用于活细胞中 Sod1 突变蛋白聚集体形成高内涵定量的检测方法开发

本实验的总体目标是建立一种检测方法，用于以时间和剂量依赖的方式研究小分子在调控错误折叠蛋白聚集中的作用。该方法有助于回答细胞检测开发中的关键问题，并可用于高内涵筛选技术。该技术的主要优势在于提供了一种简便的方法，用于检测和定量多种神经退行性疾病中发生的蛋白质聚集现象。

该技术的应用前景涉及神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症，ALS）的潜在治疗，因为它提供了一种简单的方法，可用于建立细胞检测体系并筛选小分子调节剂。开始病毒制备时，在质粒转染前，将 HEK-293 T 细胞以 30% 至 40% 的融合度接种于含 10 毫升细胞培养基的 10 厘米组织培养皿中。将培养皿置于 37°C、5% 二氧化碳的培养箱中过夜培养。

次日，使用包装质粒慢病毒载体、125 微升 1 摩尔氯化钙，并加入蒸馏水将体积调至 500 微升，制备 DNA 转染溶液。轻轻加入 500 微升 0.05 摩尔 HEPES 缓冲液，室温孵育 10 分钟。随后，将 HEK-293T 细胞培养基更换为 10 毫升预热的无抗生素新鲜培养基，其中混入 1 毫升 DNA 转染溶液。

在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。次日，将细胞上清液更换为新鲜培养基，并再次孵育过夜。最后，在接下来的一天收集上清液，转移至15毫升离心管中。

为了去除死细胞和碎片，将离心管在500 × g条件下离心5分钟。为进一步纯化上清液，使用60毫升注射器将其通过0.45微米滤器过滤。然后，立即把过滤后的上清液分装成300微升的单次使用 aliquot。

为进行转导，将细胞以60%汇合度接种于六孔组织培养板中，每孔加入2毫升DMEM培养基（含10%胎牛血清）。将细胞置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中过夜培养。次日，每次使用时将一管冷冻慢病毒在冰上解冻。

同时，将含有与目标细胞系相容的血清的细胞培养基预热。待病毒完全解冻后，在新的1.5毫升微量离心管中用DMEM稀释病毒，然后用低血清培养基将体积调整至1毫升。

接下来，向每毫升含病毒的培养基中加入两微升聚凝胺，用移液器充分混匀。将一毫升该混合液加入细胞中，在37摄氏度下孵育24小时。孵育结束后，移除含有病毒的培养基，更换为添加了10% FBS的正常DMEM培养基，并将细胞放回培养箱中继续培养。

监测细胞生长，每两天更换一次培养基。当细胞达到汇合时，将六孔板的每孔细胞传代至一个10厘米的组织培养皿中。将培养皿放入培养箱中。最后，在384孔检测板中每孔保存1.5 × 10⁴个细胞，并加入50 µL DMEM。

然后在显微镜下检测YFP标记蛋白的表达水平。如果表达的信噪比等于或大于三，则为相应的细胞系制备细胞储备液。对于化合物转移，在384孔聚丙烯储存板上，通过标准的一比三稀释系列添加化合物的系列稀释液。

然后，使用配备384通道毛细管头的液体处理仪，将0.25 µL蛋白酶体抑制剂分配至空的平底黑色384孔检测板中。接着将1.5 × 10⁴个细胞接种到这些孔板中。在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。

在对经蛋白酶体抑制剂处理的细胞系进行成像之前，加入10微升预热的含染色液DMEM，并在室温下孵育10分钟。染色完成后，通过选择显微镜标签页启动自动显微镜操作软件。首先，选择配置标签页，然后在正确的培养板类型中选择20倍物镜。

为了使用不同类型的培养板实现正确对焦，请确保物镜上的调焦环已设置为对应培养板的正确值。接着，选择第一通道曝光。将对焦高度设为0微米，然后选择对焦。

聚焦完成后，开启相机一。为优化曝光平面，调节聚焦高度并点击“采集高度”。调整曝光时间和激光功率，使最大像素强度约为3000，然后保存曝光参数。

选择实验定义选项卡，创建布局和子布局。然后，拖放相关的布局曝光、参考图像、倾斜裁剪文件和子布局。最后，保存实验。

最后，选择自动实验选项卡并采集图像。对于双通道图像，首先选择软件算法以分割主要物体，如细胞核、细胞质和聚集体。首先，将0.25 µL溶于100% DMSO或DMSO中的蛋白酶体抑制剂分配至384孔平底板中。

在同一块培养板上，用50微升DMEM培养基手动接种每孔1.5 × 10⁴个细胞。然后将显微镜系统环境控制单元设置为37°C和5%二氧化碳。以宽场荧光模式操作显微镜，软件参数设置为：LWD 20倍物镜非共聚焦模式，每孔拍摄四个视野，拍摄间隔为1小时。

然后，选择合适的算法来分割主要目标，例如胞质溶胶和聚集体。如有需要，调整背景阈值和对比度参数。经转导表达 SOD-1 野生型和 SOD-1 A4V 突变型的测试细胞系均保持健康状态，表现出高水平的表达，并且无论 SOD 形式如何，均具有长期广泛的 phi-标记。

使用蛋白酶体抑制剂ALLN处理24小时可促进HEK-293细胞中SOD-1 A4V YFP聚集体的积累，但在SOD-1野生型YFP转导的细胞中则无此现象。此外，在同样载体转导的U2 OS和SH-SY5Y细胞系中，SOD-1 A4V YFP的聚集水平极低。在接种细胞后，无论是否存在ALLN，均持续监测其聚集体形成情况达50小时。

在24小时时，ALLN聚集体的形成达到平台期，并在接下来的12小时内保持稳定。此外，由于ALLN的细胞毒性作用，28小时后细胞密度显著降低，而DMSO处理的阴性对照组细胞数量则增加。在蛋白酶体抑制剂存在下培养24小时的SOD-1 A4V YFP细胞，用Hoechst溶液进行染色。

通过测量用 Hoechst 染料标记的孔中剩余的贴壁细胞数量，定量评估了三种不同蛋白酶体抑制剂的相对毒性。随着蛋白酶抑制剂剂量的增加，总细胞数量减少。相反，表达 SOD-1 A4V 聚集体的细胞百分比随蛋白酶抑制剂浓度的升高而增加。

进行此操作时，重要的是要记住细胞质量会极大地影响实验结果。因此，必须确保细胞在整个操作过程中无支原体污染且状态良好。完成此流程后，可采用其他成像方法，进一步研究蛋白质降解情况，或通过共振能量转移技术分析蛋白质与其他分子的相互作用。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用高内涵图像分析技术，在多个活细胞中生成用于检测蛋白质命运的工具。该方法可揭示在简单细胞模型中发生的蛋白质聚集现象，还可应用于其他系统，例如由患者特异性诱导多能干细胞分化而来的神经元。