用于鉴定相关病毒和细胞蛋白的病毒DNA纯化

本方法的总体目标是从感染细胞中纯化单纯疱疹病毒1型DNA，以进行病毒基因组相关蛋白的蛋白质组学分析。该方法可深入揭示细胞因子在单纯疱疹病毒感染过程中的作用。该技术的主要优势在于，可针对感染细胞中不同类型的病毒DNA进行直接纯化，从而实现对感染过程多个方面的分析。

按照文本方案所述，首先培养 MRC 五细胞。然后，用冷的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）稀释 HSV-1。在后续步骤中，重要的是关闭吹风机和组织培养罩，以防止细胞干燥。

使用移液器将MRC 5细胞的培养基转移至无菌瓶中，待感染后加回细胞。通过向细胞中加入7 mL稀释后的病毒来感染细胞。在室温下每10分钟轻轻摇动细胞一次，持续1小时。

吸收后，吸除接种物，用50毫升室温TBS洗涤细胞，并更换为原始培养基。随后，在37°C、5% CO₂条件下培养细胞。在病毒感染后约4小时，即病毒DNA复制开始时，对正在复制的病毒DNA进行标记。

为此，将EdC溶于1毫升培养基中，并加入感染细胞的细胞培养基中，孵育2至4小时。为收集细胞核，将培养基替换为20毫升细胞核提取缓冲液，在4摄氏度下孵育20分钟，期间偶尔轻轻摇动。孵育结束后，用细胞刮刀将细胞核从培养板上刮下，并转移至预冷的50毫升锥形管中。

在 2,500 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟，使细胞核沉淀。离心后，弃去上清液。用 10 毫升磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻重悬核沉淀，并转移至 50 毫升锥形管中。

然后，像之前一样离心样品。完全去除 PBS 后，用 10 毫升点击反应混合液重悬核沉淀物，使用 10 毫升移液器轻轻吹打上下混合五次。在 4°C 下旋转孵育样品一小时，然后像之前一样离心收集细胞核。

彻底去除快速反应混合液，然后用10毫升PBS轻轻重悬沉淀进行洗涤，并再次离心。现在，用1毫升PBS小心地重悬细胞核沉淀，将溶液转移至1.5毫升微量离心管中。离心后，彻底去除PBS，并将沉淀在液氮中快速冷冻。

此时，沉淀物可保存在 -80 °C，或继续进行后续操作。为了裂解细胞核并片段化 DNA，用移液器将解冻的细胞核重悬于 500 µL 缓冲液 B1 中，上下吹打混匀。将悬液置于冰上孵育 45 分钟。

然后，使用3毫米微尖探头，以40%的振幅对样品进行六次超声处理，每次30秒。每次超声间隔期间，将样品置于冰上至少30秒。超声处理后，样品应呈现澄清状态，而非浑浊。

在4°C条件下，以14,000 × g离心10分钟，使细胞碎片沉淀。沉淀物体积应显著减少，将上清液通过100微米细胞滤筛过滤，并收集滤过液。然后，向滤过的上清液中加入500微升缓冲液B2。

为了将生物素标记的DNA结合到链霉亲和素包被的磁珠上，需先将300微升珠悬浮液转移至1.5毫升微量离心管中以制备链霉亲和素磁珠。每个样品准备一管磁珠。用1毫升B2缓冲液涡旋重悬磁珠，然后将管置于磁力架上分离磁珠，并吸除洗涤缓冲液，重复此洗涤步骤三次。

然后，将900微升样品加入已洗涤的磁珠中。剩余的样品将用于输入DNA和蛋白质的分离。在4°C下旋转孵育过夜。

第二天，将样品放入磁力微型离心管架中，移除上清液。用1毫升缓冲液B2轻轻重悬珠子，然后在4摄氏度下旋转5分钟。再次使用磁力微型离心管架移除上清液。

此次，将珠子在1毫升缓冲液B3中轻轻重悬，于4摄氏度旋转孵育5分钟。使用磁铁去除珠子混合物中的上清液后，将珠子重悬于50微升2x Laemmli上样缓冲液中，以洗脱DNA-蛋白质复合物。接着，将样品在95摄氏度下煮沸15分钟。

在微量离心机中快速离心样品前，先将混合物涡旋混匀。将样品置于磁铁上，转移上清液至新离心管中。最后将样品迅速冷冻，并于 -80 °C 保存。

按照文本方案所述进行蛋白质分析。EdC标记分别进行0、20、40或60分钟，随后纯化病毒DNA及其结合的蛋白质。洗脱的蛋白质经考马斯亮蓝染色，并使用针对病毒DNA结合蛋白ICP4和UL42的特异性抗体进行Western印迹分析。

箭头指示在洗脱过程中从磁珠上脱落的链霉亲和素，该蛋白在所有条件下均存在。通过此方法分离的蛋白质随后进行质谱分析。饼图展示了在感染后六小时与单纯疱疹病毒1型基因组相关联的各功能类别蛋白质的数量。

利用 STRING 功能蛋白关联网络数据库，对已鉴定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用进行了更深入的分析。结果揭示了在同一生物学过程中协同发挥作用的蛋白质亚复合物。观看本视频后，您应能够充分理解如何从感染细胞中纯化病毒 DNA，以开展与病毒基因组相关蛋白的蛋白质组学研究。

该技术可在三到四天内完成。在进行此操作时，重要的是要注意采取预防措施，防止样品受到DNA酶或蛋白酶的污染。除了本方法外，还可采用免疫荧光等其他方法来验证EdC标记的病毒DNA的性质。

该技术为疱疹病毒学领域的研究人员探索宿主蛋白功能与病毒感染机制铺平了道路。