Name: 病毒 DNA 的纯化及相关病毒和细胞蛋白的鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学习从HSV-1感染细胞中纯化病毒DNA并进行蛋白质组学分析的方法。该技术可鉴定病毒基因组相关蛋白，揭示细胞因子在疱疹病毒感染中的作用机制，为抗病毒治疗靶点研究提供重要依据。

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我们感谢 Hannah Fox 在准备本手稿过程中提供的帮助。本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01AI030612 的支持。

1. 细胞培养、病毒感染与EdC标记（图1）
以下方案涉及病毒操作。请参阅您所在机构关于病毒及其他生物制剂安全操作的生物安全规程。本方案已获匹兹堡大学机构审查委员会批准。
<ol>
	<li>用胰蛋白酶消化一个汇合的150 cm2 MRC-5细胞培养瓶，并将细胞转移至含有100 mL DMEM加10% FBS的600 cm2 组织培养板中。在37 °C、5% CO2条件下培养3–4天，直至细胞达到汇合状态和静止期。一个汇合的600 cm2培养皿约含有~7 × 107个细胞。为每种实验条件准备1个培养板，同时为每个相应条件准备1个阴性对照板。 
	注意：细胞必须进入静止期以抑制细胞DNA复制，确保后续步骤中仅标记和纯化病毒DNA（vDNA）。 
	注意：每个样本需配备一个相应的未标记阴性对照，该对照应采用相同的感染条件和时间点处理，但不添加EdC。 
	注意：应同时进行本实验的缩小规模版本，通过成像检测细胞DNA的标记情况，使用相似的细胞生长、感染、EdC标记条件和时间点（见步骤2）。</li>
	<li>将7 × 108 PFU HSV-1溶于7 mL冷的Tris缓冲盐水（TBS）中。移除培养基并将其置于37 °C保存。进行感染时，将7 mL稀释后的病毒液加入MRC-5细胞中，在室温下轻轻摇动1小时。吸附完成后，移除接种物，用50 mL室温TBS冲洗一次，然后换回原始培养基。在37 °C、5% CO2条件下继续培养。此步骤应针对每种实验条件及阴性对照分别进行。 
	注意：使用在病毒dUTPase（UL50基因）和/或尿嘧啶糖基化酶（UL2基因）表达方面存在缺陷的HSV-1突变株，可提高EdC的标记效率。HSV-1 dUTPase底物特异性较低，可能降低多种核苷类似物的活化效率25,27。</li>
	<li>使用EdC标记病毒基因组。根据需要选择标记进入期基因组（1.3.1）、复制中基因组（1.3.2）或病毒复制叉（1.3.3）的操作流程。 
	注意：后续分析目标分别为进入期基因组、已复制基因组或复制叉时，应分别仅执行步骤1.3.1、1.3.2或1.3.3。 
	注意：EdU或f-ara EdU可替代EdC使用。应监测并尽量减少核苷类似物的细胞毒性。
	<ol>
		<li>使用预先标记的病毒储备液执行步骤1.2中的感染操作，并在感染后4小时内（hpi）进入步骤2或步骤3，以研究未复制的vDNA（图1A）。 
		注意：预先标记的病毒储备液应按照先前描述的方案制备25。病毒储备液必须通过G-25柱以去除残留的EdC。</li>
		<li>通过向感染细胞的培养基中添加5–25 µM EdC，持续2–4小时，以标记正在复制的vDNA（图1B）。添加前，先将EdC溶于1 mL培养基中稀释。</li>
		<li>为标记病毒复制叉，在vDNA复制起始后（≥4 hpi），用5–25 µM EdC脉冲标记复制中的vDNA 5–20分钟。随后进行追踪：用含有25–100 µM 2′-脱氧胞苷（deoxyC）的追踪培养基冲洗3次，然后在含追踪培养基的条件下继续孵育20–40分钟（图1C）。 
		注意：脉冲和追踪培养基在使用前应预热平衡至37 °C并通入5% CO2。 
		注意：在脉冲-追踪实验中，需考虑核苷进入细胞并被磷酸化后才能掺入复制DNA所需的时间，该时间需通过实验确定。 
		注意：为评估脉冲-追踪实验的分辨率，应计算在所用实验条件下的病毒复制速率。可通过单步生长曲线过程中的病毒基因组定量PCR来确定26。 
		注意：若需对病毒基因组进行成像，请进入步骤2；若需纯化病毒基因组，请进入步骤3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. EdC标记DNA的成像（图2A）
注意：在实验中，将成像与病毒基因组纯化方法结合使用，有助于验证细胞DNA是否被标记。成像还可用于观察标记病毒DNA的特征，并验证蛋白质组学数据。细胞和病毒DNA染色模式的示例如图3所示。
<ol>
	<li>按照步骤1所述进行感染和EdC标记，但使用12孔细胞培养板中的盖玻片，并加入1 mL生长培养基，以缩小反应条件。</li>
	<li>用1 mL含3.7%多聚甲醛的1×PBS在室温下固定细胞15分钟。固定后，用1 mL含3% BSA的PBS洗涤细胞两次。 
	警告：多聚甲醛可造成严重或永久性损伤，请遵循安全操作规范。 
	注意：此步骤可暂停，盖玻片可在第二次洗涤液中于4 °C保存最多3天。</li>
	<li>加入1 mL通透缓冲液[见材料表]，室温下振荡孵育20分钟，对细胞进行通透处理。</li>
	<li>用1 mL含3% BSA的PBS洗涤一次，然后加入1 mL含3% BSA的PBS，室温下振荡封闭30分钟。</li>
	<li>向盖玻片加入1 mL点击反应混合液[见材料表]，使Alexa Fluor 488叠氮化物与EdC标记的DNA发生共价偶联。室温振荡孵育30分钟。吸除液体后，用1 mL PBS洗涤两次。</li>
	<li>加入1 mL用PBS按1:2,000稀释的Hoechst染料，室温振荡染色30分钟，标记细胞DNA。吸除液体后，用1 mL PBS洗涤两次。</li>
	<li>根据标准间接免疫荧光实验流程进行一抗和二抗染色25。 
	注意：标记的病毒DNA与ICP8、ICP4或UL42共定位，标记的细胞DNA与Hoechst染色信号共定位。</li>
	<li>将盖玻片封片于载玻片上，使用荧光显微镜观察细胞。 
	注意：制备好的载玻片可在4 °C保存数周。</li>
</ol>
3. vDNA 及其相关蛋白的纯化
注意：本方案的多个方面已根据 Leung et al.22 的方法进行了调整。 
注意：所有缓冲液和试剂在使用前应置于冰上预冷，除非另有说明，所有操作步骤均应在冰上进行。
<ol>
	<li>收集细胞核。 
	注意：在分离细胞核之前，可使用甲醛将蛋白质与DNA进行交联。随后在链霉亲和素包被的磁珠上进行DNA纯化时，可采用更严格的洗涤条件。有关交联及洗涤条件，请参见Sirpu 等21.
	<ol>
		<li>更换为20 mL细胞核提取缓冲液（NEB），在4 °C孵育20分钟，期间偶尔轻轻摇动。在显微镜下可见细胞核。</li>
		<li>使用细胞刮刀从培养板上刮取细胞核，并转移至50 mL锥形管中。在4 °C下以2,500 x g离心10分钟，使细胞核沉淀，弃去上清液。 
		注意：台盼蓝染色可用于验证从细胞中分离细胞核的效果。</li>
		<li>轻轻重悬10 mL PBS中的细胞核沉淀，转移至15 mL锥形离心管中，于4 °C、2,500 × g离心10分钟以收集沉淀。彻底去除PBS。 
		注意：细胞核可在此步骤冷冻并暂停实验流程。操作时，用500 µL冻存缓冲液轻柔重悬细胞核沉淀，将离心管置于乙醇/干冰浴中冷冻。冷冻后的细胞核可于-80 °C保存。使用前，于室温下解冻细胞核，迅速转移至冰上，加入10 mL PBS，轻柔摇动混匀，于4 °C、2,500 x g离心10 min以沉淀细胞核，彻底移除PBS。冷冻细胞核可能导致得率降低。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生物素叠氮化物共价偶联至EdC标记的病毒DNA。
	<ol>
		<li>将核沉淀重悬于10 mL点击反应混合液中[参见 材料表用10 mL移液管轻轻吹打5次。 
		注意：点击反应混合物中的试剂必须按照指定顺序依次加入。</li>
		<li>4 °C下旋转1小时。旋转期间，配制并预冷缓冲液B1、B2和B3［参见 材料表].</li>
		<li>以2,500 × g在4 °C离心10分钟，沉淀细胞核。彻底去除点击反应混合液，加入10 mL PBS轻轻重悬沉淀，于4 °C以2,500 × g离心10分钟，洗涤沉淀。</li>
		<li>轻轻将核沉淀重悬于1 mL PBS中，使用大孔枪头转移至1.5 mL微量离心管中。在4 °C下以2,500 × g离心10分钟，沉淀细胞核。彻底去除PBS，然后在液氮中快速冷冻。 
		注意：本实验步骤进行至此处时可暂停，冷冻的细胞核可在 -80 °C 条件下长期保存。冻融过程有助于后续裂解，因此即使在同一天继续进行 3.3 步骤，也建议将细胞核进行速冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂解细胞核并片段化DNA。
	<ol>
		<li>将细胞核在冰上解冻，然后用移液器上下吹打，重悬于500 µL缓冲液B1中。冰上孵育45分钟。</li>
		<li>使用3 mm微尖探头，以40%的振幅对样品进行6次超声处理，每次30秒。每次超声间隔将样品置于冰上冷却30秒。超声处理后，样品应呈透明状，无浑浊。 
		注意：超声处理条件应根据不同的超声仪进行优化。有关优化超声处理条件的详细说明，请参见 Leung 等22.</li>
		<li>在4 °C、14,000 × g条件下离心10分钟，沉淀细胞碎片。沉淀物体积应显著减小。将上清液通过100 µm细胞滤筛过滤，收集滤过液。</li>
		<li>向过滤后的上清液中加入500 µL Buffer B2。该样品中的900 µL将用于步骤3.4.2。</li>
		<li>取每种条件下的等分试样用于DNA提取（50 µL 或总体积的1/20），加入50 µL 2x SDS-碳酸氢盐溶液[参见 材料表]。继续进行DNA提取实验步骤（步骤3.6）。</li>
		<li>取每种条件下的等分试样作为输入蛋白（50 µL 或总体积的 1/20），加入 50 µL 2x Laemmli 上样缓冲液，液氮中速冻后于 -80 °C 保存。用于步骤 3.5.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生物素标记的DNA结合到链霉亲和素包被的磁珠上。
	<ol>
		<li>将300 µL链霉亲和素T1磁珠悬液转移至1.5 mL微量离心管中，制备磁珠。每个样本准备一管磁珠。用1 mL缓冲液B2重悬磁珠，涡旋振荡混匀，置于磁力架上分离磁珠，吸除上清液，重复洗涤3次。 
		注意：优化的结合条件可实现产量最大化和背景结合最小化。实验确定，链霉亲和素T1磁珠的结合容量显著高于琼脂糖珠及其他链霉亲和素珠，且背景结合低于链霉亲和素C1珠。图4A).</li>
		<li>将3.3.4步骤中900 µL的样品加入洗涤后的磁珠中，4 °C旋转孵育过夜。 
		注意：样本加入磁珠后，切勿涡旋振荡。 
		注意：如果在未标记的阴性对照中分离出大量 DNA 或蛋白质，可将此步骤从过夜缩短至 4 小时，以减少背景结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤磁珠并洗脱病毒DNA及其相关蛋白。 
	注意：建议在后续步骤中使用滤芯吸头。
	<ol>
		<li>将样品放入磁力微型离心管架中，弃去上清液，加入1 mL B2缓冲液轻轻重悬，在4 °C下旋转5分钟。</li>
		<li>重复步骤 3.5.1 三次。</li>
		<li>将样品放入磁力微型离心管架中，去除上清液，加入1 mL B3缓冲液轻轻重悬，并在4 °C下旋转5分钟。</li>
		<li>转移100 µL珠子混合物（1/10th 将体积转移至新管以进行结合DNA的分离。将该管置于磁力架上，弃去上清液，用100 µL 1x SDS-碳酸氢盐溶液重悬磁珠，随后进行DNA分离实验步骤（第3.6步）。</li>
		<li>将步骤3.5.3中剩余的900 µL珠子混合物所在的离心管置于磁架上，去除上清液，再用50 µL 2x Laemmli上样缓冲液重悬珠子，以洗脱蛋白质及DNA-蛋白质复合物。</li>
		<li>在95 °C下煮沸样品15分钟，涡旋振荡，短暂离心，置于磁力架上。将洗脱液转移至新管，速冻后于-80 °C保存。 
		注意：使用管盖锁紧装置，以确保在煮沸过程中管盖不会弹开。 
		注意：本实验步骤可在此处暂停，样品可在 -80 °C 保存数周。</li>
		<li>通过考马斯亮蓝染色、蛋白质印迹或质谱分析蛋白质样品，采用标准实验流程25代表性结果如图所示 图4 和 图5. 
		注意：为确定蛋白产量是否足以用于质谱分析，每份样品各取7.5 µL用于考马斯亮蓝染色分析，另取7.5 µL用于检测一种代表性病毒基因组相关蛋白（ICP4、ICP8或UL42）的Western印迹。同时平行运行第3.3.6步所得裂解液的相同体积样本，以对照上样蛋白量。剩余样品（35 µL）则按前述方法进行质谱分析。25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 提取
	<ol>
		<li>将3.3.5和3.5.4步骤中的样品在65 °C孵育4–16小时。如有需要，将样品从磁珠中分离。</li>
		<li>用150 µL酚:氯仿:异戊醇（PCI）抽提样品，将水相转移至新离心管中。</li>
		<li>用100 µL Tris-EDTA（TE）缓冲液提取剩余的PCI，将水相加入新离心管中。</li>
		<li>用 200 µL 氯仿:异戊醇（24:1）抽提样品。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒，按照制造商提供的方案纯化水相。 
		注意：PB缓冲液中的pH指示剂在加入样品后会变为紫色。加入10 µL 3M NaOAc（pH 5.0）以降低样品的pH值。</li>
		<li>使用荧光计测定DNA浓度。 
		注意：该实验方案通常可获得 100 - 400 ng 磁珠结合的 DNA。在第 1.3 步未添加 EdC 的阴性对照中，洗脱液中不应检测到 DNA。</li>
		<li>DNA 可储存于低吸附DNA管中，于4或-20 °C保存，可用于实时PCR或高通量测序分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案包含多个步骤，若未仔细操作，可能导致蛋白质得率显著降低或样品被细胞DNA污染。所有实验必须使用处于静止期的细胞，以确保细胞DNA不会被标记并纯化。这一点可通过检测蛋白质样品中是否存在细胞DNA聚合酶来验证，因为HSV-1在基因组合成过程中不利用细胞DNA聚合酶。在EdC标记和细胞核收集步骤中，应错开处理各样品，以确保每个样品的处理条件一致。在纯化过程中，应避免通过过度移液操作细胞核。过度移液可能导致细胞核提前裂解，并因样品黏附于移液枪头内壁而造成损失。此外，超声处理步骤应根据不同的超声仪进行优化，且用于结合生物素的链霉亲和素包被磁珠的用量应进行滴定，以获得最佳的蛋白质得率。
本实验方案可进行多种修改，包括使用不同的病毒或细胞类型，或增加蛋白质与DNA交联的步骤。在选择用于蛋白质组学研究的细胞类型时，重要的是要确认该物种是否存在可用的蛋白质序列数据库。缺乏蛋白质组学资源将显著限制后续的蛋白质数据分析。另一个局限性是需要大量细胞，因此可能难以为此实验准备足够的原代细胞（如神经元）。只要病毒感染不依赖于细胞DNA复制，该方法应适用于其他DNA或RNA病毒。此外，研究HSV-1突变体...

病毒自身执行基本功能的能力有限，因此依赖宿主因子来促进感染过程中的关键环节，包括病毒基因表达、复制、修复、重组和转运。这些宿主因子的功能通常被病毒编码的蛋白质所增强。此外，病毒必须逃避细胞对病毒感染的识别和干扰。因此，病毒与宿主的相互作用决定了感染的结局。尤为重要的是理解病毒如何改变细胞环境，以改造细胞机制来促进病毒自身的生命活动。特别值得关注的是，在整个感染周期中，有哪些因子和过程作用于病毒基因组。
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种双链DNA病毒，可感染大部分人类群体。在感染后的第一个小时内，病毒基因组进入细胞核，在核内，病毒基因表达按一定顺序级联发生，并与病毒DNA（vDNA）复制相协调1。在细胞核内，病毒基因组会受到表观遗传调控，经历修复和重组过程，并被包装进衣壳中，使得首批子代病毒粒子在不到六小时内即可产生。在整个感染过程中对与病毒基因组相关蛋白进行全面评估，将为研究作用于病毒基因组的各类分子机制奠定基础，并有助于揭示在感染不同阶段中所涉及的病毒和宿主细胞因子。
以往研究病毒感染过程中宿主因子的方法包括利用病毒蛋白的亲和纯化来分析与其结合的细胞蛋白2,3,4,5,6,7,8,9。这些检测方法在鉴定参与宿主抗病毒反应、病毒染色质修饰、基因表达以及DNA修复的细胞因子方面发挥了重要作用。然而，难以确定这些相互作用是否依赖于与病毒DNA（vDNA）的结合，且蛋白质组学仅能揭示由特定病毒因子介导的相互作用。染色质免疫沉淀（ChIP）已被用于确定特定病毒和细胞蛋白在病毒基因组上的结合位点10,11,12,13,14,15，而荧光原位杂交（FISH）与免疫细胞化学相结合则实现了对与vDNA共定位的细胞因子的可视化检测16,17,18,19,20。这些实验方法支持对相互作用进行时空动态分析。但其局限性包括需要高度特异性的抗体、灵敏度有限，以及依赖于对病毒-宿主相互作用的先验认知。因此，我们开发了一种基于iPOND（新生DNA上蛋白的分离，isolation of proteins on nascent DNA）21和aniPOND（加速型天然iPOND，accelerated native iPOND）22的方法，可选择性地标记并从感染细胞中纯化vDNA，进而通过质谱技术无偏倚地鉴定与病毒基因组相关联的蛋白质。iPOND技术在细胞复制叉动态的研究中已发挥关键作用。
为了从感染细胞中选择性纯化病毒基因组，可利用乙炔基修饰的核苷类似物5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）或5-乙炔基-2′-脱氧胞苷（EdC）对正在复制的病毒DNA（vDNA）进行标记（图1），随后通过点击化学反应将其共价连接至生物素叠氮化物，从而实现病毒基因组及其相关蛋白在链霉亲和素包被的磁珠上的单步纯化（图2B）。重要的是，感染实验在静止期细胞中进行，这些细胞不进行细胞DNA复制，从而确保vDNA的特异性标记。此外，HSV-1感染可导致细胞周期阻滞并抑制细胞DNA复制23,24。病毒可在感染前预先标记，用于分析与进入细胞的病毒基因组相关的蛋白质（图1A）；也可在DNA复制过程中进行标记，用于分析与新合成vDNA相关的蛋白质（图1B）25。此外，脉冲追踪分析可用于研究与病毒复制叉相关蛋白的性质（图1C）26。另外，乙炔基修饰的vDNA还可共价连接荧光染料，用于研究蛋白质动态的空间分布（图2A和图3）。成像技术可直接可视化vDNA，是验证vDNA-蛋白质相互作用的补充方法，并可被改造用于追踪整个感染过程中病毒基因组的动态变化。我们预计，这些方法可进一步改进，用于研究疱疹病毒感染的各个方面，包括潜伏感染与再激活过程，也可拓展至其他DNA病毒的研究。此外，使用5-乙炔基尿苷（EU）进行标记，还可用于RNA病毒基因组的分析。

<table><tbody><tr><td>MRC-5 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>吉布科（Gibco）</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>吉布科（Gibco）</td><td>12800-082</td><td>添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、12 mM&amp;nbsp;（用于瓶中培养）或 30 mM（用于皿中培养）碳酸氢钠</td></tr><tr><td>600 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养皿</td><td>赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐水（TBS），pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl、5 mM KCl、491 mM MgCl、680 mM CaCl、25.1 mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 储备液</td><td></td><td></td><td>滴度高于 1×10&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; PFU/mL 的储备液效果最佳</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&amp;nbsp;柱（PD-10 脱盐柱）</td><td>GE 医疗集团（GE Healthcare）</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>费希尔科技（Fisher Scientific）</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;acute;-乙炔基-2&amp;acute;-脱氧胞苷（EdC）</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>T511307</td><td>溶于 DMSO 配制成 40 mM 储备液，分装后于 -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;保存</td></tr><tr><td>2&amp;acute;-脱氧胞苷（deoxyC）</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>D3897</td><td>溶于水配制成 40 mM 储备液，分装后于 -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;保存</td></tr><tr><td>核提取缓冲液（NEB）</td><td></td><td></td><td>现配现用（20 mM Hepes pH 7.2、50 mM NaCl、3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、300 mM 蔗糖、0.5% Igepal）</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>贝尔科玻璃（Bellco glass）</td><td>7731-22000</td><td>使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.2（10x）</td><td></td><td></td><td>1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、18 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（使用前用无菌水稀释至 1x）</td></tr><tr><td>五水合硫酸铜（CuSO4-5H2O）</td><td>费希尔科技（Fisher Scientific）</td><td>C489</td><td>配制 100 mM 储备液，4 &amp;deg;C 保存不超过 1 个月</td></tr><tr><td>(+) L-抗坏血酸钠</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>A4034</td><td>新鲜配制 100 mM 储备液，使用前置于冰上保存</td></tr><tr><td>生物素叠氮化物</td><td>英维特罗根（Invitrogen）</td><td>B10184</td><td>用 DMSO 配制成 10 mM 储备液，分装后于 -20 &amp;deg;C 保存，最长可保存 1 年&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>点击反应混合液</td><td></td><td></td><td>使用前立即按指定顺序加入试剂配制（10 mL：8.8 mL 1x PBS、200 mL 100 mM CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、25 mL 10 mM 生物素叠氮化物、1 mL 100 mM 抗坏血酸钠）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂混合液</td><td>罗氏（Roche）</td><td>11697498001</td><td>溶于 1 mL 水中配制成 50x 储备液，4 &amp;deg;C 保存不超过 1 周，或直接将 1 片加入 50 mL 缓冲液中</td></tr><tr><td>冻存缓冲液</td><td></td><td></td><td>现配现用（7 mL 100% 甘油、3 mL NEB、200 &amp;mu;L 50x 蛋白酶抑制剂）</td></tr><tr><td>缓冲液 B1</td><td></td><td></td><td>现配现用（25 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、1% Igepal、1x 蛋白酶抑制剂）</td></tr><tr><td>缓冲液 B2</td><td></td><td></td><td>现配现用（150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、0.5% Igepal、1x 蛋白酶抑制剂）</td></tr><tr><td>缓冲液 B3</td><td></td><td></td><td>现配现用（150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、1x 蛋白酶抑制剂）</td></tr><tr><td>配备 3 mm 微型探头的 Vibra Cell 超声波处理器</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>法尔肯（Falcon）</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 磁珠</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>微型管旋转仪</td><td>费希尔科技（Fisher Scientific）</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli 上样缓冲液</td><td></td><td></td><td>将 400 mg SDS、2 mL 100% 甘油、1.25 mL 1 M Tris（pH 6.8）和 10 mg 溴酚蓝溶于 8 mL 水中。4&amp;nbsp; &amp;deg;C 保存不超过 6 个月。使用前加入 1 M DTT 至终浓度 200 mM。</td></tr><tr><td>1.5 mL 管帽锁</td><td>费希尔科技（Fisher Scientific）</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>常规 Western 印迹试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOVEX 胶体蓝染色试剂盒</td><td>英维特罗根（Invitrogen）</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12 孔组织培养皿</td><td>康宁（Corning）</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>费希尔科技（Fisher Scientific）</td><td>12-545-100</td><td>使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>费希尔科技（Fisher Scientific）</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% 戊二醛</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>15710</td><td>使用前用 1x PBS 稀释至 3.7%</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>费希尔科技（Fisher Scientific）</td><td>BP1605</td><td>用 1x PBS 配制成 3%</td></tr><tr><td>通透缓冲液（0.5% Triton-X 100）</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>T8787</td><td>用 1x PBS 配制成 0.5% Triton-X 100</td></tr><tr><td>点击反应混合液 — Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试剂盒</td><td>分子探针（Molecular Probes）</td><td>C10337</td><td>按照制造商说明书配制</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>H1399</td><td>用纯水配制成 10 mg/mL，4 &amp;deg;C 保存不超过 1 年</td></tr><tr><td>小鼠抗 ICP8 一抗</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>用 1x PBS 按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>小鼠抗 UL42 一抗（2H4）</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>用 1x PBS 按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 594 标记二抗</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>a11005</td><td>用 1x PBS 按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>Immu-mount 封片剂</td><td>赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-碳酸氢盐溶液</td><td></td><td></td><td>2% SDS、200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td></td><td></td><td>按 25:24:1 混合，至少在使用前 1 天配制，4 &amp;deg;C 避光保存</td></tr><tr><td>氯仿:异戊醇</td><td></td><td></td><td>按 24:1 混合，至少在使用前 1 天配制，室温避光保存</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA（TE），pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris、10 mM EDTA（使用前稀释至 1x）</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 纯化试剂盒</td><td>凯杰（Qiagen）</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M 乙酸钠，pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>英维特罗根（Invitrogen）</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>英维特罗根（Invitrogen）</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>英维特罗根（Invitrogen）</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>配备成像软件的荧光显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>适用于 1.5 mL 管的微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>适用于 15 和 50 mL 管的台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td></td><td></td><td>65 &amp;deg;C 和 95 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

用于鉴定相关病毒和细胞蛋白的病毒dna纯化

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

本实验方案的目的是从感染细胞中分离单纯疱疹病毒1型（HSV-1）DNA，以通过质谱技术鉴定与之相关的病毒和宿主细胞蛋白。尽管与病毒基因组相互作用的蛋白在决定感染结局中发挥关键作用，但此前尚无法对与病毒基因组结合的蛋白进行全面分析。本文展示了一种可直接从感染细胞中纯化HSV-1基因组的方法。通过在复制中的病毒DNA中选择性地掺入含有炔基官能团的修饰核苷酸对其进行标记。随后，利用铜(I)催化的叠氮-炔基环加成反应（即“点击”反应），将生物素叠氮物共价连接至标记的DNA上，实现特异性且不可逆的标记。生物素标记的DNA通过链霉亲和素包被的磁珠进行纯化，与其结合的蛋白被洗脱后通过质谱进行鉴定。该方法可实现从复杂的生物环境中选择性靶向并分离HSV-1复制叉或完整基因组。此外，该策略的进一步优化将有助于研究疱疹病毒感染的多个方面，也可用于其他DNA病毒基因组的相关研究。

利用点击化学方法从细胞中纯化DNA最早由iPOND技术实现21。iPOND的目的是纯化细胞中的复制叉，以鉴定与其相关的蛋白质。我们已对该技术进行改进，专门用于研究病毒感染过程中病毒DNA（vDNA）与蛋白质的相互作用。通过改造该方法，使用EdC标记病毒基因组（图1），并结合同步化感染，可实现对不同vDNA群体的选择性分离与分析。HSV-1 DNA通过EdC标记（图1），便于共价连接荧光染料用于成像或连接生物素用于纯化（图2）。病毒可在感染前预先标记，以分析与进入细胞的基因组相关联的蛋白质（图1A）；也可在DNA复制过程中进行标记，以分析与新合成的vDNA相关联的蛋白质（图1B）25。...

本实验方案的目的是特异性标记并选择性分离感染细胞中的病毒DNA，以用于表征与病毒基因组相关的蛋白质。

用于鉴定相关病毒和细胞蛋白的病毒DNA纯化

本实验方案的目的是从感染细胞中分离单纯疱疹病毒1型（HSV-1）DNA，以鉴定与其相关的病毒和...

本方法的总体目标是从感染细胞中纯化单纯疱疹病毒1型DNA，以进行病毒基因组相关蛋白的蛋白质组学分析。该方法可深入揭示细胞因子在单纯疱疹病毒感染过程中的作用。该技术的主要优势在于，可针对感染细胞中不同类型的病毒DNA进行直接纯化，从而实现对感染过程多个方面的分析。按照文本方案所述，首先培养 MRC 五细胞。然后，用冷的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）稀释 HSV-1。在后续步骤中，重要的是关闭吹风机和组织培养罩，以防止细胞干燥。使用移液器将MRC 5细胞的培养基转移至无菌瓶中，待感染后加回细胞。通过向细胞中加入7 mL稀释后的病毒来感染细胞。在室温下每10分钟轻轻摇动细胞一次，持续1小时。吸收后，吸除接种物，用50毫升室温TBS洗涤细胞，并更换为原始培养基。随后，在37°C、5% CO₂条件下培养细胞。在病毒感染后约4小时，即病毒DNA复制开始时，对正在复制的病毒DNA进行标记。为此，将EdC溶于1毫升培养基中，并加入感染细胞的细胞培养基中，孵育2至4小时。为收集细胞核，将培养基替换为20毫升细胞核提取缓冲液，在4摄氏度下孵育20分钟，期间偶尔轻轻摇动。孵育结束后，用细胞刮刀将细胞核从培养板上刮下，并转移至预冷的50毫升锥形管中。在 2,500 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟，使细胞核沉淀。离心后，弃去上清液。用 10 毫升磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻重悬核沉淀，并转移至 50 毫升锥形管中。然后，像之前一样离心样品。完全去除 PBS 后，用 10 毫升点击反应混合液重悬核沉淀物，使用 10 毫升移液器轻轻吹打上下混合五次。在 4°C 下旋转孵育样品一小时，然后像之前一样离心收集细胞核。彻底去除快速反应混合液，然后用10毫升PBS轻轻重悬沉淀进行洗涤，并再次离心。现在，用1毫升PBS小心地重悬细胞核沉淀，将溶液转移至1.5毫升微量离心管中。离心后，彻底去除PBS，并将沉淀在液氮中快速冷冻。此时，沉淀物可保存在 -80 °C，或继续进行后续操作。为了裂解细胞核并片段化 DNA，用移液器将解冻的细胞核重悬于 500 µL 缓冲液 B1 中，上下吹打混匀。将悬液置于冰上孵育 45 分钟。然后，使用3毫米微尖探头，以40%的振幅对样品进行六次超声处理，每次30秒。每次超声间隔期间，将样品置于冰上至少30秒。超声处理后，样品应呈现澄清状态，而非浑浊。在4°C条件下，以14,000 × g离心10分钟，使细胞碎片沉淀。沉淀物体积应显著减少，将上清液通过100微米细胞滤筛过滤，并收集滤过液。然后，向滤过的上清液中加入500微升缓冲液B2。为了将生物素标记的DNA结合到链霉亲和素包被的磁珠上，需先将300微升珠悬浮液转移至1.5毫升微量离心管中以制备链霉亲和素磁珠。每个样品准备一管磁珠。用1毫升B2缓冲液涡旋重悬磁珠，然后将管置于磁力架上分离磁珠，并吸除洗涤缓冲液，重复此洗涤步骤三次。然后，将900微升样品加入已洗涤的磁珠中。剩余的样品将用于输入DNA和蛋白质的分离。在4°C下旋转孵育过夜。第二天，将样品放入磁力微型离心管架中，移除上清液。用1毫升缓冲液B2轻轻重悬珠子，然后在4摄氏度下旋转5分钟。再次使用磁力微型离心管架移除上清液。此次，将珠子在1毫升缓冲液B3中轻轻重悬，于4摄氏度旋转孵育5分钟。使用磁铁去除珠子混合物中的上清液后，将珠子重悬于50微升2x Laemmli上样缓冲液中，以洗脱DNA-蛋白质复合物。接着，将样品在95摄氏度下煮沸15分钟。在微量离心机中快速离心样品前，先将混合物涡旋混匀。将样品置于磁铁上，转移上清液至新离心管中。最后将样品迅速冷冻，并于 -80 °C 保存。按照文本方案所述进行蛋白质分析。EdC标记分别进行0、20、40或60分钟，随后纯化病毒DNA及其结合的蛋白质。洗脱的蛋白质经考马斯亮蓝染色，并使用针对病毒DNA结合蛋白ICP4和UL42的特异性抗体进行Western印迹分析。箭头指示在洗脱过程中从磁珠上脱落的链霉亲和素，该蛋白在所有条件下均存在。通过此方法分离的蛋白质随后进行质谱分析。饼图展示了在感染后六小时与单纯疱疹病毒1型基因组相关联的各功能类别蛋白质的数量。利用 STRING 功能蛋白关联网络数据库，对已鉴定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用进行了更深入的分析。结果揭示了在同一生物学过程中协同发挥作用的蛋白质亚复合物。观看本视频后，您应能够充分理解如何从感染细胞中纯化病毒 DNA，以开展与病毒基因组相关蛋白的蛋白质组学研究。该技术可在三到四天内完成。在进行此操作时，重要的是要注意采取预防措施，防止样品受到DNA酶或蛋白酶的污染。除了本方法外，还可采用免疫荧光等其他方法来验证EdC标记的病毒DNA的性质。该技术为疱疹病毒学领域的研究人员探索宿主蛋白功能与病毒感染机制铺平了道路。

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

病毒 DNA 的纯化及相关病毒和细胞蛋白的鉴定

甲型流感病毒的基因组由八个独立的RNA和蛋白质复合物组成，称为病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍了甲型流感病毒vRNPs的甘油梯度纯化及其透射电子显微镜观察方法。...

甲型流感病毒核糖核蛋白复合物的纯化与可视化

我们描述了从感染细胞中分离高纯度疱疹病毒核衣壳DNA的方法。从溶液中最终捕获的DNA具有高浓度和高纯度，非常适合用于高通量测序、高保真PCR反应以及转染以产生新的病毒重组体。...

从核衣壳中制备病毒DNA

串联亲和纯化是一种用于鉴定蛋白质结合伴侣的可靠方法。作为概念验证，该方法已应用于研究较为深入的翻译起始因子...

使用串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用伙伴

单病毒基因组学（SVG）是一种用于分离和扩增单个病毒颗粒基因组的方法。通过流式细胞术将混合病毒悬液分选到含有琼脂糖的载玻片微孔中，从而捕获单个病毒颗粒，并在后续处理过程中减少基因组剪切。利用多重置换扩增（MDA）实现全基因组扩增，获得适用于测序的基因组材料。...

单病毒基因组学用于单个病毒颗粒的分离与基因组分析

流感病毒在与宿主细胞染色质相关联的情况下复制其RNA基因组。本文介绍一种从感染细胞的染色质中纯化完整病毒核糖核蛋白复合物的方法。所获得的纯化病毒复合物可通过Western...

从感染细胞的染色质中亲和纯化流感病毒核糖核蛋白复合物

以囊性纤维化气道为例，该论文提出了一套综合性的实验流程，结合宏基因组学和宏转录组学方法，用于表征与动物相关的样本中的微生物和病毒群落。...

纯化不纯：从复杂的动物相关样本中测序宏基因组和宏转录组

我们提供了一种从腺病毒（Ad）感染的人类细胞中分离病毒复制区室（RC）的新策略。该方法代表了一种无细胞体系，有助于阐明调控病毒基因组复制与表达的分子机制，以及在复制区室处建立的病毒-宿主相互作用的调控机制。...

从腺病毒感染的正常人细胞中分离富含病毒复制区室的核内组分

本文介绍了一种鉴定具有双链DNA基因组植物病毒的新方法。我们采用标准方法从感染的叶片中提取DNA和RNA，并进行高通量测序。生物信息学工具将测序结果组装成重叠群，识别代表病毒基因组的重叠群，并将这些基因组归类到相应的分类群中。...

结合粗提病毒颗粒中的DNA分析与感病叶片中的RNA分析以发现新病毒基因组

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

本文介绍了一种用于检测抗原展示型病毒样颗粒（VLPs）上中和表位的实验方案。利用与蛋白G偶联磁珠结合的包膜糖蛋白特异性单克隆抗体，对来源于人类免疫缺陷病毒（HIV）的VLPs进行免疫沉淀。捕获的VLPs随后通过SDS-PAGE分离，并使用针对病毒核心蛋白Gag的特异性抗体进行Western印迹分析。...

利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

学习从HSV-1感染细胞中纯化病毒DNA并进行蛋白质组学分析的方法。该技术可鉴定病毒基因组相关蛋白，揭示细胞因子在疱疹病毒感染中的作用机制，为抗病毒治疗靶点研究提供重要依据。

用于鉴定相关病毒和细胞蛋白的病毒DNA纯化

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