改善斑马鱼幼虫实验操作的长期活体成像装置
October 27th, 2017
这份手稿描述了 zWEDGI (斑马鱼伤人和诱捕装置的增长和成像), 这是一个条块分割的装置, 旨在定位和抑制斑马鱼幼虫。该设计允许尾部横断面和长期收集高分辨率的荧光显微图像的伤口愈合和再生。
这种成像设备制造的总体目标是创建一个可修改的平台，用于对活斑马鱼幼虫的伤口愈合进行显微分析。这种方法可以帮助回答伤口愈合领域的关键问题，例如胶原纤维重组和细胞反应对受伤后后续组织再生的贡献是什么。这种技术的主要优点是伤口和成像发生在单个设备中，而尾部再生不受设备阻碍。
此外，zWEDGI 的多个功能区室可以独立修改，以适应不同的幼虫阶段和一系列实验方案。首先，根据文本协议使用所需的几何结构和属性对器件的 PDMS 组件进行建模。使用光敏树脂 3D 打印机打印模具后，使用细刷、喷雾瓶中的变性酒精和压缩空气清洁模具。
轻轻擦洗并去除未固化的树脂，尤其是微通道区域的任何材料。然后，在 UV 后固化装置中将模具每面后固化 60 分钟，因为未固化的树脂对斑马鱼幼虫有毒。使用 200 粒度的砂纸，在平坦的表面上打磨模具的空腔侧，直到所有天花板表面都与砂纸接触。
使用 400 和 600 粒度的砂纸，逐步轻轻打磨，以在模具的所有几何形状面上产生光滑、齐平的表面。然后，使用千分表测量砂磨后的型腔深度，以验证它是否接近设计深度。将模具和玻璃盖盘放入装满水的超声波清洗机中 30 分钟，或在流水下冲洗，以清洁它们。
使用异丙醇和过滤的压缩空气清洁和吹干模具和盖子。准备一个干净的工作台作为制造设备的地方，以最大限度地减少空气中碎屑的污染。通过将底座和活化剂以 5：1 的比例倒入塑料杯中来制作 PDMS。
用木制棒搅拌两分钟，像揉面包一样将凝胶搅拌到自身上。在真空干燥器中对混合物进行脱气 25 到 45 分钟，直到所有气泡都消失。然后，使用 10 毫升注射器，用大约 0.75 毫升的 PDMS 填充每个 3D 打印模具的腔体，直到模具略微溢出弯月面。
将填充的模具脱气 45 分钟，以去除填充时可能形成的额外气泡。将玻璃盖盘放在填充 PDMS 的模具顶部，以一定角度将玻璃盖盘向下压，以防止气泡滞留。在应用玻璃盘盖时，允许排出多余的 PDMS。
然后，使用小棘轮夹将盖盘紧紧地固定在模具上。为了提高效率，可以使用多夹具器件。在 100 摄氏度的烘箱中固化 PDMS 设备和夹紧的模具至少 90 分钟。
然后，从烤箱中取出霉菌，让它们冷却，直到它们可以轻松处理。将包含固化 PDMS 装置的模具夹在台虎钳中，使模具的几何形状朝上，与工作站台架平行。开始使用平头镊子从模具中释放 PDMS 拉丝锥，以去除 PDMS 设备。
然后，用镊子在模具的周边工作。PDMS 必须在 90 摄氏度下固化至少 100 分钟，否则它会保持粘性并粘在模具上。一个很好的迹象表明您已经固化了该设备足够长的时间，您实际上会在模具和 PDMS 设备之间的界面处看到一个气泡，这表明它很容易被去除。
使用过滤的压缩空气和镊子，抓住拉片并在设备下方吹气，轻轻地将设备从模具中提起。接下来，将 PDMS 设备倒置放在玻璃底培养皿盖的内侧，使约束通道楔子接触塑料。然后，将倒置的 zWEDGI 培养皿盖和相应的玻璃底培养皿放入等离子清洁器中，内玻璃杯朝上。
抽空等离子清洗室，直到压力达到 500 毫托。将射频或射频功率设置为高，并将设备和培养皿暴露在射频频率下约两分钟。然后，慢慢给腔室减压，将设备和培养皿放回洁净室罩中。
从培养皿盖上取下 PDMS 设备。然后，将 PDMS zWEDGI 小心地放置在玻璃底皿的中心孔上，将其翻转到玻璃杯上的正确方向。为确保 PDMS 粘附在玻璃上，使用镊子的后端在微通道的微小几何形状周围施加压力，使 PDMS 向边缘平滑。
轻轻按下 PDMS 设备，确保气泡不会滞留在设备下方。向培养皿中加入 70% 乙醇，并使用微量移液管冲洗通道，包括通过约束隧道。然后，去除乙醇，用双蒸水冲洗设备两到三次，然后让其风干。
用脱脂牛奶填充通道，并在室温下孵育设备 10 分钟，以尽量减少幼虫粘附在培养皿的玻璃盖玻片上。然后，将设备轻轻浸入双蒸水中数次冲洗，并倒置风干。根据文本方案麻醉幼虫后，使用几微升三卡因 E3 预润湿装置的通道。
使用宽口移液器吸头，吸取一只幼虫并将其放入加载通道中。然后，使用移液器吸头或类似工具，将幼虫在加载室中定向，使背侧面向加载室的较直边缘，尾部面向约束隧道。小心地从伤痛室中抽出液体，让幼虫流入约束隧道。
去除大部分液体，同时保持幼虫周围的水分。幼虫必须正确定向到约束隧道中，因为大部分液体已被去除。但幼虫周围必须保持足够的液体。
添加琼脂糖后可以调整方向，但必须在琼脂糖凝固之前完成。将三卡因 E3 中的 1% LMP 琼脂糖移液到幼虫头部，填充加载室，让琼脂糖凝固，幼虫处于适当的位置。根据需要将三卡因 E3 添加到伤口室中以保持水合作用。
然后，对其余两个通道重复此加载过程。使用注射器针头，小心地去除通过约束隧道渗入伤腔的任何琼脂糖。对于伤口、短期成像或伤口治疗隔离，在琼脂糖上添加更多的三卡因 E3。
要在伤房中缠绕幼虫，请使用无菌手术刀刀片在脊索后方横切尾鳍。如果需要，添加额外的三卡因 E3 并更换培养皿盖。将带有麻醉幼虫的 zWEDGI 装置安装到倒置显微镜上的载物台插件中，该插件将容纳 60 毫米玻璃底培养皿。
将幼虫的尾巴放在最上面的通道中，根据需要旋转培养皿，使尾巴处于所需位置。根据特定实验的需要对幼虫进行成像。实验结束时，从显微镜下取出 zWEDGI 培养皿。
根据文本方案去除幼虫和琼脂后，如前所述，使用乙醇和蒸馏水清洁 zWEDGI，并将其倒置风干。将被覆盖的设备存放在阴凉干燥的地方。这里显示的是利用多光子显微镜对尾鳍胶原纤维进行二次谐波或 SHG 成像的图像，以说明 zWEDGI 的成像能力。
在受伤之前，SHG 检测到从脊索向外辐射到鳍尖的胶原纤维。受伤后不久，收缩的鳍尖与鳍中心之间的距离随着伤口松弛而增加。zWEDGI 允许随时间收集三维数据，提供更完整的细胞外基质结构中发生的动态变化视图。
数据收集的 3-D 性质允许使用渲染软件进行空间重建。这些重建和随后的旋转选项表明，鳍的收缩和松弛不仅发生在图像集的 XY 平面上，而且发生在 Z 轴上，因为尾巴从收缩状态的向上卷曲变平。打印出可重复使用的模具后，制造技术可以在 3 到 4 小时内完成。
在尝试此程序时，请务必记住，在固化之前没有气泡滞留在 PDMS 中，并在尝试将其从模具中取出之前将设备固化足够长的时间。按照此程序，可以执行其他方法，例如局部药物应用、抗体标记或 RNA 和蛋白质纯化，以回答其他问题，例如药物或抑制剂的存在如何影响伤口愈合。开发后，这项技术为伤口愈合领域的研究人员探索斑马鱼幼虫的胶原蛋白动力学、免疫细胞反应和组织再生铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何制造 zWEDGI 并将其用于斑马鱼幼虫的伤害和实时成像有很好的了解。不要忘记，光敏聚合物 3D 打印树脂对人类有害，对斑马鱼有毒。必须采取预防措施，例如在处理未固化的 3D 打印部件时戴手套和使用口罩，并确保在尝试用 PDMS 填充模具之前，打印件上残留的所有树脂都已固化。
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概述
本手稿描述了zWEDGI（zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging），一种设计用于定向和约束斑马鱼幼虫以进行伤口愈合的高分辨率成像的设备。该方法允许尾部切断和长期观察再生过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 再生医学
背景
- zWEDGI设备促进了活体斑马鱼幼虫伤口愈合的研究。
- 它允许同时进行伤口和成像而不妨碍尾部再生。
- 设备的隔室可以根据不同的实验协议进行修改。
- 这种方法解决了伤后胶原蛋白重组和细胞反应的关键问题。
研究目的
- 创建一个平台用于伤口愈合的显微分析。
- 调查组织再生中各种生物因素的贡献。
- 开发一个适用于不同幼虫阶段和实验需求的多功能设备。
使用的方法
- 根据指定的几何形状建模设备的PDMS组件。
- 使用光聚合物3-D打印机创建模具。
- 用变性酒精和压缩空气清洁模具。
- 实施设备以进行活体斑马鱼幼虫成像。
主要结果
- zWEDGI有效地支持伤口愈合的长期成像。
- 在实验过程中，设备没有阻碍尾部再生。
- 高分辨率图像提供了对愈合过程的洞察。
- 设备的设计允许修改以适应各种实验设置。
结论
- zWEDGI是研究斑马鱼幼虫伤口愈合的有价值工具。
- 该设备使研究人员能够实时探索关键生物过程。
- 未来的研究可以利用这个平台进一步理解组织再生机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution, long-term live imaging of zebrafish larvae using the zWEDGI device enables precise interrogation of wound healing and tissue regeneration mechanisms. This platform supports predictive confidence in early discovery by allowing real-time observation of cellular and extracellular matrix dynamics. Its modularity and reusability position it as a scalable asset for phenotypic screening and mechanistic de-risking in preclinical model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cellular responses and collagen fiber reorganization post-injury.
- Supports functional target validation by permitting manipulation and observation within a single device.
- Facilitates mechanistic de-risking through real-time, longitudinal imaging of regenerative processes.
Screening & Assay Development
- Provides standardized orientation and parallel processing of multiple larvae for reproducible imaging workflows.
- Allows for quantitative, high-content imaging outputs suitable for downstream analysis.
- Streamlines assay development by integrating wounding, treatment application, and imaging in one platform.
Translational & Preclinical Research
- Offers a disease-relevant system for studying tissue regrowth and wound healing dynamics.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting diverse experimental protocols.
- Permits integration of drug application and biomarker analysis within live imaging workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The zWEDGI device fits within the early discovery to preclinical continuum, supporting hypothesis-driven research and assay development for regenerative biology and wound healing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular and matrix responses to injury in vivo.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables 3D spatial reconstruction and time-lapse analysis of regenerative processes.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery and validation in a live vertebrate model.
- Enterprise Reuse: Modular design allows adaptation for various larval stages and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in regenerative studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in live imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative targets and therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, live imaging, and device fabrication.
- Needs access to 3D printing, PDMS molding, and advanced microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for device preparation and imaging protocols.
- Adaptable across larval stages and experimental designs due to modular compartments.
- Careful handling of photopolymer resins and device cleaning is essential for viability and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Design and 3D Printing of Molds
2:57
PDMS Fabrication of zWEDGI Device
4:43
Plasma-bonding zWEDGI to Glass Dish
7:19
Channel Preparation and Loading Larvae
9:52
Wounding and Imaging Larvae and End of Experiment
11:14
Results: Post Wound Live Imaging and 3D Reconstruction of Zebrafish Larvae Tail Fin
12:36
Conclusion
