Name: 鼻腔和支气管液的吸收: 人体呼吸道黏膜的精确取样和样品的实验室处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学习鼻腔和支气管液吸收技术，使用合成吸收基质精确采集呼吸道黏膜样本。该方法适用于各年龄段患者，为呼吸系统疾病的临床诊断和研究提供标准化采样方案。

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基金支持：本工作获得了帝国理工学院国家健康研究所（NIHR）生物医学研究中心（BRC）、帝国理工学院国家健康研究所健康保护研究单位（HPRU）呼吸系统感染项目（与英国公共卫生署 PHE 合作）以及帝国理工学院国家健康研究所患者安全转化研究中心的资助。文中表达的观点仅为作者观点，不一定代表英国国家医疗服务体系（NHS）、国家健康研究所、卫生部或英国公共卫生署的观点。

以下方案中使用的技术已获得伦敦西部研究伦理委员会的批准（参考编号 15/lO/0444）。
1. 鼻腔吸收（NA）
<ol>
	<li>采样前准备
	<ol>
		<li>进行鼻黏膜采样（NA）时，应先洗手并戴上手套，最好在患者面前完成此操作。</li>
		<li>使用头戴式照明灯检查鼻腔，并让临床医生用非优势手的拇指轻轻牵拉患者的鼻部，以充分暴露鼻腔结构。 
		注意：通常不需要使用鼻窥器。</li>
		<li>采样前应清晰观察鼻腔及下鼻甲的解剖结构。 
		注意：鼻孔（鼻前庭）的横截面并非圆形，且走向为向后直行。一般可见下鼻甲为鼻腔外侧壁上的隆起或凹陷结构，而鼻中隔则构成光滑平坦的内侧壁。采样部位应选择下鼻甲区域，因其下方的上皮为呼吸道的单层纤毛柱状上皮44。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鼻黏膜采样（NA）操作
	<ol>
		<li>采样时，将鼻黏膜采样器（NA SAM）轻柔地沿鼻孔腔道向上推进，并调整其方向，使其紧贴下鼻甲表面。</li>
		<li>请受试者用食指将采样器压紧于鼻黏膜表面。由于黏膜淋巴液（MLF）被吸收，可能会引起轻微的痒感，甚至出现流泪现象。 
		注意：在成人中，通常采样时间为60秒。</li>
		<li>吸收MLF后，将NA采样装置从鼻孔中取出，并放回原试管中。</li>
		<li>应立即在实验室处理样本，或按本方案后续说明进行冷冻保存。 
		注意：目前NA技术已被应用于多种鼻黏膜激发模型研究，以及不同呼吸道疾病的研究中。然而，针对每项研究和特定患者人群，均应与其他呼吸道采样方法进行对比验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 支气管吸收（BA）
<ol>
	<li>支气管活检采样前的准备 
	注意：支气管活检（BA）应由专业人员在支气管镜检查室中进行。
	<ol>
		<li>在将BA装置插入导管之前，检查SAM是否能够从导管中伸出并顺利回缩至导管内。</li>
		<li>在患者身上进行BA操作前，应先在支气管镜模拟器上进行一次模拟BA操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支气管活检采样
	<ol>
		<li>将支气管镜经气管插入右主支气管，到达中间支气管水平，位置在右下叶与右中叶分支的近端。 
		注：我们通常从中间支气管取样，但也可选择气道内的其他部位。观察导管和SAM时，无法看到支气管镜的尖端。当支气管镜到达目标采样位置后，我们遵循以下简单的BA操作步骤。</li>
		<li>导管下送（CATHETER DOWN）：将BA导管经支气管镜的操作通道插入，直至白色尖端刚好可见于气道内，最多不超过支气管镜末端远端1 cm。保持支气管镜和导管尖端位于气道管腔中央。操作时需小心，尽量减少导管尖端与支气管黏膜的接触，以降低黏膜擦伤的风险。</li>
		<li>SAM伸出（SAM OUT）：按压BA装置的手柄，使SAM伸出并进入右中叶或右下叶气道的管腔内。在直视下，弯曲支气管镜尖端，确保SAM与气道壁上的黏膜下层（MLF）接触。使SAM平贴于黏膜壁，保持30秒。</li>
		<li>SAM回缩（SAM IN）：通过支气管镜观察，确认湿润的SAM探针呈直线状，未反折至导管末端。如有需要，可将导管和支气管镜尖端回撤以拉直SAM。在直视下，轻柔地将伸直的SAM重新收回导管内。 
		注：若SAM难以回缩至导管内，可将整个装置在SAM伸出状态下从气道中撤出。</li>
		<li>导管上提（CATHETER UP）：将整个导管从支气管镜的操作通道中撤出。</li>
		<li>切断SAM（CUT OFF SAM）：使用无菌剪刀将SAM剪下，并立即放入冰上的冻存管中。这些样本可采用多种方法进行后续处理，具体方法详见本实验方案的后续部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. NA 和 BA 样本的处理
注意：针对核酸扩增（NA）和碱裂解法（BA）产生的样本，实验室处理方法有多种选择。这些方案旨在将样本储存以备后续使用，并从样本采集模块（SAM）中洗脱出磁珠裂解液（MLF）样本。
<ol>
	<li>NA 和 BA 样本的即时处理方案
	<ol>
		<li>方案 1：将湿润的 SAM 置于冰上数小时，随后进行进一步处理。</li>
		<li>方案 2：将 NA SAM 立即在采集管中进行深冻保存。类似地，使用剪刀将 BA SAM 从采样装置上取下后，立即放入冻存管中冷冻。</li>
		<li>方案 3：将分离的 SAM 置于洗脱缓冲液（300 µL）中，随后直接处理或进行深冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NA 和 BA 样本的洗脱缓冲液选择 
	注意：洗脱缓冲液的选择取决于 MLF 样本中拟分析的目标物质，我们建议以下四种主要替代方案：
	<ol>
		<li>使用预先配制的、适用于免疫分析程序的分析缓冲液。此类缓冲液应含有少量去污剂（0.05%）以及蛋白质，例如，1% 的牛血清白蛋白（BSA）。</li>
		<li>或者，使用含有较高浓度去污剂的缓冲液，以实现细胞裂解。 
		注意：我们使用的缓冲液含有 1% 浓度的 Triton-X 或 NP40。细胞裂解缓冲液可从 SAM 中洗脱出细胞内外的细胞因子，通常可获得更高水平的细胞因子和趋化因子。此类缓冲液也应含有蛋白质，并以 1% BSA 配制。</li>
		<li>对于 RNA 检测，如病毒 RNA 的定量 PCR 或宿主 RNA 的检测，可将 RNA 提取缓冲液直接加入湿润的 SAM 中。 
		注意：变性 RNA 提取缓冲液含有可使蛋白质变性的胍盐。另一种方法是将 RNA 提取缓冲液加入含有免疫分析缓冲液或细胞裂解缓冲液的 MLF 液体中。</li>
		<li>使用有机溶剂（如三氟乙酸）提取脂质和代谢物，用于质谱分析。 
		注意：所有这些试剂的详细信息均包含在材料部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗脱技术
	<ol>
		<li>对于上述任一洗脱技术，将 SAM 插入含有所需提取缓冲液的 2 mL 微离心管中。</li>
		<li>将样本涡旋混合 30 秒，以冲洗 SAM 上松散附着的液体和生物分子。</li>
		<li>为确保样本完全回收，将湿润的 SAM 加入插入同一 2 mL 微离心管（用于洗涤）的离心过滤小柱中，进行离心洗脱。 
		注意：可使用两种类型的离心过滤小柱。第一种仅含塑料网筛，可固定 SAM 位置，实现液体的完全洗脱。或者，在处理传染性材料时，可使用孔径为 0.22 µm 的离心过滤器。此类过滤器可对样本进行灭菌，适用于疑似分枝杆菌感染的样本。然而，此类过滤器应预先用缓冲液孵育，以尽量减少介质通过非特异性相互作用与过滤器结合。</li>
		<li>使用灭菌镊子将湿润的 SAM 转移至离心过滤器中。在不同样本之间更换镊子，以防止污染。</li>
		<li>在 4 °C 冷却的微型离心机中，以 16,000 x g 离心 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>示例性总结方案
	<ol>
		<li>在实验室中，为 2 mL 微离心管标记样本编号，并加入所需体积的洗脱缓冲液（通常 NA 为 300 µL，BA 为 100 µL）。密封管盖并置于冰上。</li>
		<li>采样后（立即或在实验室中），使用镊子将 SAM 从手柄上取下，并放入含有缓冲液的收集管（前一步骤制备）中。确保微离心管管盖紧密闭合，并将样本置于冰上转移至实验室进行进一步处理。</li>
		<li>从转运容器中取出含有 SAM 和洗脱缓冲液的试管，涡旋混合 30 秒。</li>
		<li>使用无菌镊子取出 SAM 并放入离心柱中（可含或不含 0.22 µm 醋酸纤维素滤膜）。</li>
		<li>收集收集管中的洗脱缓冲液并保留。</li>
		<li>将含有 SAM 的离心柱放入原始收集管中（若需无菌过滤样本则使用新管），并向离心柱中加入收集缓冲液。通过此方式，洗涤液将穿过离心柱回流至收集管，有助于从 SAM 中洗脱样本。</li>
		<li>密封管盖后离心样本（16,000 x g，20 分钟，4 °C）。</li>
		<li>将样本从离心机中取出并放入试管架中。</li>
		<li>打开密封管盖，取出含有 SAM 的离心柱。将 SAM 和离心柱丢弃至适当的废弃物容器中。</li>
		<li>小心地将管内洗脱液分装至标记好的冻存管中。记录洗脱液总体积及每份分装的体积。</li>
		<li>将密封的冻存管转移至 -80°C 冰箱中，直立保存直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

现有气道采样技术的结果被认为具有高度变异性；该领域内的研究亟需替代性采样技术以实现标准化5。鼻腔采样（NA）和支气管采样（BA）能够以非侵入性方式采集黏膜衬液（MLF），在检测健康与病变气道中的免疫应答方面具有广阔前景。相较于现有技术，这些方法具备多项潜在优势，包括更高的耐受性、更快的采样速度、可频繁重复采样、操作者间变异更小，以及免疫介质的稀释程度更低5。吸收持续时间及所用处理方法应针对每项研究进行优化，并在各次采样过程中严格保持一致。此外，对于支气管采样（BA），应在不同个体间精确复制气道内的采样部位。
鼻吸（NA）尤其是支气管吸出（BA）仍是临床研究中相对较新的技术。然而，这些技术的优势已使其被广泛应用于多项研究中，包括与其他替代技术进行严谨的验证对比5。目前这些设备已获得CE认证，可广泛用于呼吸系统研究。尽管NA和BA所获得的样本体积远小于其他采样技术，但其较高的目标物浓度可能使低丰度免疫介质的检测灵敏度更高。
根据预期的下游应用，NA 和 BA 样本可直接冷冻以备后续处理，从而提高临床研究环境中的研究可行性。样本处理方案也可根据特定的下游应用进行调整。建议的处理技术可用于收集蛋白质或脂质免疫介质以及核酸，但应针对每项研究进行优化。特别是，MLF 可使用不同的缓冲液进行洗脱。首先，可使用免疫测定缓冲液来检测黏膜细胞因子、趋化因子和抗体6,45。也可使用去污剂浓度较高的缓冲液，以确保发生细胞裂解，从而检测细胞内细胞因子。对于病毒性感染、病毒载量、宿主 mRNA 和微生物组的检测，应使用变性剂类 RNA 提取缓冲液。此外，脂质组学和质谱分析可使用有机溶剂。
综上所述，从黏膜表面直接吸收 MLF 是一种具有潜力的技术，可用于呼吸系统、胃肠道、泌尿生殖系统及其他黏膜相关疾病的检测。然而，这些颇具前景的吸收技术需要针对每种疾病环境中的具体检测项目（生物标志物）对采样与处理技术进行精确验证。此外，这些新型精准黏膜采样技术还需与传统样本（如血液、呼出气及痰液）进行对比验证。利用这些技术，MLF 可用于检测微生物、细胞因子、趋化因子、前列腺素类物质以及抗体。

大多数呼吸系统疾病都会引发炎症反应，在变应性鼻炎、病毒和真菌感染、结核病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化及肺癌等疾病中，迫切需要采集呼吸道黏膜表面样本1。鼻咽抽吸液（NPA）、鼻腔灌洗和支气管肺泡灌洗（BAL）是采集上、下呼吸道样本的常用技术。然而，这些方法存在诸多问题，包括耐受性差、炎症介质被稀释，以及难以频繁重复采样2。NPA采样的一个替代方法是使用拭子，如尼龙植绒拭子、棉质拭子或人造丝拭子3,4，但这些方法也存在局限性，因其可能引起不适并损伤鼻上皮，某些情况下还会导致炎症介质发生不可逆结合5。这些技术通常无法在一小时内连续重复操作，而在检测低丰度细胞因子和趋化因子方面，其他替代技术可能更为有效5,6。此外，这些技术的操作者间差异可能导致数据不一致，从而需要更大的患者队列来满足研究需求。
此外，已有研究采用天然和合成海绵的吸附技术从黏膜表面收集黏膜液（MLF）。由天然纤维素制成的眼科海绵（例如，Weck-cel）已被用于采集唾液、宫颈和阴道分泌物7。此外，还使用了由聚乙烯醇（PVA）和羟基化聚乙酸乙烯酯（HPVA）制成的合成海绵8。在检测抗体前取样口腔液体时，曾比较过七种不同的吸附材料9，而聚氨酯微型海绵则被用于采集人泪液10。
自1992年Alam及其同事的开创性研究以来，由棉花植物天然纤维素制成的滤纸已广泛用于吸收鼻腔分泌物11,12,13,14,15,16,17。滤纸圆片由滤纸卡（例如 Shandon）制备，已被用于在受控鼻腔变应原激发及自然变应原暴露后测定组胺和细胞因子18,19,20,21。然而，不同批次的滤纸在蛋白质结合能力方面存在差异，部分滤纸无法有效释放细胞因子。因此，已开发出使用合成吸收基质（SAM）的方法2,22,23。目前，SAM已普遍用于通过鼻腔吸收法（NA）获取鼻腔黏膜液（MLF）。这类吸收材料使用舒适，即使在长时间内频繁采集，也能从炎症状态的鼻腔中有效获取MLF。
鼻腔吸收是一种利用SAM从上呼吸道采集黏膜淋巴基质液（MLF）的精准黏膜采样方法。NA采样装置采用医疗级材料在洁净室中生产，符合CE认证医疗器械标准，无尘且不含过敏原。NA采样器由手柄和置于无菌冻存管中的SAM组成。SAM由聚合物构成，通常为纤维形式，也可为泡沫形式，其材质选择柔软且具有高吸附性，并具备快速毛细渗透能力以利于样本采集。SAM的蛋白质结合能力极低，可实现吸附分泌物的高效洗脱。NA是一种极为温和、无创的技术，适用于所有年龄段的供体。此外，可进行连续多次采样，甚至每隔数分钟采样一次。NA已通过与现有上呼吸道采样技术的对比验证5，重复采样已被用于在气道接触过敏原23,24,25、细菌内毒素26以及病毒型TLR激动剂（Jha, A. et al.， manuscript in preparation）后获取动力学数据。NA还已被用于婴儿群体，以研究特应性疾病的自然病程27,28,29以及病毒性细支气管炎30。
支气管镜下微采样（BMS）是一种由 Olympus 开发的用于采集下呼吸道黏膜衬液（MLF）的技术31,32,33。然而，该 BMS 系统目前仅在日本获得许可。Olympus 提供两种 BMS 系统：一种配备纤维状羟基化聚酯（FHPE）探针34,35,36,37，另一种配备棉质探针33,38,39,40,41,42,43。该技术面临的主要障碍是，在哮喘患者中使用 BMS 探针时会引起黏膜接触性出血，导致半数样本被血液污染。研究者得出结论：使用该 BMS 系统从哮喘患者的外周气道采集 MLF 是不可行的43。
作为一种替代方法，我们开发了使用软性采样贴片（SAM）的支气管采样（BA）技术，可在支气管镜检查下呼吸道时进行，包括在哮喘患者经鼻病毒实验性感染后的检测6。BA装置包括：外部中空导管、可在激活时推出SAM的手持部件，以及末端带有SAM的中央塑料导丝。与鼻采样（NA）类似，BA试剂盒采用医用级材料在洁净室中制造，无尘且不含过敏原。此外，该装置已通过CE认证，并经伽马射线辐照灭菌。SAM条柔软、具有强吸收性，能快速毛细吸收以采集样本，同时具有极低的蛋白质结合特性，有利于吸收分泌物的高效洗脱。该装置可穿过支气管镜的工作通道，能够快速、准确地从气道内特定感兴趣部位采集黏膜表面液体（MLF）。与支气管肺泡灌洗（BAL）或支气管黏膜刮取（BMS）不同，BA操作不会导致接触性出血或术后患者额外不适。
在处理鼻咽拭子（NA）和支气管肺泡灌洗液（BA）样本时应仔细考虑。样本可直接冷冻后批量处理，也可立即进行处理。处理方式可根据特定的下游应用进行调整，包括用于检测细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白的免疫测定，或病毒、细菌及宿主细胞相关RNA的洗脱。本文介绍了与NA和BA相关的临床采集及实验室处理技术，为临床研究人员提供参考指南。

<table><tbody><tr><td>鼻部吸附管（成人，7mm 宽度）</td><td>Hunt Developments</td><td>NSFL-FXI-11</td><td>针对不同患者群体/年龄提供不同规格。</td></tr><tr><td>支气管吸附管</td><td>Hunt Developments</td><td>BSFL-FXI-11</td><td>支气管镜最小通道直径为 2mm；最大工作长度为 815mm。</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Costar&amp;nbsp;Spin-X&amp;nbsp;离心管滤器（无膜）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS9301-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Costar&amp;nbsp;Spin-X&amp;nbsp;离心管滤器（0.22μm 膜）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160-24EA</td><td>用于具有感染风险样本的灭菌处理。</td></tr><tr><td>检测（洗脱）缓冲液</td><td>Millipore</td><td>AB-33k</td><td>未在 Millipore 官网列出，但可通过咨询或通用实验室耗材公司（如 Cedarlane）获取。含有 0.05% Tween-20 和 1% BSA。</td></tr><tr><td>NP-40 细胞裂解缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>FNN0021</td><td>加入牛血清白蛋白至终浓度 1%（w/v）。可回收更高的绝对介质水平。</td></tr><tr><td>Buffer RLT（RNA 提取）</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>可用于从鼻部吸附和支气管吸附样本中提取 RNA。</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML-M</td><td>用于需进行高效液相色谱（HPLC）分析样本的洗脱。</td></tr><tr><td>2.0 ml 微量离心管</td><td>Costar</td><td>3213</td><td>Spin-X 管滤器需使用 2 ml 离心管，传统的 1.5 ml 管不适用。</td></tr></tbody></table>

鼻腔与支气管液体的吸收：人体呼吸道黏膜的精确采样及样本实验室处理

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

鼻腔吸收（NA）和支气管吸收（BA）方法采用合成吸收基质（SAM）来吸收人体呼吸道黏膜衬液（MLF）。NA 是一种非侵入性技术，可从下鼻甲吸收液体，几乎无不适感。NA 已获得可重复的结果，并能够频繁重复采样上呼吸道。
相比之下，采集呼吸道黏膜样本的其他方法（如鼻咽抽吸法（NPA）和传统拭子采样）更具侵入性，可能导致数据变异性更大。其他方法也存在局限性，例如，活检和支气管镜检查具有侵入性，痰液含有大量死亡或濒死细胞且需要液化处理，呼出气冷凝物（EBC）含有水分和唾液，而灌洗样本则较为稀释且成分不稳定。
在临床中，支气管镜检查可通过支气管镜的工作通道进行支气管灌洗（BA）。该取样方法耐受性良好，可在气道内的多个部位进行。BA获得的微量液体样本（MLF）比支气管肺泡灌洗（BAL）样本的稀释程度更低。
本文展示了鼻吸收（NA）和支气管吸收（BA）技术，以及所获得样本的实验室处理方法，这些方法可根据拟进行检测的下游生物标志物进行相应调整。这些吸收技术是临床呼吸系统研究中常规采样技术的有效替代方法。

NA 已在多项研究中被用于简便且无创地测量黏膜炎症。在向鼻腔给予过敏原后，可在数分钟内观察到前列腺素 D2（PGD2）水平的升高和下降。图1），符合肥大细胞脱颗粒（Thwaites 等，正在准备中的手稿）。此外，II型炎症的介质，如IL-5（图2，经许可转载自 24），可在鼻腔变应原激发后的数小时内进行测定23,24在对过敏性哮喘患者和健康对照者进行的实验性感染研究中，采用NA方法检测了一组介质，包括干扰素-γ（IFN-γ），持续监测7天（图3，经许可转载自 6）。此外，在婴幼儿自然呼吸道合胞病毒（RSV）感染中，NA 研究表明，与患支气管炎但无 RSV 感染的婴幼儿及健康对照组相比，RSV 感染与炎症性细胞因子（如 IFN-γ）水平升高相关。图 4，经许可转载自 30）。有趣的是，在时间匹配的鼻咽抽吸物样本中，RSV 与非 RSV 毛细支气管炎之间的这种区分并不显著（图 4).
在对过敏性哮喘患者进行鼻病毒实验性感染期间，也使用了BA。在鼻病毒感染后的第4天，IFN-γ、CXCL11、IL-10和IL-5的水平较基线升高（图5；分别为A、B、C和D）。此外，该技术显示，在鼻病毒感染期间，过敏性哮喘患者下呼吸道中的IL-5水平较健康对照组升高（图5D）（图5经6许可重印）。
这些代表性结果来自使用含有 0.05% Tween-20 和 1% BSA 的检测缓冲液洗脱的样本（参见 材料表).
<img alt="PGD2 浓度随时间变化的曲线图；激素分泌峰值的数据分析；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：鼻腔过敏原激发后前列腺素-D2 的快速生成与清除。 在鼻腔过敏原激发（使用梯牧草花粉，n=5）后，通过连续采集鼻腔吸收液样本测得的前列腺素-D2（PGD2）水平。每条曲线代表一名个体的数据。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="NAC后IL-5水平随时间变化；浓度-时间曲线；细胞因子分析；显示误差线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：鼻腔变应原激发后IL-5的动态变化测定。 鼻腔变应原激发后连续采集的鼻腔吸收液样本中IL-5的生成情况。共进行了三次重复的变应原激发研究，参与者（n=19）在变应原给予前1小时分别接受安慰剂（蓝色）、低剂量（10 mg）口服泼尼松（橙色）或高剂量（25 mg）口服泼尼松（红色）。曲线表示几何平均值，误差线表示所有参与者的95%置信区间。（图示经Leaker et al., Mucosal Immunology, 2017许可转载）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IFN-γ 表达结果；显示细胞因子水平随时间变化的图表；实验数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：鼻病毒攻击期间干扰素-γ的诱导。 在对健康成人（n = 11，蓝色）和过敏性哮喘患者（n = 28，红色）进行鼻病毒-16感染攻击期间，采用鼻腔吸收采样法检测干扰素-γ（IFN-γ）的水平。数据以 A）个体原始的线状图（spaghetti plots）和 B）中位数水平（误差线表示四分位间距）表示。（图改编自 Hansel et al.6，经许可重印）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="IFN-γ 浓度柱状图；RSV 研究；鼻吸收法 vs. 鼻咽抽吸法；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：鼻吸收法可区分与婴幼儿呼吸道合胞病毒（RSV）感染相关的干扰素-γ 升高水平。 采用鼻腔吸收法和鼻咽抽吸法（NPA）检测患有与呼吸道合胞病毒（RSV）感染相关细支气管炎的婴幼儿（红色，n=12）、非 RSV 呼吸道病原体感染者（绿色，n=12）以及健康对照组（蓝色，n=9）的干扰素-γ 水平。数据采用Kruskall-Wallis检验进行分析，并对多重比较进行Dunns校正（***p&lt;0.001）。线条表示中位数，误差线表示四分位距。（经Thwaites et al.30许可修改。）<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较基线期和感染阶段 IFN-γ、CXCL11、IL-10、IL-5 的细胞因子反应图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：鼻病毒 感染期间支气管吸收样本中的炎性介质。 
在健康对照者（n=10，蓝色）和过敏性哮喘志愿者（n=23，红色）感染鼻病毒-16 后，采用支气管吸收法检测 A) IFN-γ、B) CXCL11、C) IL-10 和 D) IL-5 在基线期及感染第 4 天的水平。数据采用 Wilcoxon 符号秩检验（配对样本）和 Mann-Whitney 检验（非配对样本）进行分析。图示经 Hansel et al.6 许可转载。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了鼻腔和支气管吸收技术的应用，特别是使用合成吸收基质（SAM）来采集上、下呼吸道的黏膜衬液（MLF）。这些方法相较于现有的呼吸道采样技术具有更高的标准化程度和耐受性。

鼻腔吸收（NA）与支气管吸收（BA）方法采用合成吸收基质（SAM）来吸收上呼吸道黏膜衬液（MLF）的……

今天，我们将演示鼻黏膜吸附技术（nasosorption），这是一种利用合成吸收基质采集黏膜衬液的精准黏膜取样方法。鼻黏膜吸附采样器由手柄和置于无菌冻存管中的SAM组成。SAM由聚合物构成，可以是纤维或泡沫材料，经过特殊筛选，质地柔软且具有强吸收性，能够快速毛细吸附，便于样本采集。自组装单分子膜（SAMs）的蛋白质结合极少，可实现吸附分泌物的有效洗脱。鼻腔吸附是一种非常温和、无创的技术，适用于所有年龄段的患者，包括婴儿。此外，还可进行连续采样，甚至可每几分钟采集一次样本。进行鼻腔采样时，应首先洗手并戴上手套，最好在患者面前完成这些操作。首先检查鼻腔。我们建议使用头戴式照明灯，并由操作者用非优势手的拇指将患者的鼻部轻轻拉开，以便观察鼻腔内部。通常不需要使用鼻镜。如果观察鼻腔，可见鼻孔（前鼻孔）的横截面并非圆形，而是直接向后延伸。一般可见下鼻甲呈隆起状，位于鼻腔外侧壁，而鼻中隔则构成光滑平坦的内侧壁。我们希望从此处下鼻甲进行采样，因为其下方的上皮是呼吸道的单层纤毛上皮。采样时，将鼻吸收采样器（nasosorption SAM）轻柔地插入鼻腔管腔，并调整其方向，使其紧贴下鼻甲表面，然后用食指将采样器按压在鼻黏膜上。随着 MLF 被吸收，可能会引起轻微的刺痒感，并可能伴有流泪。我们通常采用定时 60 秒的吸收过程。然后将鼻吸收装置从鼻孔中取出，放回冻存管中，可立即置于冰上保存，随后进行深冻。或者，您也可以立即进行MLF的洗脱。鼻粘膜采样正在多种鼻粘膜激发模型以及不同的气道疾病中被研究。然而，这种相对较新的方法仍需与其他呼吸道采样方法进行系统的验证对比。支气管吸附技术利用合成的吸附基质来采集支气管黏膜衬液。该方法由专业人员通过纤维支气管镜进行操作。支气管吸附装置由一个外部中空导管和一根中心塑料导丝组成。其末端带有SAM，可在手柄激活后伸出。与鼻吸样法类似，SAM试纸条柔软且具有吸附性，能快速吸液以收集样本。同时，其蛋白质结合能力极低，有利于吸附的分泌物高效洗脱。在将支气管吸附装置插入支气管镜之前，通常需要检查SAM是否能够顺利从导管中伸出并回缩。接下来，我们将使用支气管镜模拟器演示支气管吸附的方法。首先进行标准的支气管镜检查，将支气管镜经气管插入，进入右主支气管，直至到达右中叶与右下叶分叉近端的中间支气管水平。插入至该深度后，需执行以下五个步骤。第一步，下放导管。将支气管吸痰导管经支气管镜的操作通道插入，直至在气道内可见导管白色尖端，且其末端最多超出支气管镜末端1厘米。保持支气管镜和导管尖端位于气道管腔的中心位置。注意尽量减少导管尖端与支气管黏膜的接触，以降低黏膜损伤的风险。二，SAM 取出。按下支气管吸附装置的手柄，使SAM试纸条伸出并进入右中叶或右下叶支气管的管腔内。在直视下弯曲支气管镜顶端，确保SAM试纸条与支气管壁上的黏膜衬液接触。将SAM试纸条平贴于黏膜壁上，留置在支气管内精确30秒。三个，SAM 插入。在直视下，将 SAM 直接向后拉入导管中。回撤时，确保湿润的 SAM 探针保持平直。如有需要，可将导管和支气管镜顶端回撤，以使 SAM 恢复直线状态。若回缩 SAM 存在困难，可将整个装置连同已伸出的 SAM 一同从气道中撤出。第四步：导管上行。从支气管镜的操作通道中完全撤出整个导管。第五步，切断 SAM。使用无菌剪刀将 SAM 剪下，放入冻存管中，并应立即置于冰上，随后进行深冻保存或直接洗脱。以下视频片段展示了将SAM探头插入正在接受研究性支气管镜检查的患者的气道中进行黏膜取样的过程。目前，支气管吸附技术正在多种不同的肺部疾病中开展研究。我们希望这种精确的黏膜取样方法在诊断评估、患者分层及监测中被证明具有应用价值。鼻部吸附与支气管吸附后的实验室处理。从合成吸收基质中洗脱黏膜衬液。今天我们将演示在采用无创黏膜采样技术——鼻部吸附和支气管吸附后，实验室样本处理的一般原则。具体而言，我们将演示如何从合成吸收基质中洗脱黏膜衬里液样本。采集样本后，应立即将其置于冰上，运送到实验室。样本可立即进行处理，也可直接放入深冻保存，在原始样本管中冷冻，待日后洗脱使用。若需立即处理，可将样本保留在原始采样管中并置于冰上转运至实验室。或者，可在采样时将 SAM 装置取下并放入洗脱缓冲液中，随后置于冰上转运至实验室。样本在处理前可在缓冲液中或原始采样管中于冰上保存数小时。在离心和旋转洗脱 SAM 之前进行洗涤步骤，旨在优化样本得率。为此，将 SAM 插入含有所需提取缓冲液的 Eppendorf 管中。然后在涡旋混合器上混合 30 秒，以去除 SAM 上松散附着的液体和生物分子。为确保完全回收样本，将湿润的 SAM 加入同一支用于洗涤的离心管内的旋柱插入件中，然后进行离心洗脱。此操作应使用洁净的镊子，并在处理不同样本之间更换镊子，以防止交叉污染。该方法利用离心力从 SAM 中提取液体。将样品在4摄氏度预冷的离心机中以16,000 g离心20分钟。洗脱缓冲液的选择取决于具体的应用需求。我们通常使用含蛋白质的氨基酸测定缓冲液或RNA裂解缓冲液。可使用两种类型的旋转过滤器。第一种仅包含塑料网筛，用于固定SAM，允许液体完全洗脱。或者，在处理具有感染性的材料时，可使用孔径为0.2微米的旋转过滤器。这些滤器可用于去除受污染样本中的污染物，适用于疑似微生物感染的样本。如果需要使用此类滤器，则必须包含一个预孵育步骤，即在加入样本之前，先让含蛋白质的缓冲液充分浸透滤器。该步骤可最大限度地减少介质通过非特异性蛋白质吸附与滤器结合。以下是我们实验室用于处理无需去污步骤（包括二级病原体）的鼻吸样和支气管吸样样本的一个示例方法。第一步，将 SAM 置于含有适当缓冲液的 Eppendorf 管中，涡旋振荡 30 秒。对于鼻吸样，我们通常使用 300 µL 缓冲液；对于支气管吸样，则使用 100 µL。第二步，使用镊子将SAM取出，并连同用于清洗SAM的缓冲液一起放入塑料网状滤杯中。第三步，将含有SAM的塑料网状滤杯放回原来的Eppendorf管中。第四步，将含有滤杯、缓冲液和SAM的Eppendorf管在4°C条件下以16,000 g离心20分钟。离心后，取出含有 SAM 的滤杯并予以丢弃。随后可将洗脱液分装，并深冻保存以备后续分析。鼻黏膜采样技术已应用于多项临床呼吸系统研究场景中。这包括在鼻腔变应原激发过程中对炎症介质的检测，如前列腺素 D2 和白细胞介素 5。在这些激发模型中，尤为重要的是，通过鼻腔吸附法可实现对介质水平的频繁动力学分析，采样可每几分钟重复一次。鼻腔吸附法还曾用于健康受试者和过敏性哮喘患者的人鼻病毒感染激发研究，在整个研究期间每日重复进行鼻腔吸附采样。在研究中使用鼻腔吸收法可对鼻病毒感染引起的干扰素反应进行高灵敏度的表征。最后，我们采用鼻腔吸收取样法研究了患有毛细支气管炎的婴儿。该研究发现，呼吸道合胞病毒感染与较高的炎症介质水平相关，例如干扰素γ。重要的是，使用鼻部吸收法采样可在婴儿研究中纳入健康对照组。在针对健康受试者和过敏性哮喘患者的鼻病毒攻击研究中，也采用了支气管吸收法。该研究显示，在鼻病毒感染期间，下呼吸道中的炎症介质干扰素γ、ITAC、IL-10和IL-5显著升高。将该技术纳入下呼吸道研究，使得检测某些介质水平成为可能，而这些水平可能通过支气管肺泡灌洗等传统方法无法检测到。总之，黏膜衬液可无创获取，在感染与炎症过程中测量炎症反应方面具有令人期待的潜力。洗脱方法需根据样本性质及待测参数进行相应调整。特别是，MLF 可用于检测黏膜细胞因子和趋化因子、病毒感染、病毒载量、细菌和真菌感染以及微生物组和黏膜抗体。最后，黏膜取样和洗脱方法需要针对具体项目进行定制化开发和严格验证。

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