅拌约两分钟，像揉面团一样将凝胶反复折叠搅拌。随后将混合物置于真空干燥器中脱气 25 至 45 分钟，直至所有气泡完全消失。然后，使用 10 毫升注射器，向每个 3D 打印模具的型腔中注入约 0.75 毫升 PDMS，直至模具略微溢出并形成弯月面。将注满的模具脱气45分钟，以去除填充过程中可能产生的额外气泡。将玻璃盖片置于装有PDMS的模具顶部，以一定角度按压盖片，防止夹入气泡。在放置玻璃盖片时，让多余的PDMS被挤出。然后，使用小型棘轮夹具将盖片紧密固定在模具上。为提高效率，可使用多夹具装置。将PDMS器件与夹紧的模具置于烘箱中，在100摄氏度下固化至少90分钟。然后，将模具从烤箱中取出，静置冷却至可安全操作。将含有固化PDMS器件的模具用台钳夹紧，使模具的结构面朝上，与工作台面平行。使用平头镊子从模具上开始剥离PDMS器件，先将PDMS拉片从模具中释放。然后，使用镊子沿模具边缘操作。PDMS 必须在 100 摄氏度下至少固化 90 分钟，否则会保持黏性并粘附在模具上。判断设备是否已充分固化的一个良好迹象是：你会在模具与 PDMS 装置之间的界面处观察到一个气泡，这表明装置将能够轻松脱模。使用过滤的压缩空气和镊子，握住拉片并向装置下方吹入空气，从而将装置轻轻从模具中抬起。接着，将PDMS装置倒置放置在玻璃底培养皿盖的内侧，使限位隧道楔形部分接触塑料表面。然后，将带有倒置zwEDGI的培养皿盖及对应的玻璃底培养皿放入等离子清洗仪中，使内侧玻璃面朝上。将等离子清洗室抽真空，直至压力达到500毫托。将射频（RF）功率调至高，使器件和培养皿暴露于射频下约两分钟。然后缓慢释放腔室压力，并将器件和培养皿放回洁净室的超净工作台中。从培养皿盖上取下PDMS装置。然后，将PDMS zWEDGI小心地翻转并正确放置在玻璃表面，使其对准玻璃底培养皿的中心孔。为确保PDMS与玻璃充分贴合，使用镊子的尾端在微通道的微小结构周围施加压力，将PDMS从中心向边缘抚平。轻轻按压PDMS装置，确保装置下方没有气泡滞留。向培养皿中加入70%乙醇，使用微量移液器冲洗通道，包括约束隧道内的通道。随后移除乙醇，用双蒸水冲洗装置两到三次，然后静置使其自然晾干。用脱脂牛奶填充通道，并在室温下孵育装置10分钟，以尽量减少幼虫对培养皿玻璃盖玻片的黏附。然后，将装置在双蒸水中轻轻浸没数次以清洗，并将其倒置晾干。根据文本方案麻醉幼虫后，使用几微升三卡因E3溶液预润湿装置的通道。使用宽孔径的移液枪头吸取单个幼虫，并将其放入加样通道中。然后，用移液枪头或类似工具将幼虫在加样室中调整方向，使其背侧朝向加样室较平直的一侧，尾部朝向固定隧道。小心地从损伤室中吸出液体，使幼虫缓缓流入固定隧道内。在保持幼虫周围湿润的同时，移除大部分液体。在移除大部分液体的过程中，必须将幼虫正确地定向放入固定通道中，但幼虫周围需保留足够的液体。在加入琼脂糖后可调整方向，但必须在琼脂糖凝固前完成。用移液器将1%低熔点琼脂糖（LMP agarose）加入三卡因E3溶液中，覆盖幼鱼头部，填满加样室，并让琼脂糖在幼鱼处于正确位置时凝固。根据需要向损伤室中添加三卡因E3溶液，以保持湿润。然后，对剩余的两个通道重复此加样过程。使用注射器针头，小心移除从限制隧道渗入损伤室的琼脂糖。若需进行损伤处理、短期成像或隔离伤口处理，可在琼脂糖上方再加入更多的三卡因E3溶液。为了在损伤室中对幼虫进行损伤，使用无菌手术刀片在脊索后方横切尾鳍。如有需要，可补充三卡因E3，并盖上培养皿盖子。将含有麻醉后幼虫的 zWEDGI 装置安装到倒置显微镜上，并置于可容纳60毫米玻璃底培养皿的载物台插入装置中。将幼虫的尾部置于最上方的通道中，必要时旋转培养皿，使尾部处于所需位置。根据具体实验要求对幼虫进行成像。实验结束后，将 zWEDGI 培养皿从显微镜上取下。根据文本方案移除幼虫和琼脂后，使用乙醇和蒸馏水清洁 zWEDGI（如前所述），并将装置倒置以自然风干。将带盖的装置存放在阴凉、干燥处。此处展示的是利用多光子显微镜对尾鳍中胶原纤维进行二次谐波（SHG）成像的图像，用以说明 zWEDGI 的成像能力。在损伤之前，二次谐波成像（SHG）检测到胶原纤维从脊索向外辐射延伸至鳍尖。损伤后不久，随着伤口松弛，收缩后鳍尖与鳍中心之间的距离增加。zwEDGI技术能够随时间采集三维数据，从而更全面地展现细胞外基质结构动态变化的过程。数据采集的三维特性使得可以利用渲染软件进行空间重建。这些重建图像及后续的旋转选项表明，鳍的收缩与舒张不仅发生在图像采集的 XY 平面内，还发生在 Z 轴方向上，因为尾部会从收缩状态的向上卷曲变为扁平。一旦可重复使用的模具打印完成， fabrication 技术可在三到四小时内完成。在进行该操作时，重要的是要确保在固化PDMS之前没有气泡残留在其中，并且在尝试从模具中取出器件之前需进行足够长时间的固化。完成该操作后，还可进行其他方法，如局部药物施加、抗体标记或RNA与蛋白质纯化，以回答更多问题，例如药物或抑制剂的存在如何影响伤口愈合。该技术建立后，为伤口愈合领域的研究人员探索斑马鱼幼鱼中的胶原蛋白动态、免疫细胞反应以及组织再生开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分了解如何制备zWEDGI，并将其用于斑马鱼幼鱼的损伤处理及活体成像。请务必注意，光聚合3D打印树脂对人类具有危害性，且对斑马鱼具有毒性。操作未固化的3D打印部件时，必须采取预防措施，例如佩戴手套并使用面罩；在用PDMS填充模具之前，应确保打印件上残留的所有树脂均已完全固化。

long-term-live-imaging-device-for-improved-experimental-manipulation

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

改善斑马鱼幼虫实验操作的长期活体成像装置

本文介绍了一种用于斑马鱼胚胎的固定方法，适用于长期成像、双光子成像和组织损伤技术，以及延时共聚焦成像。...

双光子轴突切除与活体斑马鱼胚胎的延时共聚焦成像

本实验室开发了一种新型高通量自动成像系统，可用于检测7日龄斑马鱼幼鱼的多种不同行为。该系统适用于在幼鱼暴露于环境毒物或药物后，检测其行为发生的细微变化。...

斑马鱼幼体的自动化高通量行为分析

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

本文介绍了一种通用的固定方法，可在不干扰斑马鱼胚胎正常发育的情况下，实现对活体斑马鱼胚胎后部体轴发育过程的长期延时成像。...

一种用于斑马鱼发育长期成像的通用固定方法

斑马鱼胚胎和幼鱼的显微注射是一种在多种斑马鱼模型中至关重要的技术，但也具有挑战性。本文介绍了一系列微尺度工具，可用于在显微注射和成像过程中辅助稳定和定向斑马鱼样本。...

用于优化斑马鱼幼鱼显微注射与成像的微结构装置

本文介绍了一种用于长时间延时共聚焦显微镜观察的脆弱斑马鱼胚胎固定方法。该低成本方法易于操作，可使用常规的玻璃底培养皿，在任何倒置显微镜上进行成像。固定过程采用不同浓度的琼脂糖分层进行。...

一种用于延长斑马鱼全胚胎共聚焦显微延时成像的分层封片方法

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

斑马鱼在细胞生物学和生理学研究中具有显著的光学透明优势。本文描述了在个体动物中测量细胞生长的可靠方法，这些方法能够提供新的见解，揭示骨骼肌及邻近组织的生长如何与整体身体生长相协调。...

对经历电活动改变的单条活体斑马鱼骨骼肌生长进行实时和重复测量

本文介绍了一种实验方案 体内...

体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

本方案利用光片成像技术研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞追踪和交互式分析深入了解心脏力学特性。...

4D光片成像技术观察斑马鱼心脏收缩

了解zWEDGI装置在斑马鱼幼虫伤口愈合研究中的应用，该装置支持高分辨率长期活体成像，可同时实现尾部截断与再生过程观察，为研究胶原纤维重组和细胞响应提供实时动态分析平台。

用于改进斑马鱼幼鱼实验操作的长期活体成像装置

探索更多视频