基于状的不均匀 Nanopatterns 对局部控制表面粘附的研究--一种直接软骨分化的方法

该协议的总体目标是获得基于大规模树状大分子的不均匀纳米图案，允许对局部表面粘附性进行纳米级控制。所描述的方法适用于细胞粘附和软骨形成分化的研究。树状大分子凸起的纳米图案允许在纳米尺度上局部控制表面粘附性。

使用细胞粘合剂 RGD 肽修饰的第一代多纳米聚合物来创建纳米图案。它们的特征是每次显微镜扫描技术，并用于细胞粘附和分化研究。然后我们分析显微镜和免疫染色技术的结果。

第一步是准备工作基材。定制的方形载玻片是通过用金刚石刀头切割显微镜载玻片来生产的。制作 1.25 x 1.25 厘米大小的幻灯片。

用去离子水清洗载玻片，然后用 96% 乙醇清洗载玻片，然后让它们风干。向压力管中加入 200 毫克 PLLA 并加入 10 毫升二恶烷，制备 2% PLLA 溶液。加入搅拌棒并拧紧试管。

在 60 摄氏度的甘油浴中轻轻搅拌，将混合物加热 24 小时。将载玻片放入装有 PLLA 溶液的玻璃瓶中，放在 60 摄氏度的干净热板上。等待至少 10 分钟以达到必要的温度。

通过将载玻片放在旋涂机载物台上并运行选定的程序，使用 PLLA 解决方案对玻璃基板进行旋涂。我们选择 3， 000 rpm 持续 30 秒，加速度为每秒 1， 500 rpm，前步为 500 rpm，以每秒 300 rpm 的速度在 5 秒内进行，以确保均匀的涂层。旋转涂层玻璃杯可以存放在冰箱中。

制备并超声处理溶液 A，即 0.77 毫克/毫升的 RGD-Cys-D1 树枝状大分子在去离子水中溶液，反应 10 分钟。然后在去离子水中分别制备 10 至 2% 和 10 至 5% 溶液 B 和 C 的树枝状聚合物溶液。对溶液 C 进行超声处理 10 分钟，并在去离子水中制备以下树枝状聚合物溶液 D、E 和 F。

溶液 D，2.5x10 至 8%溶液 E，10 至 8% 和溶液 F，4 10 至 9%将这些溶液保存在冰箱中直至使用。您毕业时，使用细胞培养舱 18 个 PLLA 涂层玻璃的紫外灯 13 分钟，使其无菌。对每种树枝状聚合物溶液进行超声处理 10 分钟。

在细胞培养舱层流下，通过 PLLA 涂层载玻片上 0.22 微米直径的过滤器过滤树状大分子溶液。将它们在室温下放在机舱内 16 小时，然后用无菌去离子水清洗。对于阳性对照样品，在 PBS 中制备无菌纤连蛋白溶液，并在细胞培养室中将复制品与该溶液在室温下孵育 1 小时。

用 PBS 清洗它们。其余三种 PLLA 包被底物将用作阴性对照的复制品。纳米图案形貌是在空气中以轻敲模式运行的 AFM 分析的。

将弹簧常数为每米 40 牛顿、谐振频率为 300 kHz 的硅悬臂安装到 AFM 针尖支架中。将纳米图案衬底放在 AFM 载物台上，接近表面直至接触，并选择一个振幅设定点，该设定点允许在不对表面施加过大压力的情况下对树枝状大分子构型进行成像。每个条件下三个独立基板的每个基板至少注册三个 5x5 微米的代表性图像。

使用 AFM 处理软件处理采集的图像。在处理后的 AFM 高度图像上选择树状聚合物，并获得相应的图像阈值。获取粒子精度并使用它们来获得最小粒子间距离。

设 Z 中的最小粒子间距离到相应的粒子精度，以获得最小粒子间距离的概率控制栓。调整绘图的色标以可视化局部 RGD 表面密度低于 70 纳米的区域。通过在图像上选择这些区域并生成阈值来量化这些区域的面积。

使用来自早期传代间充质干细胞的商业人脂肪，最好低于 5。在 37 度和 4.6% CO2 气氛中，在干细胞生长培养基中培养它们，直到达到 70% 或 80% 汇合。将细胞以每平方厘米 3， 000 个细胞的细胞密度接种在软骨形成诱导培养基中的底物上。

每三天更换一次培养基。从培养的第一天就可以观察到缩合步骤，在所有培养实验室中，可以使用光学相差显微镜跟踪其演变。在室温下用 10% 福尔马林溶液固定细胞 20 分钟，然后用 PBS 洗涤。

通过在 PBS 中加入 50 毫摩尔的氯化铵溶液来锁定糠醛基团。在室温下放置 20 分钟。用 PBS 洗涤。

在室温下，用 0.1% 皂苷溶液和 1% 白蛋白的 PBS 溶液封闭溶液透化细胞 10 分钟。在室温下与封闭液中的一抗孵育 1 小时。用 PBS 洗涤。

在封闭溶液中与二抗在室温下孵育一小时，避免光照。用 PBS 洗涤并干燥。在样品上涂抹显微镜封固剂，并用盖玻片轻轻覆盖。

使用正置共聚焦显微镜对软骨形成诱导 5 天后粘着斑蛋白桩蛋白的免疫染色样品进行成像，并在软骨形成诱导 5 天后对早期软骨形成标志物胶原蛋白 II α I 进行成像。以具有代表性的间隔收集切片，例如 0.5 或 1 微米。从细胞凝聚物的基底区过滤桩蛋白染色的图像。

去除背景，平滑并转换为八位文件。通过设置经验选择的阈值使它们成为二进制。每个条件的三个独立样品至少处理三个细胞缩合物。

量化所选区域并将它们表示为相应的面积百分比除以图像中细胞核的数量。要量化胶原蛋白 II α I 染色，请创建共聚焦 Z 投影。过滤生成的图像，删除背景，平滑并设置阈值。

量化每个样品的投影面积、最大胶原蛋白 II α I 面积与相应细胞凝聚物面积的总和。可以通过改变溶液中的初始树枝状聚合物浓度来获得不同的纳米图案构型。纳米图案可以通过 AFM 分析和概率等值线图来可视化，以获得构建的最小粒子间距离。

它们突出显示了曲面上具有最高局部 RGD 表面密度的区域。树状大分子纳米图案用于细胞粘附研究。粘附力随着局部 RGD 表面密度的增加而增加。

对于阳性对照和含有树状大分子聚集体的表面，这种相关性丢失。在软骨形成中测试了局部 RGD 表面密度的影响，细胞凝聚和分化都受到呈现中等粘附性的纳米图案的青睐。总之，基于树突大分子的纳米图案采用三表方法解决局部 RGD 密度对细胞反应的影响。

纳米图案在细胞培养中常用的相应均质表面上更有效地维持细胞粘附。在分化实验中，细胞对底物的中等粘附性有利于间充质细胞浓缩和早期成年分化。由于树突大分子外周生长的容易修饰，此处描述的方法可以进一步扩展到所有对细胞有密度影响的过度风湿层。