粪便样本中慢性消耗性疾病朊病毒的实时震动诱导转化检测法
2017年9月29日
本文介绍一种简单、快速且高效的朊病毒扩增技术——实时震动诱导转化（RT-QuIC）方法的操作流程。
本实时震荡诱导转化检测方案的总体目标是实现对鹿科动物粪便样本中慢性消耗性疾病朊病毒的高灵敏度检测。该方法有助于解答慢性消耗性疾病研究领域中的关键问题，例如感染鹿体内的慢性消耗性疾病朊病毒何时出现在粪便中。该技术的主要优势在于其特异性强、灵敏度高，并可实现样本的高通量检测。
本实验操作将由我实验室的技术员 Ginny Cheng 演示。开始此操作时，取一克粪便样品加入含有 10 毫升粪便提取缓冲液的离心管中。使用已预设蛋白质程序的组织解离仪，在室温下将粪便样本匀浆处理一分钟。
重复此步骤两到三次，直至粪便样本完全均质化。然后用封口膜密封管子，并将其置于摇床或旋转振荡器上，在室温下孵育一小时。孵育结束后，在室温下以 18,000 ×g 离心五分钟。
收集上清液，并将其分装至1.5毫升离心管中。于-80°C保存，直至使用。开始进行磷钨酸钠沉淀法时，向1毫升粪便蛋白提取物中加入250微升Sarkosyl。
使用封口膜密封离心管。将离心管放入恒温混匀仪中，在37°C条件下以1,400 rpm持续振荡孵育30分钟。随后，加入含有10%磷钨酸钠和170毫摩尔/升氯化镁的储备液，使样品中磷钨酸钠的终浓度为3%。将样品转移至恒温混匀仪中，在37°C条件下以400 rpm持续振荡孵育2小时。
接下来，在14摄氏度下以15,800 ×g离心30分钟。小心弃去上清液，并用洗涤缓冲液重悬沉淀物以洗涤沉淀。然后在14摄氏度下以15,800 ×g离心15分钟。
小心移除上清液，并将沉淀物重悬于 100 微升 RT-QuIC 稀释缓冲液中。将处理后的样品储存于 -20 摄氏度，直至准备进行 RT-QuIC 检测。开始实验时，将 0.032 克硫黄素 T 加入 10 毫升重蒸水中，配制新鲜的 10 毫摩尔硫黄素 T 储存液。
接下来，使用重蒸水将储备液稀释10倍，得到终浓度为1毫摩尔的硫黄素T溶液。使用配备0.2微米Acro圆盘滤器的注射器过滤1毫摩尔的硫黄素T溶液。然后解冻重组朊蛋白底物。每次向100千道尔顿截留分子量的超滤管中加入500微升重组朊蛋白底物。
在室温下以 14,000 g 离心五分钟。随后，将洗脱的底物转移至无菌的 1.5 毫升离心管中。于 4 摄氏度保存，直至使用前。
接下来，解冻保存的RT-QuIC稀释缓冲液。按照文本方案中的说明稀释种子样品，并配制储备溶液和RT-QuIC反应混合液。使用带滤芯吸头的移液器，通过反复吹打混匀反应混合液。
将混合物倒入一个50毫升的一次性移液储液槽中。使用多通道移液器，向96孔光学底板的每个孔中加入98微升RT-QuIC反应混合液。向每个反应孔中加入2微升未稀释或10倍系列稀释的粪便蛋白提取物。
然后使用封板膜密封培养板。在酶标仪中于42摄氏度孵育25小时，孵育期间持续进行循环操作：以700 rpm的转速双轨道振荡1分钟，随后静置1分钟。同时，根据文本方案中所述设定荧光检测参数。
25 小时后，从酶标仪中取出培养板。以 3,000 ×g 离心 3 分钟，以避免孔间可能的污染。接着，移除培养板上的密封膜。
通过加入含有新鲜底物和新鲜硫黄素T荧光染料的90微升RT-QuIC反应混合液，制备新的检测板。从第一块板的每个孔中转移10微升至新制备的96孔板中。使用封板膜密封新板。
在设定好荧光检测参数后，继续进行实验，额外培养50小时。每15分钟读取并记录每孔的硫黄素T荧光信号。随后按照文本方案中所述方法收集数据并绘制图表。
本研究中，将来自未感染的麋鹿或骡鹿的粪便材料在粪便提取缓冲液中进行均质化处理，以获得终浓度为10%的样本。部分均质化样本随后经过处理，并通过磷钨酸钠沉淀法浓缩10倍。尽管在纯化样本中观察到自发转化现象有所减少，但所有样本在慢性消耗性疾病（CWD）阳性粪便样本中均显示出较低的荧光信号。为了提高朊病毒的扩增效率并增强检测灵敏度，引入了底物替换步骤。
在RT-QuIC实验流程中经过底物替换处理的样本，其检测的灵敏度和特异性均有提升，18份样本中有14份呈阳性，且所有阴性对照均未出现假阳性结果。一旦掌握操作要点，粪便提取物的制备以及PRP/SCRP的浓缩过程可在约4小时内完成，若操作得当，RT-QuIC检测的加样设置可在约1至2小时内完成。在操作过程中，需特别注意对底物进行过滤，但切勿涡旋振荡。
按照该实验步骤，还可采用其他方法（如蛋白质印迹）来回答更多问题，例如所获得的产物对蛋白酶的抗性如何。该技术建立后，为朊病毒研究领域的科学家提供了新途径，使其能够通过检测粪便样本探索活体动物体内朊病毒的存在情况。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从粪便提取物中制备和浓缩PRP/SCRP，以及如何执行改良的RT-QuIC检测，以实现高灵敏度和高特异性的朊病毒检测。
请务必注意，操作朊病毒可能具有极高危险性，因此在进行实验操作时，必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），并在生物安全柜内操作。
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概述
本文介绍了一种实时震动诱导转化（RT-QuIC）方法的实验方案，该技术可用于高灵敏度地检测鹿科动物粪便样本中的慢性消耗性疾病（CWD）朊病毒。该方法旨在回答有关粪便中是否存在CWD朊病毒的关键科学问题。
关键研究要素
科学领域
- 神经科学
- 朊病毒病研究
- 动物健康
背景
- 慢性消耗性疾病（CWD）影响鹿科动物，并带来严重的生态问题。
- 粪便样本中朊病毒的检测对于理解疾病传播至关重要。
- 实时震动诱导转化（RT-QuIC）是一种提高朊病毒检测灵敏度和特异性的新型方法。
- 该技术可实现样本的高通量分析。
研究目的
- 提供一种可靠的检测粪便中慢性消耗性疾病（CWD）朊病毒的实验方案。
- 促进对感染鹿科动物朊病毒排出时间的研究。
- 增进对野生动物群体中CWD传播动态的理解。
使用的方法
- 使用粪便提取缓冲液制备粪便样本。
- 利用解离仪均质化粪便颗粒。
- 应用RT-QuIC检测法进行朊病毒检测。
- 由经过培训的实验室技术人员演示操作流程。
主要结果
- RT-QuIC 方法可成功检测粪便样本中的慢性消耗性疾病（CWD）朊病毒。
- 该方案高效，可同时分析多个样本。
- 结果表明，可确定粪便中朊病毒出现的时间。
- 与传统技术相比，该方法具有高特异性和高灵敏度。
结论
- RT-QuIC 是研究和监测慢性消耗性疾病（CWD）的有力工具。
- 该方案有助于加深对鹿科动物朊病毒动态的理解。
- 未来的研究可在此方法基础上进一步探索朊病毒的传播途径。
常见问题
行业重要性概述
在粪便样本中检测朊病毒的排出情况，可实现对野生动物群体中慢性消耗性疾病进行非侵入性监测，有助于早期干预策略的制定。实时震动诱导转化（RT-QuIC）检测法为识别朊病毒的种子活性提供了一种高通量、特异性强且灵敏度高的方法，对于理解疾病传播动态并指导疾病管理决策至关重要。该方法减少了对侵入性采样的依赖，提升了在科研及野生动物健康应用中大规模监测项目的可扩展性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够将朊病毒的成核活性作为生物标志物，用于检测临床前及临床阶段的疾病存在。
- 操作价值：支持利用非侵入性样本基质对朊病毒检测方法进行功能验证。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过硫黄素T生成定量荧光读数，以实时监测淀粉样蛋白的形成。
- 操作价值：通过标准化的样品制备流程（包括基于去污剂的均质化和磷钨酸沉淀）促进检测方法的标准化。
- 科学价值：通过底物替换提高检测的灵敏度和特异性，降低背景噪声并增强真阳性信号的检出。
转化与临床前研究
- 科学价值：提供与疾病相关的系统，用于研究鹿科动物中朊病毒脱落动力学，支持转化生物标志物的比对。
- 操作价值：实现纵向采样，以追踪在疾病不同阶段粪便中朊病毒的出现和持续情况。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期发现阶段的假设验证到筛选应用的检测准备这一连续过程，尤其适用于需要非侵入性生物标志物检测的情况。
- 发现生物学：支持针对感染动物中朊病毒释放的时间和频率进行假设检验。
- 筛查：通过可重复的样本浓缩和纯化步骤实现检测就绪，最大限度减少抑制物干扰。
- 分析：生成定量的硫黄素T荧光信号，可用于比较不同样本和条件下的成纤活性。
- 转化研究：通过在活体动物中实现检测，支持纵向研究，连接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的朊病毒检测平台，经适当验证后可适用于不同样本类型和物种。
运营与企业影响
- 科学价值：通过去除抑制物并增强信号，减少假阴性结果，提高朊病毒检测的预测可信度。
- 操作价值：采用标准化的粪便样本处理和基于96孔板的检测流程，提升实验的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：提供可靠的早期检测能力，从而优化监测项目中的“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：根据目标群体中朊病毒的排泄模式，实现对研究工作的风险调整优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备朊病毒操作、生物安全二级以上实践以及基于荧光的检测方法解读方面的专业知识。
- 依赖配备振荡和温度控制功能的酶标仪、离心机和尺寸排阻滤器等设备的可及性。
- 需要跨团队对样本采集、储存（-80°C）和预处理步骤进行标准化，以确保结果一致性。
- 针对不同粪便基质的应用需进行适应性调整，可能需要优化缓冲液组成和沉淀条件。
- 存在一些实际限制，例如样本间抑制物含量可能存在差异，因此需要对纯化步骤进行经验性验证。
