Name: 基于状的不均匀 Nanopatterns 对局部控制表面粘附的研究--一种直接软骨分化的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 46 s
Description: 学习利用树枝状聚合物纳米图案实现纳米级表面粘附性局部控制的方法，研究RGD表面密度对细胞粘附及软骨分化的影响。该技术为组织工程和再生医学提供了重要应用前景。

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作者感谢 Oriol Font-Bach 和 Albert G. Castaño 在 dmin 定量分析方面的帮助。作者还感谢巴塞罗那生物医学研究所（IRB Barcelona）先进数字显微镜单元允许作者在其设施内录制视频。本工作由西班牙生物医学研究网络中心（CIBER）提供资助。CIBER 是由 2008–2011 年第六个国家级研发与创新计划（VI National R&amp;D&amp;i Plan）、Iniciativa Ingenio 2010、Consolider 计划、CIBER 行动项目以及卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）发起并资助的项目，同时获得欧洲区域发展基金的支持。本研究还得到加泰罗尼亚自治区创新、大学与企业部大学与科研委员会（2014 SGR 1442）的资助。此外，本研究也获得了西班牙经济与竞争力部资助的项目 OLIGOCODES（编号 MAT2012-38573-C02）和 CTQ2013-41339-P，以及 INTERREG V-A 西班牙-葡萄牙 2014–2020 年跨境合作项目（POCTEP，编号 0245_IBEROS_1_E）的支持。C.R.P. 感谢西班牙经济与竞争力部提供的基金资助（编号 IFI15/00151）。

1. 底物制备
<ol>
	<li>在云母基底上退火 1.4 x 1.1 cm 的 Au(111)。
	<ol>
		<li>将 Au(111) 基底放置在玻璃陶瓷炉灶上，用丁烷火焰退火 3 分钟。在氩气气氛下让基底冷却。对每一块 Au(111) 基底重复此步骤。 
		注意：Au(111) 基底应在退火后立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚左旋乳酸 (PLLA) 涂层玻璃基底的制备。
	<ol>
		<li>切割并清洗玻璃载片。
		<ol>
			<li>使用金刚石尖切割器将显微镜载片切割成 18 片 1.25 cm x 1.25 cm 的小片。在每片载片的下侧做一个小凹痕，以便后续区分上下表面。</li>
			<li>先用去离子水彻底清洗载片，再用 96% 乙醇清洗。让其自然晾干。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备 2% PLLA 溶液。
		<ol>
			<li>将 200 mg PLLA 加入装有 10 mL 1,4-二氧六环的压力管中。加入搅拌子并紧密封口。</li>
			<li>将压力管置于加热板上的甘油浴中，在 60 °C 下温和搅拌 24 小时，然后将溶液转移至 15 mL 玻璃小瓶中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 PLLA 溶液涂覆玻璃载片。
		<ol>
			<li>将玻璃载片和装有 PLLA 溶液的小瓶置于洁净的 60 °C 热板上。确保载片朝上放置，并至少保持 10 分钟以达到所需温度。</li>
			<li>准备旋涂仪，并设置 表 1 中指定的程序。</li>
			<li>使用真空系统将其中一片载片正面朝上固定在旋涂仪上。用巴斯德移液管将 0.25 mL PLLA 溶液滴加到载片上，确保整个表面被覆盖。运行涂覆程序。对每一片载片重复此步骤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 树状大分子纳米图案化
<ol>
	<li>RGD功能化树状大分子（RGD-Cys-D1）溶液的制备28
	<ol>
		<li>将5 mg树状大分子溶解于6.494 mL去离子水中。此为溶液A。 
		注意：树状大分子储备溶液应在配制后6个月内使用。</li>
		<li>将溶液A超声处理10分钟，并根据表2配制溶液B和C。</li>
		<li>将溶液C超声处理10分钟，并根据表2配制溶液D、E和F。</li>
		<li>将溶液B、C、D、E和F储存于4 °C待用。溶液A可储存于-20 °C以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在基底上对RGD-Cys-D1树状大分子进行纳米图案化
	<ol>
		<li>在组织培养超净台中，将基底用紫外光照射13分钟以进行灭菌。 
		注意：此步骤仅在将纳米图案化基底用作细胞培养基底时需要。在此情况下，后续步骤应保持无菌条件（组织培养超净台、无菌材料、溶液及操作技术）。</li>
		<li>用镊子小心操作，将每块基底正面朝上放置于培养板的孔中。</li>
		<li>将溶液B、C、D、E和F分别超声处理10分钟。</li>
		<li>使用注射器将RGD-Cys-D1树状大分子溶液通过0.22 µm孔径滤膜直接加入含有基底的孔中（每孔2 mL）。建议每个树状大分子浓度设置至少三个重复。封闭并密封培养板，在室温（RT）下静置16小时。</li>
		<li>移除并弃去溶液，用无菌去离子水清洗基底并干燥。将基底储存于4 °C。 
		注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 对照底物的制备
注意：所有步骤均在无菌细胞培养罩内进行，仅使用无菌材料、溶液和无菌技术。至少使用六种对照基质（阳性对照三个重复，阴性对照三个重复）。
<ol>
	<li>在组织培养罩内，用紫外光照射基底13分钟以进行灭菌。</li>
	<li>成纤维细胞黏附实验的对照基底。
	<ol>
		<li>使用火焰退火的Au(111)基底作为阴性对照。金具有已知的蛋白质变性效应，可赋予其抗细胞黏附特性28。所有溶液在用于基底孵育前需进行超声处理并过滤。</li>
		<li>对于阳性对照，将火焰退火的Au(111)基底浸入含有RGD修饰的PEG硫醇（Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-乙二醇单-11-巯基十一烷酰胺，RGD-PEG-SH）30 和三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚（PEG-SH）的96%乙醇溶液中，两者摩尔比为1:100，在室温下孵育16小时。</li>
		<li>用乙醇充分清洗基底，并用氩气吹干。将基底储存于4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软骨形成实验的对照基底。
	<ol>
		<li>使用未经处理的PLLA基底作为阴性对照。未经任何表面处理的PLLA与活细胞的相互作用较差31。</li>
		<li>对于阳性对照，配制5 mL浓度为0.1 mg/mL的纤连蛋白磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，并在室温下将每块PLLA基底与1.6 mL该纤连蛋白溶液孵育1小时。</li>
		<li>移除并弃去纤连蛋白溶液，用PBS清洗基底。将基底储存于4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 表面表征
<ol>
	<li>原子力显微镜成像
	<ol>
		<li>对PLLA基底进行原子力显微镜（AFM）成像，以进行粗糙度分析。由于树枝状大分子的直径为4-5 nm，为实现纳米图案的清晰可视化，应获得约1 nm的粗糙度值。同时，对纳米图案进行AFM成像。上述两种情况均需在空气中以轻敲模式进行AFM成像。</li>
		<li>选择一个弹簧常数k = 40 N/m、共振频率ν = 300 kHz的硅悬臂梁，并将其安装到AFM设备上。</li>
		<li>将样品安装至原子力显微镜的载物台上。根据仪器的具体配置，调谐和成像参数可能有所不同，请参考制造商提供的操作手册。</li>
		<li>使显微镜探针尖端接近样品直至接触。</li>
		<li>为进行PLLA粗糙度分析，从三个独立制备的基底中，每个基底选取至少四个20×20 µm的代表性区域进行成像。为成像树枝状大分子纳米图案，针对每种条件（溶液中初始树枝状大分子浓度），从三个独立制备的基底中，每个基底选取至少三个5×5 µm的代表性区域进行成像。为避免成像过程中损伤树枝状大分子层，应调节设定点以使作用力保持在最低水平。 
		注：成像区域的选择还取决于压电扫描器的工作范围。请参考仪器手册中的相关说明。</li>
		<li>使用AFM设备制造商提供的专用软件，通过将每条扫描线拟合至多项式调平函数来处理AFM高度图像，并分析PLLA图像以计算表面粗糙度。均方根（RMS）分析可作为合适的方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>局部RGD表面密度测量
	<ol>
		<li>对处理后的AFM高度图像设定图像阈值，以识别表面的树枝状大分子。</li>
		<li>使用图像处理软件确定颗粒位置，并据此计算最小颗粒间距（dmin）。</li>
		<li>将dmin值沿z方向对应其颗粒位置进行绘图，以获得dmin的概率等高线图。调整图中颜色标尺，以可视化局部RGD表面密度最高的区域（dmin &#60; 70 nm）。</li>
		<li>使用图像处理软件量化局部RGD表面密度最高区域的面积。计算中应包含树枝状大分子聚集体的面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描隧道显微镜成像 
	注：扫描隧道显微镜（STM）成像仅适用于导电Au(111)基底上的纳米图案。测量在空气中进行。
	<ol>
		<li>将带有纳米图案的基底放入STM设备的样品 holder 中。使用测试仪检查样品与holder之间的电连接。</li>
		<li>对选定的探针材料（即 Pt 0.8: Ir 0.2）进行蚀刻，使其尖端直径适合安装在STM设备的探头端。蚀刻可通过手动切割或电化学蚀刻完成。32 
		注：电化学蚀刻可获得更对称的尖端。</li>
		<li>将探针安装至STM设备的探头端，并连接样品。</li>
		<li>在反馈通道中设置&#34;电流&#34;（在此类测量中，通过反馈调节保持电流恒定）。调节偏压、电流设定值和扫描尺寸，以便在探针接触后获得清晰的图像。 
		注：成像区域的选择还取决于压电扫描器的工作范围。请参考仪器手册中的相关说明。</li>
		<li>使用STM设备制造商提供的专用软件，通过将每条扫描线拟合至多项式调平函数来处理STM形貌图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接触角测量
	<ol>
		<li>使用光学接触角测量系统，通过静滴法在每种条件（溶液中初始树枝状大分子浓度）下，对三个独立制备的基底上各三个不同位置测量纳米图案化基底的接触角（CA）。</li>
		<li>用去离子水填充微量注射器，并在接触角测量软件中设置参数，以生成体积为1 µL的液滴。</li>
		<li>将样品放置在载物台上，确保样品表面在计算机屏幕上清晰可见，以便成像。</li>
		<li>使用显微操作器移动注射器，使其接近样品表面，并将液滴释放至表面。在液滴稳定后立即记录图像。 
		注：在接触角测量中，控制环境湿度对于获得可重复的结果至关重要。</li>
		<li>使用接触角测量设备制造商提供的专用软件分析测得的接触角。拟合方法可根据用户需求进行调整，椭圆拟合法可作为一种选择。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞培养
注意：所有步骤均在组织培养罩内进行，且仅使用无菌材料、溶液和无菌技术。
<ol>
	<li>成纤维细胞黏附实验。
	<ol>
		<li>在37 °C、4.6% CO2条件下，使用含高糖的基础培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和1%丙酮酸钠（生长培养基），培养早期代次（&#60; 10）的NIH 3T3小鼠胚胎成纤维细胞。建议使用T75培养瓶，每瓶接种500,000个细胞，加入10 mL生长培养基。</li>
		<li>每隔2天用10 mL移液管吸除旧培养基，并更换为10 mL新配制的生长培养基。</li>
		<li>在生长培养基中培养细胞至约80%汇合度，吸除培养基后每瓶加入5 mL胰蛋白酶溶液。为确保细胞充分从瓶底脱离，将胰蛋白酶溶液在37 °C下与细胞作用5分钟。</li>
		<li>每瓶加入5 mL生长培养基终止消化，并将细胞收集至离心管中。在470 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL生长培养基中。使用血细胞计数板测定细胞浓度。</li>
		<li>将基材转移至未经组织培养处理的培养板（非黏附性）中。</li>
		<li>以4,000个细胞/cm2的密度将细胞接种于基材上，加入生长培养基，在37 °C、10% CO2条件下孵育4.5小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>间充质干细胞的软骨诱导分化。
	<ol>
		<li>在37 °C、4.6% CO2条件下，使用间充质干细胞生长培养基（MSC生长培养基）培养早期代次（&#60;5）的人源间充质干细胞。建议使用T75培养瓶，每瓶接种500,000个细胞，加入10 mL生长培养基。</li>
		<li>每隔3天更换一次培养基（操作同5.1.2所述）。</li>
		<li>在细胞达到80%汇合度前进行胰蛋白酶消化，并离心后重悬于MSC生长培养基中（操作同5.1.3所述）。使用血细胞计数板测定细胞浓度。</li>
		<li>再次离心细胞，并将其重悬于10 mL软骨诱导培养基中。</li>
		<li>将基材从原培养板转移至未经组织培养处理的新培养板（非黏附性）中。以3,000个细胞/cm2的密度将细胞接种于基材上。</li>
		<li>每隔3天更换一次软骨诱导培养基（操作同5.1.2所述）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 细胞固定与免疫染色
注意：以下步骤可在非无菌条件下进行。
<ol>
	<li>吸除培养基，用 PBS 轻轻洗涤细胞。加入 10% 甲醛溶液，在室温下固定 20 分钟。</li>
	<li>移除甲醛溶液，并用 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>通过加入50 mM氯化铵（NH₄Cl）溶液封闭游离醛基4Cl) 的 PBS 中，室温孵育 20 分钟。移除 NH4Cl 溶液，用 PBS 洗涤细胞。 
	注意：此处可暂停实验方案。将样品置于 4 °C 的 PBS 中保存。</li>
	<li>移除 PBS，加入含 0.1% 皂苷的封闭液（PBS 中含 1% 牛血清白蛋白）于室温孵育 10 分钟以透化细胞。用 PBS 洗涤细胞，将样本转移至新的孔板中。</li>
	<li>将细胞与封闭液中的初级抗体溶液共同孵育（表3在室温下孵育1小时。然后，移除一抗溶液，并用PBS洗涤细胞。</li>
	<li>在封闭液中加入二抗孵育细胞（表3室温下孵育1小时。 
	注意：避免光照。</li>
	<li>去除二抗溶液，用 PBS 洗涤细胞并干燥。 
	注意：此处可暂停实验方案。将样品置于4 °C避光保存于PBS中。</li>
	<li>显微镜观察样品封片：使用金刚石刀头将盖玻片切割成1.25 cm × 1.25 cm大小。在样品上滴加50 µL显微镜封片介质，轻轻覆盖切割好的盖玻片。</li>
	<li>将样品转移至合适的容器中，用铝箔覆盖，并在4 °C避光保存直至观察。</li>
</ol>
7. 细胞成像与数据分析
注意：对于不透明的 Au(111) 和基于厚显微载片的基底，必须使用直立显微镜。
<ol>
	<li>成纤维细胞黏附实验。
	<ol>
		<li>使用配备数码相机以及低倍（即10X）和高倍（即40X）物镜的落射荧光显微镜。在空气中进行测量。</li>
		<li>将样品置于载物台上，使用10X物镜，通过紫外激发、长通发射滤光片对细胞核进行成像，以观察Hoechst/DAPI染色。</li>
		<li>使用40X物镜对细胞骨架和局灶性黏附（FAs）进行成像，并选择与相应抗体荧光染料规格匹配的显微镜滤光片。</li>
		<li>进行FAs定量时，使用图像处理软件将图像转换为8位文件。去除背景，并通过设定阈值将图像转换为二值图像。每份样品至少分析30张图像，并在计算中考虑面积大于1 µm2的FAs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>间充质干细胞的软骨诱导分化。
	<ol>
		<li>在软骨诱导分化的早期阶段（&#60; 5天），使用配备数码相机和低倍（i.e. 10X）物镜的直立落射荧光显微镜对细胞聚集体进行成像。采用紫外激发和长通发射滤光片观察Hoechst/DAPI染色。</li>
		<li>测量聚集体面积时，使用图像处理软件将图像转换为8位文件，去除背景，并选择能够突出聚集体轮廓的阈值。计算颗粒的面积。</li>
		<li>使用直立共聚焦显微镜在高倍镜下（即40–60X）对FAs、细胞骨架肌动蛋白纤维以及软骨特异性II型胶原α1链（COL2A1）免疫染色的样品进行成像。以代表性间隔（i.e. 0.5–1 µm）采集光学切片。</li>
		<li>处理图像堆栈时，使用图像处理软件将图像转换为8位文件，去除背景，并通过设定阈值将其转换为二值图像。每种条件下至少处理三个独立样品中的三个细胞聚集体。</li>
		<li>定量细胞聚集体基底区域中FAs蛋白染色面积，并以染色面积占图像中细胞核数量的百分比形式表示。</li>
		<li>测量COL2A1染色时，使用共聚焦z轴投影，定量投影面积的总和（即每份样品的最大COL2A1面积），并将所得面积值归一化至相应聚集体的面积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 定量反转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析
注意：为防止 RNase 污染，操作试剂和 RNA 时应使用一次性无菌塑料器皿，并佩戴一次性手套。始终采用正确的微生物无菌技术，并使用适当的去污溶液清除工作表面以及离心机、移液器等非一次性物品上的 RNase 污染。
<ol>
	<li>提取总RNA，并在RNA破碎仪中进行粉碎处理。用DNase处理RNA样本，然后使用cDNA合成试剂盒将其反转录为cDNA。</li>
	<li>使用针对转录因子SOX9的引物进行qRT-PCR检测。可选用β-2-微球蛋白（B2M）和核糖体蛋白L13a（RPL13a）作为内参基因。</li>
	<li>计算基因表达水平，并以阴性对照（PLLA）为基准进行归一化处理。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在制定所述方案的过程中，应考虑若干关键步骤。第一步涉及使用扫描探针显微技术对纳米图案进行表征。为了观察纳米图案，产生图案化的表面其粗糙度必须低于树枝状大分子的平均直径，根据扫描隧道显微镜（STM）测量结果，该直径约为 4–5 nm（图 1B）。此外，需注意高分辨率 STM 成像仅限于导电基底，本实验中为 Au(111)。在旋涂后若出现聚合物从载玻片边缘翘起的情况，可使用生物相容性胶水进行修复。
树状大分子纳米图案化是一种在纳米尺度上实现细胞黏附性局部可控的技术。该技术基于树状大分子通过吸附在表面的自组装过程，无需任何复杂的纳米图案化设备，因而与先前报道的基于光刻的技术36,37,38形成对比。树状大分子纳米图案化可轻松扩展至大面积表面，并且完全兼容细胞培养操作流程。
本文所述的树状大分子纳米图案化方法在未来可...

本文介绍了一种简单且多功能的基于树状大分子的纳米图案化方法，用于制备可实现纳米尺度局部黏附性调控的细胞培养表面。已有研究报道了细胞外基质（ECM）在纳米尺度上的组织细节1,2,3，而对细胞黏附表面进行纳米图案化已为理解细胞黏附相关需求提供了深入见解4,5。利用基于胶束光刻技术的纳米图案所开展的实验表明，RGD肽的纳米间距存在约70 nm的阈值，当间距超过该值时，细胞黏附会显著延迟6,7,8,9。这些研究还强调，相较于整体配体密度，局部配体密度对细胞黏附的影响更为显著9,10,11。
在形态发生过程中，细胞与周围环境的相互作用会触发最初的分化事件，并持续进行，直至形成最终的复杂组织结构。在此框架下，纳米图案化表面已被用于研究初始细胞-表面相互作用对形态发生的影响。基于光刻技术的RGD纳米图案，在β型Ti-40Nb合金上以68 nm的横向间距排列，有助于维持未定向干细胞的未分化表型。12，而95至150 nm的RGD纳米间距可促进间充质干细胞（MSCs）向成脂/成骨方向分化13,14,15 软骨生成命运16此外，通过在信号组分上修饰的自组装大分子已被证明可通过纳米级结构对信号提示进行调控，从而引导细胞黏附和分化。17在外层结构中带有与细胞相互作用基团的树枝状大分子的沉积18,19,20 用于研究细胞黏附的表面处理方法21,22，形态学23,24和迁移事件25,26然而，这些研究缺乏对表面特性的表征，使得建立树状大分子表面构型与细胞反应之间任何相关性都十分困难。
当树枝状大分子从低离子强度溶液中吸附到低电荷表面时，可获得具有类液态有序结构和明确间距的树枝状大分子纳米图案27。基于这一特性，本文介绍一种在低电荷表面上制备大规模不均匀RGD功能化树枝状大分子纳米图案的方法，该方法可实现对局部RGD表面密度的纳米级调控。水接触角（CA）、X射线光电子能谱（XPS）以及扫描探针显微技术（STM和AFM纳米图案）表明，通过调节溶液中树枝状大分子的初始浓度，可调控局部配体密度。通过AFM图像中粒子间最小距离的概率等高线图对局部RGD表面密度进行量化，并将其与细胞实验结果相关联。与其他纳米图案技术4相比，基于树枝状大分子的纳米图案方法操作简便，易于扩展至大面积表面，因此与细胞培养应用完全兼容。这些纳米图案被用作生物活性基底，用于评估局部RGD表面密度对细胞黏附28以及成年成人MSCs软骨诱导分化29的影响。实验结果表明，RGD树枝状大分子纳米图案能够支持细胞生长，且较高的局部RGD表面密度可增强细胞黏附。在分化实验中，细胞对基底的中等黏附性有利于MSC的聚集及早期软骨向分化。由于树枝状大分子外围基团易于修饰，本文所述方法可进一步拓展至其他对细胞具有浓度依赖性效应的细胞外基质（ECM）配体。

<table><tbody><tr><td>云母上的金（111）薄膜，1.4×1.1 cm&amp;nbsp;</td><td>Spi Supplies</td><td>466PS-AB</td><td></td></tr><tr><td>普通玻璃载玻片</td><td>Corning</td><td>2947-75x25</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>Millipore</td><td></td><td>18M&amp;Omega; cm</td></tr><tr><td>96%乙醇</td><td>PanReac</td><td>131085.1212</td><td></td></tr><tr><td>L-丙交酯/DL-丙交酯共聚物</td><td>Corbion</td><td></td><td>摩尔比95/05</td></tr><tr><td>1,4-二氧六环</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296309-1L</td><td></td></tr><tr><td>耐高温硅油</td><td>Acros Organics</td><td>174665000</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Laurell</td><td>WS-650MZ-23NPP/Lite</td><td></td></tr><tr><td>组织培养用层流罩</td><td>Telstar</td><td>Bio II Advance</td><td>II级生物安全柜</td></tr><tr><td>滤器单元</td><td>Millex-GP</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>10 mL注射器</td><td>Discardit</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜</td><td>Veeco Instruments</td><td>Dimension 3000 AFM仪器</td><td></td></tr><tr><td>硅基原子力显微镜探针</td><td>Budget Sensors</td><td>Tap300AI-G</td><td>共振频率300 kHz，k = 40 N/m</td></tr><tr><td>扫描隧道显微镜</td><td>Molecular Imaging</td><td>PicoSPM显微镜</td><td></td></tr><tr><td>Pt0.8:Ir0.2金属丝</td><td>Advent</td><td>PT671012</td><td>直径0.25 mm</td></tr><tr><td>WSxM 4.0软件</td><td>Nanotec electronica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学接触角（CA）测量系统</td><td>Dataphysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCA20软件</td><td>Dataphysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X射线光电子能谱仪</td><td>Physical Electronics</td><td>Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源的纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-1MG</td><td>1.0 mL溶液</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco</td><td>21600-10</td><td>粉末</td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1658</td><td>NIH/3T3</td></tr><tr><td>高糖型杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）液体培养基</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td>液体高糖型，不含谷氨酰胺，500 mL</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>200 mM（100倍浓缩液）</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360039</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>T75培养瓶</td><td>Nunclon</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td>0.25% EDTA</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Hermle Labortechnik</td><td>Z 206 A</td><td></td></tr><tr><td>非组织培养处理的12孔板</td><td>Falcon</td><td>351143</td><td>非黏附性</td></tr><tr><td>脂肪来源的人间充质干细胞（hMSCs）</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td>细胞冻存管，1 mL</td></tr><tr><td>MSC基础培养基</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-030</td><td></td></tr><tr><td>MSC生长试剂盒</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-040</td><td>低血清</td></tr><tr><td>软骨细胞分化试剂</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-051</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011-15ML</td><td>中性缓冲，10%</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>分子生物学级别，适用于细胞培养，&amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036-50G-F</td><td>分子生物学级别，用作非离子型表面活性剂和佐剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-50G</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆[Y113]抗paxillin抗体</td><td>Abcam</td><td>ab32084</td><td>稀释比例1:200</td></tr><tr><td>鼠单克隆[1F5]抗胶原蛋白α-1 XX链抗体&amp;nbsp;</td><td>Acris Antibodies</td><td>AM00212PU-N</td><td>稀释比例：1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A10667</td><td>2 mg/mL，稀释比例1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>2 mg/mL，稀释比例1:1000</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570 10ML</td><td>10 mg/mL，稀释比例1:1000</td></tr><tr><td>盖玻片 24×24 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102424</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount封片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E1000正置显微镜</td><td>配备CCD相机</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Leica SPE 正置共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>ImageJ 1.50g 免费软件</td><td>http://imgej.nih.gov/ij</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB软件</td><td>The MATHWORKS, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8.5软件&amp;nbsp;</td><td>OriginLab Coorporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于树状大分子的非均匀纳米图案用于局部调控表面黏附性：一种引导软骨细胞定向分化的技术方法

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

细胞黏附与分化受到细胞外基质（ECM）组分纳米级分布的调控，其中局部浓度具有显著影响。本文介绍一种制备大规模非均匀纳米图案的方法，该图案由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）功能化树状大分子构成，可实现对表面局部RGD密度的纳米级调控。这些纳米图案通过将树状大分子从不同初始浓度的溶液中吸附至表面形成，并采用水接触角（CA）、X射线光电子能谱（XPS）以及扫描探针显微技术（如扫描隧道显微镜STM和原子力显微镜AFM）进行表征。利用AFM图像，通过粒子间最小距离的概率等高线图测定局部表面RGD密度，并进一步关联分析其对细胞黏附反应与分化的影响。本文所提出的纳米图案化方法操作简便，可直接扩展至大面积表面，因此完全兼容细胞培养实验流程，并可推广应用于其他具有浓度依赖性细胞效应的配体。

我们介绍一种纳米图案化方法，可在纳米尺度上调控表面黏附性（图1）。RGD-Cys-D1 的化学结构如 图1A 所示。树枝状分子被图案化于导电的 Au(111) 表面，以便进行高分辨率 STM 表征。溶液中树枝状分子浓度较低（低至 10-5% w/w）时，可形成直径为 4–5 nm 的孤立树枝状分子（图1B）；而较高浓度下则形成高度密集的树枝状分子聚集体（图1C）。AFM 表面表征（图1D–G，上排）显示，RGD-Cys-D1 树枝状分子在表面的分布可随溶液中初始树枝状分子浓度的改变而调节。在 dmin 的概率等高线图中，这表现为表面局部 RGD 纳米尺度密度的不同（图1D–G，下排）。</p...

本文描述并应用了一种制备基于树状大分子的非均匀纳米图案的方法，该方法可实现对局部精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）表面密度的纳米尺度调控，用于研究细胞黏附和软骨发生分化。

细胞黏附和分化受到细胞外基质（ECM）组分纳米级分布的调控，局部浓度……

本实验方案的总体目标是获得大规模基于树状大分子的不均匀纳米图案，从而实现对局部表面黏附性的纳米尺度控制。所描述的方法应用于细胞黏附和软骨发生分化研究。树状大分子形成的纳米图案能够在纳米尺度上对表面黏附性进行局部调控。使用细胞黏附性RGD肽修饰的第一代聚纳米分子被用于构建纳米图案。通过扫描探针显微技术对其进行表征，并应用于细胞黏附与分化研究。随后，我们分析显微镜和免疫荧光染色技术所得的结果。第一步是准备工作用基底。通过使用金刚石刀头切割显微镜载玻片，制备定制的方形玻璃载玻片。将载玻片切割成 1.25 厘米 × 1.25 厘米的尺寸。用去离子水清洗载玻片，随后用96%乙醇清洗，并使其自然晾干。通过将200毫克PLLA加入压力管中，再加入10毫升二氧六环，配制2%PLLA溶液。加入搅拌子并 tightly 封闭管子。在60摄氏度的甘油浴中轻轻搅拌，将混合物加热24小时。将玻璃片放入含有PLLA溶液的玻璃小瓶中，并置于洁净的加热板上，温度设为60摄氏度。等待至少10分钟，使其达到所需温度。将玻璃基底放置在旋涂仪载物台上，运行选定程序，用PLLA溶液进行旋涂。我们选择的程序为：预步骤500 rpm持续5秒，加速度300 rpm/秒；主步骤3,000 rpm持续30秒，加速度1,500 rpm/秒，以确保涂层均匀。旋涂后的玻璃片可保存在冰箱中。将溶液A（即0.77 毫克/毫升的RGD-Cys-D1树状大分子水溶液）置于去离子水中，超声处理10分钟。然后分别在去离子水中配制10²%和10⁵%的树状大分子溶液B和C。将溶液C超声处理10分钟，随后在去离子水中配制以下树状大分子溶液D、E和F。溶液D，2.5×10⁸%，溶液E，10⁸%，以及溶液F，4×10⁹%。将这些溶液保存在冰箱中直至使用。使用细胞培养舱内的UV灯对18个PLL A包被的玻片照射13分钟，使其无菌。将每种树状大分子溶液超声处理10分钟。在细胞培养超净台的层流条件下，将树状大分子溶液通过0.22微米直径的滤膜过滤至12孔板中预先涂有聚-L-乳酸（PLLA）的玻璃载片上。将载片置于超净台内室温条件下静置16小时，随后用无菌去离子水洗涤。对于阳性对照样品，配制无菌的PBS纤维连接蛋白溶液，并在细胞培养超净台中将复制品与该溶液在室温下孵育1小时。用PBS洗涤。剩余的三个PLLA涂层基底将作为阴性对照的复制品。纳米图案形貌采用轻敲模式在空气中操作原子力显微镜（AFM）进行分析。将一个弹簧常数为40牛顿每米、共振频率为300千赫兹的硅悬臂梁安装到原子力显微镜（AFM）探针夹持器中。将纳米图案化基底置于AFM载物台上，使探针接近表面直至接触，并选择一个合适的振幅设定值，以便在不对表面施加过大压力的情况下成像树状大分子的构型。每种条件下，对三个独立的基底分别采集至少三幅5×5微米的代表性图像。使用原子力显微镜处理软件对获取

dendrimer-based-uneven-nanopatterns-to-locally-control-surface

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

基于状的不均匀 Nanopatterns 对局部控制表面粘附的研究--一种直接软骨分化的方法

我们展示了一种将细胞放置在基底特定位置的简单方法。该方法通过将含有填充细胞的微孔的硅胶芯片翻转至基底上来实现细胞图案化。该方法为调控细胞间的可扩散信号和邻近细胞信号提供了一种新途径。...

利用生物翻转芯片对胚胎干细胞进行图案化

采用朗缪尔-舍弗法（Langmuir-Schaefer...

用于组织工程的温敏型纳米结构表面的制备

本文介绍了一种利用小型纳米图案化模具制备大面积纳米图案化基底的方案，用于研究纳米形貌对细胞行为的调控作用。...

利用拼接技术扩展纳米图案化基底以调控细胞行为的纳米形貌

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。...

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

本报告介绍了一种简单且易于操作的技术，利用低压真空将细胞和底物填充至微流控通道中，用于生物学研究。...

一种用于蛋白质和细胞图案化的多功能方法

我们的总体目标是理解细胞如何感知引导轴突定向生长的胞外信号。在此，我们描述了一种光诱导蛋白质吸附技术，该方法可用于生成特定的细胞外基质成分微图案，以研究调控轴突发育和路径选择的具体事件。...

利用PRIMO微图案系统研究细胞对细胞外基质蛋白响应的光诱导蛋白质分子吸附

该方法旨在阐明细胞外基质信号（如基质刚度、蛋白质组成和细胞形态）调控施万细胞（SC）表型的机制。...

可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化

本文介绍一种利用DNA编程黏附技术在单细胞分辨率下对细胞进行微图案化的实验方案。该方案采用台式光刻平台在玻璃载片上构建DNA寡核苷酸的图案，随后使用 commercially available...

使用DNA进行细胞简单、经济且模块化图案化的技术

近紫外光刻技术与牵引力显微镜相结合，用于测量细胞在微图案化水凝胶上的作用力。通过靶向光诱导单个细胞释放，可在同一样本上进行大量测量。...

利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

传统上，细胞培养是在平面基底上进行的，而这种基底无法很好地模拟细胞的天然微环境...

通过三维细胞培养基底的紫外光图案化技术构建多线索细胞微环境

学习利用树枝状聚合物纳米图案实现纳米级表面粘附性局部控制的方法，研究RGD表面密度对细胞粘附及软骨分化的影响。该技术为组织工程和再生医学提供了重要应用前景。

基于树状大分子的非均匀纳米图案用于局部调控表面黏附性：一种引导软骨细胞定向分化的技术方法

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