Name: 基于芯片的三维细胞培养，在灌注微生物反应器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-21T20:23:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 学习基于芯片的三维细胞培养技术，在灌注微生物反应器中实现高密度细胞培养。该方法通过胶原蛋白涂层促进细胞粘附，可在无菌闭环系统中培养多达1000万个细胞，适用于药物测试和组织工程研究。

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我们感谢Mechthild Herschbach和Anke Dech提供的出色技术协助。

本文介绍了一种基于芯片的平台（图1），用于细胞系以及原代细胞的三维培养。由于许多细胞仅在三维环境中才能表达器官特异性功能，我们开发了一种聚合物芯片，该芯片可为细胞提供可在所有空间方向上黏附的支架，并可安装于生物反应器外壳中，以调控流体流动、氧张力等条件。根据实验设计的不同，可通过多种技术对聚合物表面进行修饰，例如紫外照射、等离子体增强化学气相沉积（PECVD）、γ射线接枝或传统的湿法化学处理。
<img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_6/564_Figure-01.png" alt="材料分析用三维结构与扫描电镜图像的微加工示意图。" width="546" height="386" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="564_Figure-01.png">
图 01

1. 芯片的脱气与亲水化处理
使用前，芯片必须进行脱气和亲水化处理。为此，需进行一系列酒精处理。配制含有100%、70%、50%、30%异丙醇的DMPC处理水溶液，将芯片依次浸入各浓度溶液中，从100%溶液开始，每步不超过30秒。该系列处理的最后一步是使用纯二甲基焦碳酸酯（DMPC）处理水。自此之后，必须始终保持芯片湿润。
2. I型胶原包被
经过酒精系列处理后，芯片通常会用大鼠尾部来源的I型胶原溶液进行包被。从浓度为2 mg/ml、溶于0.2%乙酸的胶原蛋白储备液中取一份相当于30 μg胶原蛋白的 aliquot，用DMPC处理过的水稀释至终体积150 μl。这样可在芯片表面形成每cm2面积上含10 μg I型胶原蛋白的包被密度。
3. 肝细胞癌细胞的接种
将 Hep G2 细胞系的肝细胞癌细胞进行胰蛋白酶消化并计数。对于短期实验（1 至 6 天），将 5×106 个细胞接种至每个芯片以及相应的对照 6 cm 组织培养培养皿中。接种时，将 5×106 个细胞重悬于 150 μl 培养基中，并加至芯片的微结构区域上方（图 2）。随后，将芯片置于培养箱中孵育 2–3 小时。在此孵育期间，细胞沉降进入微容器中，并黏附于 I 型胶原包被的支架上。
<img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_7/564_Figure-02.png" alt="静态平衡；ΣFx=0；实验装置；培养皿中带有样品的显微镜载玻片。" width="300" height="225" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="564_Figure-02.png">
图2
4. 将芯片插入生物反应器外壳
孵育结束后，将芯片从培养箱中取出，并安装到生物反应器外壳中。在超净台内，将预先组装好的生物反应器从无菌包装中取出，并部分拆解，以便插入芯片。使用无菌镊子小心操作芯片，将其放入带有密封垫圈的凹槽中，该垫圈可密封芯片，并在生物反应器内形成上、下两个腔室。随后，重新组装生物反应器，并转移至培养箱中，连接泵、气体供应装置和氧气分析仪。
5. 系统填充
当生物反应器与培养基储液罐、泵和气体供应连接后，即可向封闭循环回路中注入培养基。通过调整三通连接器的位置，使培养基流经芯片表面（即所谓的灌流），从而排出生物反应器循环系统中的封闭空气，同时不会将细胞从支架上冲走。当系统完全充满培养基后，将三通连接器切换至另一种状态，使培养基从芯片下方流经组织（即所谓的灌注）。在灌注模式下，流速需根据细胞需求进行调节，肝细胞的典型流速范围通常为 60–500 μl/min。
6. 取样
实验过程中可采集培养基样品。采集时，将注射器连接至培养基储液罐顶部的无菌取样口。取样后，用70%异丙醇对取样口进行消毒。
7. 从芯片中分离完整细胞用于下游应用
实验结束后，将生物反应器从气体供应系统和滚轴泵上断开，转移至超净工作台，并按前述方法拆卸。使用无菌镊子将芯片从生物反应器外壳中取出，放入3.5 cm的培养皿中，并用PBS冲洗。随后，将芯片置于含胰蛋白酶/EDTA（0.25%/0.53 mM）的孵育箱中孵育5–15分钟，以使细胞从微结构区域脱落。收集的细胞悬液在600 ×g条件下离心5分钟。所得细胞可用于常规的下游应用，例如总RNA或蛋白质的提取。常规操作中，我们使用总RNA（PARIS试剂盒，Ambion Inc.，Austin, Texas, USA）进行微阵列分析和实时RT-PCR。芯片内细胞的蛋白表达可通过激光扫描共聚焦显微镜进行免疫组织化学染色后分析，也可采用其他方法分析，例如流式细胞术。

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+3.+Enzymatic+requirements+for+tissue+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion.</a> Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).</li>
<li>Welle, A., Gottwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-based+patterning+of+polymeric+substrates+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications.</a> Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+scaffolds+for+liver+tissue+with+high+density%3A+Morphological+and+biochemical+characterization+of+tissue+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates.</a> J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们开发了一种基于芯片的平台，用于在主动灌注的微型生物反应器中进行细胞的三维培养。这些芯片可通过微注塑成型、热压印以及微热成形技术，使用非生物降解性或生物降解性聚合物制造3。根据实验设计，聚合物表面可通过紫外线照射进行修饰4。肝细胞系以及原代大鼠肝细胞均可在这些装置中成功培养，通过部分肝特异性基因的表达分析以及部分肝特异性蛋白质的分析已证实了其功能5,6。

<table><tbody><tr><td>细胞</td><td>其他</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原 I</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>PARIS 试剂盒</td><td>试剂</td><td>Ambion</td><td>AM1921</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白 18 抗体</td><td>抗体</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td>一抗，小鼠单克隆抗体，按 1/100 比例稀释于 PBS 中使用</td></tr><tr><td>抗 E-钙黏蛋白抗体</td><td>抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>一抗，小鼠单克隆抗体，按 1/50 比例稀释于 PBS 中使用</td></tr><tr><td>羊抗人白蛋白抗体</td><td>试剂</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E80-129</td><td>一抗，羊抗人白蛋白抗体，按 1/200 比例稀释于 PBS 中使用</td></tr><tr><td>兔抗小鼠 IgG1 抗体</td><td>抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>二抗，Alexa Fluor 488 标记，按 1/100 比例稀释于含 0.5% BSA 的 PBS 中使用</td></tr><tr><td>Cy3 标记抗山羊 IgG 抗体</td><td>试剂</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-165-003</td><td>Cy3 AffiniPure 驴抗山羊 IgG 抗体，按 1/700 比例稀释于含 0.5% BSA 的 PBS 中使用</td></tr></tbody></table>

基于芯片的灌注式微型生物反应器中的三维细胞培养

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

我们开发了一种基于芯片的细胞培养系统，用于细胞的三维培养。该芯片通常由非生物降解性聚合物（如聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯）通过微注塑成型、微热压印或微热成型工艺制造而成，但也可使用可生物降解的聚合物制造。芯片的整体尺寸为0.7–1 × 20 × 20 × 0.7–1 mm（高 × 宽 × 长）。所用芯片的主要结构特征为：最多包含1156个立方形微容器的网格结构（cf-芯片），每个微容器尺寸为120–300 × 300 × 300 μm（高 × 宽 × 长）；或直径300 μm、深度300 μm的圆形凹腔（r-芯片）。该支架可在三维构型中容纳一千万个细胞。为了实现最佳的营养物质和气体供应，芯片被置于生物反应器外壳中。该生物反应器是封闭无菌循环回路的一部分，在最简单的配置中，该回路还包括一个滚压泵和一个带有气体供应的培养基储液罐。生物反应器可运行于灌注、上流灌注，甚至混合操作模式。我们已成功培养多种细胞系及原代细胞达数周之久。对于大鼠原代肝细胞，我们证实其器官特异性功能可维持超过两周；对于肝细胞癌细胞系，我们观察到在标准单层培养中不表达或仅微弱表达的肝脏特异性基因被显著诱导表达。该系统也可能适用于干细胞培养，因为初步的干细胞系分化实验结果令人鼓舞。

我们介绍一种基于芯片的平台，用于在微型生物反应器中进行细胞的三维培养。一块芯片可容纳多达1000万个细胞，并可在无菌、封闭的循环系统中，对流体流动、氧张力等条件进行精确控制，从而实现细胞培养。

我们开发了一种基于芯片的细胞培养系统，用于细胞的三维培养。该芯片通常由……制成。

您好，我是 Eric Gottwald，是 Ware 研究所生物界面研究所的一名科研人员。今天，我将向您介绍我们的基于芯片的灌注式微生物活性系统。在将该芯片用于细胞培养应用之前，我们必须对聚合物进行水解，并对微结构区域进行脱模处理。通过将芯片浸入不同浓度的异丙醇中即可实现这一过程，首先从100%浓度开始，将芯片在每种浓度中仅浸入数秒，最后一步是浸入水中。随后，将芯片干燥，最后必须用I型胶原溶液对芯片进行包被，以促进细胞在聚合物表面的黏附。该步骤通过在微结构区域表面滴加几滴I型胶原溶液完成，然后将芯片置于4°C条件下孵育过夜。在胶原蛋白一溶液中过夜孵育后，移除溶液，并用无菌 PBS 洗涤芯片。随后，移除 PBS，芯片即已准备好用于细胞接种。接下来，我们将细胞悬液接种到细胞芯片上，具体操作是将 150 微升单细胞悬液直接加在微结构区域上方。细胞沉积后，将芯片置于 37 摄氏度的培养箱中孵育三小时。经过三小时的孵育后，将芯片从孵箱中取出，即可准备插入ectro。操作时，将ectro从其无菌包装中取出，其无菌性通过该透明膜的γ射线辐照灭菌获得。因此，我们只需打开包装并取出ectro即可。接下来，我们将瓶口插入该培养基储液槽中，以便拆卸生物反应器外壳，从而插入芯片。打开生物反应器外壳后，即可插入芯片，只需将芯片放入生物反应器外壳的凹槽中即可。随后可重新组装生物反应器。最后一步是将无菌过滤器连接至培养基储液槽，并连接一个无菌取样口。为了测量封闭循环回路中的实际氧分压，我们将两个氧传感器直接安装在这两个连接件之间。生物反应器现在已准备好加入培养基。该生物反应器系统现已准备就绪，可注入细胞培养基，只需将封闭循环回路连接至蠕动泵即可完成。通过此操作，我们将同时降低整个bactor循环系统的流速。正如您在此处的Ector窗口中所见，您可以看到培养基从下方不断上升，最终从bactor顶部流出。在将Bactor系统放入培养箱之前，我们需检查循环回路是否无气泡填充。现在系统已完全充满细胞培养基，我们可以将生物反应器转移至培养箱中。接下来，我们将把生物反应器放入培养室。为此，首先需将生物反应器连接至蠕动泵（如您此前已短暂看到的），现在培养瓶中的培养基正主动灌注生物反应器。为了维持环境中的氧气浓度，我们将培养基储液罐连接至气体供应系统。最后，我们将两个氧气传感器连接到循环系统，以在线监测系统中的氧分压。现在，装置已搭建完毕，只要实验设计允许，即可持续运行。在分析 MicroCon 容器内细胞的器官样功能时，最强大的工具之一是激光扫描显微镜，您在此可以看到。激光扫描显微镜使我们能够在不破坏样本的情况下观察每一个单独的 MicroCon 容器内部。由于 MicroCon 容器或芯片可用于常规的免疫染色和免疫荧光方法，因此我们能够检测微容器内各种类型的标志物及器官样功能。如您在此芯片动画中所见，MicroCon 容器的底部以及容器壁上已完全布满细胞。我们拥有大量活性良好的细胞，而死亡细胞则非常、非常少。下一张图片表明，我们能够在 MicroCon 容器内检测到各种类器官功能。例如，对于肝细胞，可以观察白蛋白的产生或细胞中E的表达，如图中叠加图像所示。细胞核染成蓝色，E染成绿色，白蛋白表达或染色呈红色。如您在此处清晰所见，从肝细胞预期的所有类器官功能均在此类三维培养中得到了良好表达。此外，我们还检测了另一种肝细胞标志物——细胞角蛋白18（cytokeratin 18），该图片显示，细胞角蛋白18 在此类培养物中同样得到了良好表达。希望这能让您相信，此类类器官功能也可能适用于其他类型的类器官培养。在生物反应器实验结束后，该芯片可用于分离各种细胞组分，例如总RNA。如图所示，此处展示的是从生物反应器系统中分离得到的总RNA。该总RNA可进一步用于下游应用，例如实时PCR，或如图所示的微阵列分析。此外，可以从该系统中分离出完整的细胞，并将这些细胞用于常规流式细胞术分析。正如您在此处所见，希望我们能够向您展示该系统可能适用于所有需要器官型反应的各类应用，同时也可能适用于迄今为止我们尚未考虑到的其他各类应用，例如干细胞应用。

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基于芯片的三维细胞培养，在灌注微生物反应器

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