Name: 实时颤振诱发的粪便中 CWD 朊的转化检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解实时颤振诱导转化检测方法，用于检测鹿科动物粪便中的慢性消耗病朊病毒。该技术具有高灵敏度和特异性，可实现高通量样本分析，为朊病毒传播研究提供可靠工具。

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我们感谢 Byron Caughey 博士（美国国立卫生研究院落基山实验室）提供了培训以及鹿源 PrP 细菌表达质粒。SG 得到了加拿大研究主席计划的支持。我们感谢基因组加拿大、阿尔伯塔朊病毒研究所和阿尔伯塔农业与林业部通过基因组阿尔伯塔公司，以及卡尔加里大学为本研究提供的经费支持。我们还感谢玛格丽特·冈恩动物研究基金会提供的研究资助。

1. 使用粪便材料进行 RT-QuIC 检测
<ol>
	<li>鹿类粪便提取物的制备
	<ol>
		<li>通过将1 g粪便材料加入10 mL粪便提取缓冲液（20 mM磷酸钠，pH 7.1，130 mM NaCl，0.05% Tween 20，1 mM PMSF和1×完全蛋白酶抑制剂，无EDTA）中制备粪便匀浆，最终浓度为10%（w/v）。该匀浆缓冲液可在使用前配制，并于-20 °C保存。</li>
		<li>在试管（例如gentleMACS M管）中，使用解离仪按照制造商预设的蛋白质处理程序，在室温下将粪便颗粒（1 g）与缓冲液（10 mL）混合匀浆1分钟。重复此步骤两到三次，直至粪便样品在缓冲液中完全匀浆。</li>
		<li>用封口膜密封试管，并将其置于摇床或旋转振荡器上，在室温下孵育1小时。</li>
		<li>在室温下以18,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>收集含有蛋白提取物的上清液，并分装至1.5 mL离心管中。分装样品可于-80 °C保存以供后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>粪便提取物中PrPSc的浓缩 
	注意：为了浓缩粪便提取样品中的慢性消耗性疾病（CWD）朊病毒，从而提高RT-QuIC检测的灵敏度，本方案中增加了一步蛋白质沉淀处理。
	<ol>
		<li>NaPTA沉淀法</li>
		<li>向1 mL粪便蛋白提取物中加入250 µL 10%（w/v）N-月桂酰肌氨酸钠（sarkosyl），使sarkosyl的终浓度为2%（v/v）。</li>
		<li>用封口膜密封含样品的试管，在恒温混匀仪中于37 °C、1,400 rpm持续振荡条件下孵育30分钟。</li>
		<li>使用含有10%（w/v）磷钨酸钠和170 mM氯化镁、pH 7.4的储备液调节粪便蛋白提取物与sarkosyl的混合物，使样品中磷钨酸钠的终浓度为0.3%（w/v）。</li>
		<li>在37 °C、400 rpm持续振荡条件下孵育样品2小时。</li>
		<li>在14 °C、15,800 × g条件下离心30分钟。小心移除上清液。</li>
		<li>通过将沉淀重悬于洗涤缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 7.5，100 mM NaCl，0.5% Triton-X 100，10 mM EDTA，0.5%脱氧胆酸钠（w/v）和0.1% sarkosyl（w/v））中进行洗涤。</li>
		<li>在14 °C、15,800 × g条件下离心15分钟。小心移除上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于100 µL RT-QuIC稀释缓冲液中（相当于原始粪便蛋白提取物体积的1/10）。 
		注意：RT-QuIC稀释缓冲液（20 mM磷酸钠，pH 6.9，130 mM NaCl，0.1% SDS（w/v）和1× N2补充剂）需在使用前配制。总量10 mL经0.2 µm Acrodisc注射器滤器过滤后，于-20 °C保存至使用。</li>
		<li>将经NaPTA处理的样品于-20 °C保存，直至用于RT-QuIC检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RT-QuIC检测
	<ol>
		<li>配制新鲜的10 mM Th-T储备液（将0.032 g Th-T溶于10 mL双蒸H2O中）。</li>
		<li>将Th-T储备液用双蒸H2O按1:10稀释，得到终浓度为1 mM的Th-T溶液，并使用注射器通过0.2 µm Acrodisc注射器滤器过滤。</li>
		<li>将保存于-80 °C的小鼠重组PrP（rPrP，aa 23-231）底物（每RT-QuIC反应10 µg/mL）置于冰上解冻。</li>
		<li>每次向100 kDa截留分子量过滤微管中加入500 µL rPrP底物，在室温下以14,000 × g离心5分钟（每个滤管最多可使用两次）。</li>
		<li>将滤出的底物转移至无菌1.5 mL离心管中，4 °C保存备用。</li>
		<li>将保存于-20 °C的RT-QuIC稀释缓冲液解冻。</li>
		<li>用RT-QuIC稀释缓冲液对种子（粪便蛋白提取物）进行系列稀释： 
		未稀释样品：直接使用未稀释的粪便蛋白提取物 
		稀释2 × 10-1 
		稀释2 × 10-2 
		稀释2 × 10-3</li>
		<li>配制RT-QuIC反应体系的储备液： 
		磷酸盐缓冲液（PBS）：5倍浓缩液 
		NaCl：用双蒸H2O配制的2 M NaCl储备液 
		EDTA：用双蒸H2O配制的100 mM EDTA储备液</li>
		<li>在使用所有溶液前（步骤1.3.8），分别使用注射器通过0.2 µm Acrodisc注射器滤器过滤各溶液，并于室温下保持无菌状态。</li>
		<li>根据待测样品数量（每样品98 µL反应体积，每样品设四个重复）以及额外10%的余量，配制足够体积的RT-QuIC反应体系总量，以确保所有反应均有足量混合液。
		<ol>
			<li>使用15 mL离心管，利用上述储备液配制RT-QuIC反应体系（20 mM磷酸钠，pH 6.9，300 mM NaCl，1 mM EDTA，10 µM Th-T，10 µg/mL rPrP底物，并用双蒸水调节rPrP在反应中的终浓度）。</li>
			<li>使用带滤芯吸头的移液器反复吹打，充分混匀所有溶液。尽可能避免使用涡旋振荡器。</li>
			<li>将混合液倒入50 mL一次性移液槽中。</li>
			<li>使用多通道移液器将98 µL RT-QuIC反应体系加入96孔光学底板的每个孔中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向每个RT-QuIC反应孔中加入2 µL未稀释或10倍系列稀释的粪便蛋白提取物。每个样品设四个重复。 
		注意：在每次实验中，来自CWD阴性动物和经确认的CWD阳性动物的粪便样品系列稀释液（从未稀释至2 × 10-3）分别作为阴性和阳性对照。</li>
		<li>在将酶标板放入酶标仪前，用密封膜封板，并在42 °C孵育25小时，孵育过程中持续进行1分钟双轨道振荡（700 rpm）和1分钟静止的循环。</li>
		<li>设定荧光检测参数： 
		激发波长：450 nm 
		发射波长：480 nm 
		底部读数，闪光次数：20 
		手动增益：1000（依仪器而定） 
		积分时间：20 µs</li>
		<li>25小时孵育结束后，从酶标仪中取出酶标板。</li>
		<li>以3,000 × g离心3分钟，防止孔间可能的交叉污染。</li>
		<li>移除酶标板上的密封膜。</li>
		<li>按照步骤1.3.1至1.3.6所述方法，准备新的96孔板，每孔加入90 µL含新鲜底物和新鲜荧光染料Th-T的RT-QuIC反应体系。</li>
		<li>从第一块板的每孔中转移10 µL至新准备的96孔板中。</li>
		<li>密封新板，并按照步骤1.3.13所述条件继续进行RT-QuIC检测，额外孵育50小时。此额外50小时步骤使总反应时间达到75小时。 
		注意：所有RT-QuIC检测操作均在生物安全柜中进行。</li>
		<li>收集数据。
		<ol>
			<li>每15分钟读取并记录每孔的Th-T荧光信号。</li>
			<li>使用数据分析软件收集全部循环数据，并整理为包含四个重复平均值的电子表格。</li>
			<li>绘制数据平均值曲线图。横轴表示RT-QuIC反应时间（h），纵轴表示相对荧光单位（RFU）。每条曲线对应一个已知样品的某一稀释度。</li>
			<li>在每次实验中，根据现有已发表文献41所述方法，通过计算阴性对照最高平均值加5倍标准差来设定阈值。 
			注意：所有超过设定阈值的重复均视为阳性。若四个重复中至少有两个超过阈值，则判定该样品为阳性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 重组朊蛋白（rPrP）的纯化
<ol>
	<li>细菌菌种培养与rPrP表达 
	注意：Escherichia coli（E. coli）Rosetta（DE3）菌株经转化携带编码小鼠PrP（残基23-231）的pET-24载体，用于制备rPrP。
	<ol>
		<li>将携带pEt-24 mPrP(23-231)的Rosetta（DE3）甘油菌在冰上解冻。</li>
		<li>在LB（Luria Bertani）平板上划线接种，终浓度为50 µg/mL卡那霉素，并于37 °C培养箱中过夜培养。确保平板倒置，以避免固体培养基表面产生冷凝水。准备两个平板，以确保至少一个平板有菌落生长。</li>
		<li>配制1 L LB培养基并高压灭菌，使其无菌。</li>
		<li>向1 L无菌LB培养基中加入1 mL卡那霉素（50 mg/mL）和1 mL氯霉素（34 mg/mL）。</li>
		<li>使用一次性接种环从每个平板上挑取单个菌落，接种至含卡那霉素和氯霉素的3 mL LB培养基中。</li>
		<li>将小规模培养物置于37 °C培养箱中，以225 rpm恒速振荡培养5-6小时。</li>
		<li>将小规模培养物加入剩余的1 L原始LB培养基中，并加入Express Autoinduction System 1以诱导蛋白表达。</li>
		<li>将培养物转移至2 L或更大容量的锥形瓶中，于37 °C培养箱中以200 rpm恒速振荡培养20-24小时。</li>
		<li>将1 L培养物分装至4个250 mL离心管中。</li>
		<li>在室温下以3,750 × g离心20分钟，使菌体沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，将细菌沉淀收集至50 mL离心管中，随后于-80 °C冷冻保存，待后续处理。良好的蛋白产量对应的菌体沉淀重量通常为3至4 g。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包涵体的制备
	<ol>
		<li>将冷冻的菌体沉淀（3至4 g）在37 °C下解冻数分钟。</li>
		<li>再次于-80 °C冷冻10分钟，然后解冻。重复此冻融步骤共两次。</li>
		<li>用移液器彻底吹打，将细菌沉淀重悬于1X&#160;裂解试剂（例如 BugBuster Master Mix）中。每1 g细菌沉淀使用5 mL裂解试剂。确保混合物完全均质化。</li>
		<li>将匀浆液在室温下于摇床上孵育20分钟。</li>
		<li>在室温下以16,000 × g离心20分钟。</li>
		<li>小心倾倒弃去上清液。</li>
		<li>用与前一步相同体积的1X裂解试剂重悬沉淀并均质化。</li>
		<li>在室温下于摇床上孵育15分钟。</li>
		<li>加入适量的1:10稀释（0.1x）裂解试剂，使总匀浆体积达到40 mL。通过反复颠倒混匀，确保充分均质化。</li>
		<li>在4 °C下以7,900 × g离心15分钟。</li>
		<li>小心倾倒弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于40 mL 0.1x裂解试剂中。</li>
		<li>在4 °C下以16,000 × g离心15分钟。</li>
		<li>小心倾倒弃去上清液，将含有包涵体的沉淀于-20 °C保存，待后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白纯化
	<ol>
		<li>在室温下解冻包涵体。</li>
		<li>将解冻后的包涵体溶解于14 mL 8 M盐酸胍溶液中（将38 g盐酸胍溶于0.1 M NaPO4 pH 8.0中，加H2O定容至50 mL；最终溶液无需调节pH），以溶解蛋白。</li>
		<li>通过反复吹打确保充分均质化。</li>
		<li>将裂解液在室温下于摇床上孵育50分钟。</li>
		<li>准备18 g Ni-NTA树脂珠（每3至4 g细菌沉淀使用18 g）；使用真空装置和100 mL 0.22 µm瓶顶滤器以100 mL水冲洗树脂。
		<ol>
			<li>将18 g Ni-NTA树脂珠置于50 mL离心管中，加入足量变性缓冲液（100 mM磷酸钠，10 mM Tris，pH 8.0，6 M盐酸胍，pH 8），使总体积达到50 mL。</li>
			<li>在室温下于摇床上用变性缓冲液平衡树脂50分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将包涵体裂解液以16,000 × g离心5分钟，去除不溶性杂质。</li>
		<li>将上清液加入已平衡的树脂中，弃去沉淀。</li>
		<li>将混合物在室温下于摇床上孵育40分钟，使蛋白结合至Ni-NTA树脂。 
		注意：使用镍螯合珠通过镍亲和力纯化PrP。PrP富含组氨酸的N端区域使其对镍(II)具有天然亲和力，因此无需His标签即可结合镍离子。</li>
		<li>用水冲洗FPLC系统，清洗A、B两条管路。</li>
		<li>用变性缓冲液（100 mM磷酸钠，10 mM Tris，pH 8.0，6 M盐酸胍，pH 8）冲洗两条管路（A和B），以预平衡系统（此时柱子尚未连接）。</li>
		<li>将树脂装入层析柱。确保尽量减少气泡产生。</li>
		<li>将柱子连接至FPLC系统，运行线性梯度洗脱：起始为100%变性缓冲液A和0%复性缓冲液B（100 mM磷酸钠，10 mM Tris，pH 8.0），结束时为0%变性缓冲液和100%复性缓冲液。该梯度以0.75 mL/min流速持续240分钟，以实现PrP的正确折叠。 
		注意：在层析纯化过程中，通过施加复性缓冲液的线性梯度逐步替换变性缓冲液，使变性的PrP在树脂上缓慢复性。此步骤同时去除变性剂盐酸胍。</li>
		<li>确保100%复性缓冲液继续以0.75 mL/min流速流经柱子额外30分钟。</li>
		<li>用水冲洗A管路，随后用洗脱缓冲液（100 mM磷酸钠，10 mM Tris，500 mM咪唑，pH 5.8）绕过柱子冲洗，以清除AKTA系统中已被洗脱缓冲液替代的变性缓冲液。</li>
		<li>以2 mL/min流速运行40分钟的线性梯度进行蛋白洗脱：起始为100%复性缓冲液B和0%洗脱缓冲液A，结束时为0%复性缓冲液和100%洗脱缓冲液。 
		注意：洗脱缓冲液中高浓度的咪唑会竞争性地取代PrP与镍(II)的结合。主要蛋白峰通常在梯度进行约三分之一时开始洗脱。
		<ol>
			<li>观察280 nm处OD值的变化，确认洗脱峰上升。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>仅收集大峰中心部分含有蛋白的组分。 
		注意：每2 mL洗脱组分收集至15 mL离心管中。</li>
		<li>立即向收集的蛋白溶液中加入约其体积1/3（1 mL）的透析缓冲液（10 mM磷酸钠，pH 5.8）进行稀释。</li>
		<li>立即将离心管置于冰上。</li>
		<li>合并所有收集的洗脱蛋白。</li>
		<li>将蛋白溶液转移至透析夹（分子量截留值10 kDa）中。</li>
		<li>将夹子放入预冷的透析缓冲液（3.6 L）中，在4 °C下透析2小时，随后转移至新鲜透析缓冲液（3.6 L）中继续过夜透析。确保透析缓冲液持续搅拌。</li>
		<li>使用注射器通过0.2 µm Acrodisc针筒滤器对透析后的蛋白进行过滤。</li>
		<li>使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。</li>
		<li>如有必要，浓缩或稀释蛋白，使其终浓度调整至0.3 mg/mL。 
		注意：通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色确认蛋白纯度。</li>
		<li>将蛋白分装为每管1 mL，置于微量离心管中，并立即按RT-QuIC方案所述于-80 °C保存，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

RT-QuIC 之前已被用于检测经口感染的白尾鹿和骡鹿尿液及粪便提取物中的慢性消耗性疾病（CWD）朊病毒 38本文所示系统是对 RT-QuIC 检测方法的一种改进。在原有基础上增加了额外步骤 &#34;经典&#34; 通过RT-QuIC检测法提高对感染动物粪便样本中慢性消耗性疾病（CWD）朊病毒的检出率和检测灵敏度。
粪便提取物检测的灵敏度较低，促使我们对RT-QuIC实验方案进行了优化。为实现高灵敏度 体外 在粪便中检测朊病毒时，为了去除干扰朊病毒转化和/或扩增的成分并提高检测灵敏度，样品制备过程中增加了关键步骤。在RT-QuIC实验流程中引入底物替换，并结合NaPTA/月桂酰肌氨酸钠处理，对于检测临床前及临床阶段慢性消耗性疾病（CWD）感染麋鹿的种子活性，以及提高粪便提取物中朊病毒转化检测的灵敏度至关重要。
NaPTA沉淀是一种常用技术，通常与皂素提取联用，以分离和浓缩PrPSc 至可检测水平。已知NaPTA优先沉淀PrPSc...

朊病毒病或可传播性海绵状脑病（TSE）是一类神经退行性疾病，包括人类的克雅氏病（CJD）、牛的牛海绵状脑病（BSE）、羊和山羊的痒病（scrapie），以及鹿科动物的慢性消耗性疾病（CWD）。 1,2. TSEs 的特征是脑组织出现独特的海绵状改变以及神经元的丧失。根据 &#34;仅蛋白质&#34; 假设，朊病毒主要由PrP组成Sc （“Sc”代表痒病） 3，宿主编码的细胞型朊蛋白PrP的一种错误折叠异构体CPrPSc PrP 转化结果C 形成富含β-折叠的构象 4,5,6 可作为种子结合并转化其他PrPC 分子。新生成的 PrPSc 分子被整合到正在生长的聚合物中 7,8 会裂解成更小的寡聚体，从而产生更多具有感染性的核。PrPSc 易于聚集，且对蛋白酶具有部分抗性 9,10.
慢性消耗性疾病（CWD）影响野生和圈养的马鹿（Cervus canadensis）、骡鹿（Odocoileus hemionus）、白尾鹿（WTD；Odocoileus virginianus）、驼鹿（Alces alces）以及驯鹿（Rangifer tarandus tarandus）11,12,13。它被认为是最具传染性的朊病毒病，其水平传播主要通过鹿科动物间的相互接触以及环境中传染性因子的长期存在而实现14,15。与其他朊病毒病不同，在其他疾病中PrPSc的积累和传染性通常局限于脑组织，而在CWD中，这些致病蛋白还存在于外周组织及体液中，例如唾液、尿液和粪便16,17,18。
免疫组织化学被认为是检测CWD（慢性消耗性疾病）的金标准，可用于检测PrPSc的分布及海绵状病变19,20。酶联免疫吸附试验（ELISA）以及较少情况下使用的蛋白质印迹法（western blot）也用于CWD的诊断。因此，目前朊病毒病的诊断主要依赖于在死后组织中检测朊病毒。 ante-mortem（生前）诊断可通过采集扁桃体或直肠-肛门黏膜相关淋巴组织（RAMALT）活检实现；然而，该操作具有侵入性，且需要捕捉动物。因此，使用易于获取的样本（如尿液和粪便）将是检测CWD朊病毒的一种更实用的方法。然而，这些排泄物中的朊病毒浓度相对较低，低于当前诊断方法的检测限。因此，亟需一种更灵敏且高通量的诊断工具。体外转化系统，例如蛋白质错误折叠循环扩增法（PMCA）21、淀粉样种子化检测法以及实时震荡诱导转化法（RT-QuIC）22,23,24，是利用PrPSc自我传播能力的强大工具，可在体外模拟朊病毒的转化过程，从而将微量PrPSc扩增至可检测水平25,26。其中，RT-QuIC方法利用了转化产物富含β-折叠二级结构这一特性，可特异性结合硫磺素T（Th-T）。因此，重组PrP（rPrP）在种子引导下转化为淀粉样纤维，结合Th-T后可通过实时监测Th-T荧光强度（以相对荧光单位RFU表示）进行检测。一旦开始监测，RFU可用于评估相对种子活性，以及诸如滞后相（lag phase）等定量参数。滞后相代表达到阈值所需的时间（h），在此期间反应初期的rPrP转化水平低于Th-T荧光的检测限。当Th-T荧光超过阈值并呈阳性时，标志着明显的滞后相结束，同时意味着形成了足够的淀粉样核（成核/延伸）。淀粉样纤维的生长可被实时检测，样品中初始存在的PrPSc或种子活性通过片段化产生更多种子而被放大。这些新生成的种子继而引发淀粉样纤维的快速指数级增长阶段。
因为该检测方法能够检测低至1 fg的PrPSc 24，高灵敏度使该技术能够通过检测PrP实现死前或无创诊断Sc 在各种外周组织、排泄物或其他感染性水平较低的样本中，RT-QuIC 相较于生物测定法具有明显优势，包括可重复性高、实用性好、检测速度快（不到 50 小时）以及成本低。该方法避免了 PMCA 中所使用的超声处理等技术复杂性，且在密封膜封口的微孔板中进行，可最大限度降低各孔之间气溶胶污染的风险。多孔板设计使得单次实验最多可同时分析 96 个样本。为应对反复出现的假阳性结果以及重组 PrP（rPrP）自发转化的问题， 体外 转化实验中，在RT-QuIC中设定阈值（临界值）非常有用。实际上，该阈值通常基于阴性对照的结果确定（阴性样本的平均RFU值加5倍标准差）。 27），由此建立基线，以区分阳性与阴性样本。因此，每个样本设置四个重复，当其中至少50%的重复显示阳性信号时，即可判定该样本为阳性。 即 穿过截止线 28在RT-QuIC中，种子与底物之间无需具有同源性，例如在之前的一项研究中发现，与人源PrP的同源底物相比，仓鼠rPrP作为底物具有更高的敏感性。变异型克雅氏病 接种羊瘙痒病的反应 29仓鼠-绵羊嵌合型重组PrP也被认为是比人重组PrP更适合作为检测人变异型克雅氏病朊病毒的底物 30因此，在该检测中使用来自不同物种的重组PrP底物非常普遍。该检测已成功应用于多种朊病毒病，例如散发性克雅氏病（sporadic CJD） 31,32,33，遗传性朊病毒病 34，BSE 35,36,37，痒病 23,36和 CWD 38,39,40,41,42使用处理过的脑脊液、全血、唾液和尿液作为RT-QuIC的接种物的研究均成功检测到PrPSc 38,39,40,41,42为了增强在血液血浆等可能含有淀粉样蛋白形成抑制剂的样本中的检测能力，Orrú 等（2011）开发了一种通过结合PrP去除淀粉样蛋白形成潜在抑制剂的策略Sc 免疫沉淀（IP）步骤和RT-QuIC，命名为 &#34;增强型QuIC&#34; 检测（eQuIC）。此外，在反应约24小时后采用底物替换步骤以提高检测灵敏度。最终，该方法可检测低至1 ag的PrPSc 可通过eQuIC检测到 30.
为了纯化肥便提取物并去除粪便中可能存在的检测抑制物，将实验性经口感染后在临床前和临床阶段采集的麋鹿粪便样本在含有去污剂和蛋白酶抑制剂的缓冲液中进行匀浆处理。随后采用不同方法进一步浓缩样本中的PrPSc，其中利用磷酸钨酸钠（NaPTA）沉淀法进行蛋白质沉淀。NaPTA沉淀法最初由Safar et al.43描述，用于浓缩待测样本中的PrPSc。NaPTA与样本孵育后，可优先沉淀PrPSc而非PrPC，但其分子机制尚不明确。该步骤还有助于限制并防止在某些情况下出现的重组PrP（rPrP）的自发转化。最后，采用优化的RT-QuIC方法检测肥便提取物，以小鼠重组PrP（氨基酸23-231）作为底物，并在方案中引入底物替换步骤以提高检测灵敏度。
本研究结果表明，该改进方法能够检测到极低浓度的慢性消耗性疾病（CWD）朊病毒，与未采用NaPTA沉淀和底物替换的检测方案相比，显著提高了粪便样本中检测的灵敏度和特异性。该方法有望应用于其他组织和体液样本，对于野生和圈养鹿科动物的CWD监测具有重要应用价值。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 注射器滤器</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心滤过装置</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml 注射器</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素（Chloramphenicol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning 瓶顶真空滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M 管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>咪唑（Imidazole）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（Isopropanol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（Luria-Bertani broth）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（Magnesium chloride）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂（100X）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-月桂酰肌氨酸钠盐（Sarkosyl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 带 omega 膜离心装置（100K）</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 封口膜</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（Sodium chloride）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠（sodium phosphate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠（Sodium phosphate dibasic anhydrous）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠（Sodium phosphate monobasic monohydrate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>磷钨酸钠水合物（NaPTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>硫黄素 T（Thioflavin T）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷（Tris）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;商用缓冲液与溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4（1X）</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 去离子水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;标准品与商用试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备设置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA 蛋白纯化系统（FPLC）</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman JA-25.50 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman JA-10 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega 微孔板读板仪</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS 数据分析软件</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

粪便样本中慢性消耗性疾病朊病毒的实时震动诱导转化检测法

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

RT-QuIC 技术是一种灵敏的方法 体外 基于重组朊蛋白（PrP）底物的无细胞朊病毒扩增检测方法，主要利用朊病毒种子作为模板，诱导底物发生种子依赖性的错误折叠与聚集。实时震动诱导转化扩增法（RT-QuIC）是一种类比于实时聚合酶链式反应（PCR）的新型高通量技术。淀粉样纤维生长的检测依赖于硫黄素T染料，该染料在特异性结合富含β-折叠结构的蛋白质时产生荧光信号，从而实现对淀粉样聚集过程的实时监测。我们尝试开发一种可靠的非侵入性筛查方法，用于检测粪便提取物中的慢性消耗病（CWD）朊病毒。本文中，我们对RT-QuIC技术进行了针对性优化，以实现对PrPSc 在慢性消耗性疾病（CWD）感染的鹿科动物粪便中检测到种子活性。最初，我们制备的粪便提取物在RT-QuIC检测中的种子活性相对较低，可能是由于粪便材料中存在潜在的检测抑制物。为提高粪便提取物的种子活性并去除潜在的检测抑制物，我们将粪便样本在含有去污剂和蛋白酶抑制剂的缓冲液中进行匀浆处理。此外，我们还采用不同方法对样本进行浓缩PrP的处理。Sc 基于蛋白沉淀法（使用磷钨酸钠）及离心力作用。最后，采用优化的RT-QuIC方法检测粪便提取物，该方法在操作流程中引入底物替换步骤以提高检测灵敏度。因此，我们建立了一种利用RT-QuIC技术高灵敏检测临床前及临床期鹿科动物粪便中慢性消耗性疾病（CWD）朊病毒种子活性的实验方案，可作为无创诊断CWD的实用工具。

以10%（w/v）制备的慢性消耗性疾病（CWD）粪便提取物能够引发RT-QuIC反应，但检测灵敏度较低27。使用特定缓冲液进行粪便匀浆是避免RT-QuIC反应中出现高背景荧光的关键步骤，尤其是在使用小鼠重组PrP（rPrP）底物而非鹿源rPrP时，该步骤有助于获得更特异的结果27。添加NaPTA沉淀步骤可减少rPrP在RT-QuIC中的自发转化（图1），同时不抑制反应中种子活性的扩增（图2）。尽管经NaPTA处理后观察到更佳的扩增效果，CWD阳性粪便样本的荧光信号仍然较低（图1）。此外，部分样本的朊病毒扩增在低荧光水平即达到稳定平台期。这表明反应已饱和，可能归因于rPrP的降解/变性或非正常途径聚集体的形成，从而消耗了rPrP库30。为进一步提高朊病毒的...

本文介绍一种简单、快速且高效的朊病毒扩增技术——实时震动诱导转化（RT-QuIC）方法的操作流程。

RT-QuIC 技术是一种灵敏的体外无细胞朊病毒扩增检测方法，主要基于重组朊蛋白的种子介导错误折叠与聚集……

本实时震荡诱导转化检测方案的总体目标是实现对鹿科动物粪便样本中慢性消耗性疾病朊病毒的高灵敏度检测。该方法有助于解答慢性消耗性疾病研究领域中的关键问题，例如感染鹿体内的慢性消耗性疾病朊病毒何时出现在粪便中。该技术的主要优势在于其特异性强、灵敏度高，并可实现样本的高通量检测。本实验操作将由我实验室的技术员 Ginny Cheng 演示。开始此操作时，取一克粪便样品加入含有 10 毫升粪便提取缓冲液的离心管中。使用已预设蛋白质程序的组织解离仪，在室温下将粪便样本匀浆处理一分钟。重复此步骤两到三次，直至粪便样本完全均质化。然后用封口膜密封管子，并将其置于摇床或旋转振荡器上，在室温下孵育一小时。孵育结束后，在室温下以 18,000 ×g 离心五分钟。收集上清液，并将其分装至1.5毫升离心管中。于-80°C保存，直至使用。开始进行磷钨酸钠沉淀法时，向1毫升粪便蛋白提取物中加入250微升Sarkosyl。使用封口膜密封离心管。将离心管放入恒温混匀仪中，在37°C条件下以1,400 rpm持续振荡孵育30分钟。随后，加入含有10%磷钨酸钠和170毫摩尔/升氯化镁的储备液，使样品中磷钨酸钠的终浓度为3%。将样品转移至恒温混匀仪中，在37°C条件下以400 rpm持续振荡孵育2小时。接下来，在14摄氏度下以15,800 ×g离心30分钟。小心弃去上清液，并用洗涤缓冲液重悬沉淀物以洗涤沉淀。然后在14摄氏度下以15,800 ×g离心15分钟。小心移除上清液，并将沉淀物重悬于 100 微升 RT-QuIC 稀释缓冲液中。将处理后的样品储存于 -20 摄氏度，直至准备进行 RT-QuIC 检测。开始实验时，将 0.032 克硫黄素 T 加入 10 毫升重蒸水中，配制新鲜的 10 毫摩尔硫黄素 T 储存液。接下来，使用重蒸水将储备液稀释10倍，得到终浓度为1毫摩尔的硫黄素T溶液。使用配备0.2微米Acro圆盘滤器的注射器过滤1毫摩尔的硫黄素T溶液。然后解冻重组朊蛋白底物。每次向100千道尔顿截留分子量的超滤管中加入500微升重组朊蛋白底物。在室温下以 14,000 g 离心五分钟。随后，将洗脱的底物转移至无菌的 1.5 毫升离心管中。于 4 摄氏度保存，直至使用前。接下来，解冻保存的RT-QuIC稀释缓冲液。按照文本方案中的说明稀释种子样品，并配制储备溶液和RT-QuIC反应混合液。使用带滤芯吸头的移液器，通过反复吹打混匀反应混合液。将混合物倒入一个50毫升的一次性移液储液槽中。使用多通道移液器，向96孔光学底板的每个孔中加入98微升RT-QuIC反应混合液。向每个反应孔中加入2微升未稀释或10倍系列稀释的粪便蛋白提取物。然后使用封板膜密封培养板。在酶标仪中于42摄氏度孵育25小时，孵育期间持续进行循环操作：以700 rpm的转速双轨道振荡1分钟，随后静置1分钟。同时，根据文本方案中所述设定荧光检测参数。25 小时后，从酶标仪中取出培养板。以 3,000 ×g 离心 3 分钟，以避免孔间可能的污染。接着，移除培养板上的密封膜。通过加入含有新鲜底物和新鲜硫黄素T荧光染料的90微升RT-QuIC反应混合液，制备新的检测板。从第一块板的每个孔中转移10微升至新制备的96孔板中。使用封板膜密封新板。在设定好荧光检测参数后，继续进行实验，额外培养50小时。每15分钟读取并记录每孔的硫黄素T荧光信号。随后按照文本方案中所述方法收集数据并绘制图表。本研究中，将来自未感染的麋鹿或骡鹿的粪便材料在粪便提取缓冲液中进行均质化处理，以获得终浓度为10%的样本。部分均质化样本随后经过处理，并通过磷钨酸钠沉淀法浓缩10倍。尽管在纯化样本中观察到自发转化现象有所减少，但所有样本在慢性消耗性疾病（CWD）阳性粪便样本中均显示出较低的荧光信号。为了提高朊病毒的扩增效率并增强检测灵敏度，引入了底物替换步骤。在RT-QuIC实验流程中经过底物替换处理的样本，其检测的灵敏度和特异性均有提升，18份样本中有14份呈阳性，且所有阴性对照均未出现假阳性结果。一旦掌握操作要点，粪便提取物的制备以及PRP/SCRP的浓缩过程可在约4小时内完成，若操作得当，RT-QuIC检测的加样设置可在约1至2小时内完成。在操作过程中，需特别注意对底物进行过滤，但切勿涡旋振荡。按照该实验步骤，还可采用其他方法（如蛋白质印迹）来回答更多问题，例如所获得的产物对蛋白酶的抗性如何。该技术建立后，为朊病毒研究领域的科学家提供了新途径，使其能够通过检测粪便样本探索活体动物体内朊病毒的存在情况。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从粪便提取物中制备和浓缩PRP/SCRP，以及如何执行改良的RT-QuIC检测，以实现高灵敏度和高特异性的朊病毒检测。请务必注意，操作朊病毒可能具有极高危险性，因此在进行实验操作时，必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），并在生物安全柜内操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

实时颤振诱发的粪便中 CWD 朊的转化检测

本文介绍了一种新方法，用于监测免疫细胞在腹腔接种后立即摄取和转运朊病毒的过程。该方法通过纯化来自感染脑组织的聚集性朊病毒纤维，并用荧光标记，随后追踪其从注射部位的摄取与移动情况，并鉴定介导这些过程的细胞类型。...

监测免疫细胞在腹腔感染数小时后对荧光标记朊病毒纤维的迁移作用

蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）是一种用于研究朊病毒转化、毒株及物种屏障的体外实验方法，也可用作朊病毒检测实验。...

蛋白质错误折叠循环扩增朊病毒

食腐动物可能通过其粪便将具有感染性的可传播性海绵状脑病朊病毒转运至无疫区。我们详细描述了用于确定鼠源适应性羊痒病朊病毒在通过美洲乌鸦（Corvus...

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本方案描述了在福尔马林固定、石蜡包埋的活检组织中进行巨细胞病毒qPCR检测的方法，该方法快速、灵敏、特异，有助于解读难以确定的苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色结果。...

qPCR 是一种用于检测福尔马林固定、石蜡包埋活检组织中巨细胞病毒 DNA 的灵敏且快速的方法

测量朊病毒疾病跨物种传播屏障具有挑战性，通常需要通过动物攻毒实验或生化检测来完成。本文介绍了一种 体外...

评估可传播性海绵状脑病的物种屏障 体外 朊蛋白转化检测

本文提供了一种利用实时重组酶聚合酶扩增技术定量DNA样本初始浓度的实验方案，该方法可使用热循环仪或显微镜配合载物台加热器进行。同时介绍了内参阳性对照的构建方法。此外，提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。...

建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

快速准确地在现场检测植物病原体，特别是土传病原体，对于防止田间植物病害的进一步接种体产生和扩散至关重要。本研究开发的基于便携式实时PCR检测系统的方法，能够在田间条件下实现现场诊断。...

利用便携式实时PCR系统对土传植物病原体进行现场分子检测

实时定量聚合酶链式反应结合逆转录（RT-qPCR）已广泛用于检测RNA病毒感染水平。本文介绍一种直接RT-qPCR检测方法，该方法无需RNA纯化步骤，可用于包括登革病毒在内的多种RNA病毒的定量分析。...

通过实时定量聚合酶链式反应检测感染细胞培养上清液中的登革病毒RNA

本方案介绍了一种基于qRT-PCR的方法，通过体外转录技术测定牛脑不同解剖结构中狂犬病病毒核蛋白（N）基因的拷贝数。...

定量分析不同牛脑结构中的狂犬病病毒

使用免疫组织化学方案对异常朊蛋白进行免疫标记，需要特定的样本和抗PrP抗体的制备方法。本方案描述了表位去遮蔽的关键步骤，以确保PrP免疫标记的准确性，并最大限度地减少非特异性背景染色。此外，该方法在对朊病毒感染组织进行免疫组织化学研究时，也考虑了相应的生物安全措施。...

异常朊蛋白的免疫组织化学检测

目前尚缺乏一种用于评估实验室环境中朊病毒污染常见区域及有效去污染方法的检测手段。本文所述方案为实施实验室朊病毒安全拭子检测提供了关键基础，且该方法可轻松调整，以满足不同实验室的具体需求。...

朊病毒安全实验室拭子检测

了解实时颤振诱导转化检测方法，用于检测鹿科动物粪便中的慢性消耗病朊病毒。该技术具有高灵敏度和特异性，可实现高通量样本分析，为朊病毒传播研究提供可靠工具。

粪便样本中慢性消耗性疾病朊病毒的实时震动诱导转化检测法

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