人类的过表达和纯化顺大肠杆菌

该方案的总体目标是在非变性条件下过表达和纯化密码子优化的人顺式异戊二烯基转移酶，并测定其酶活性。该程序通过真核长链顺式-异戊二烯基转移酶脱氢二磷酸合酶 （DHDDS） 进行演示。这种方法可以促进我们对类异戊二烯合成的理解，并为与 DHDDS 突变相关的视网膜色素变性病理生理机制提供重要见解。

这种技术的主要优点是简单、经济高效且省时。它也可以推广用于其他顺式异戊二烯基转移酶蛋白的大量生产。从克隆人类 DHDDS 的表达开始此过程，如文本协议中所述。

细胞重悬于缓冲液 A、每毫升 1 μg DNase I 和蛋白酶抑制剂混合物中。然后，使用玻璃特氟龙匀浆器对重悬的细胞进行匀浆。用微射流器或等效物在 12， 000 至 15， 000 psi 下破碎细胞。

接下来，将细胞裂解物在 4 摄氏度下以 40， 000 倍 g 离心 45 分钟。回收含有可溶性部分的上清液。将上清液上样到含有 10 毫摩尔咪唑的 5 至 10 毫米钴固定化金属亲和色谱柱上。

加载到快速蛋白质液相色谱机中后，用缓冲液 A 在 10 毫摩尔咪唑中彻底清洗色谱柱，以减少非特异性蛋白质结合。开始 FPLC 程序。用补充有 250 毫摩尔咪唑的缓冲液 A 洗脱过表达的蛋白质。

洗脱后，使用 53 毫升与缓冲液 A 平衡的制备脱盐柱去除咪唑，然后，向洗脱的蛋白质中加入六组氨酸标记的 TEV 蛋白酶，以去除其六组氨酸标记的硫氧还蛋白 DHDDS 融合。将混合物在 4 摄氏度下孵育过夜。接下来，将裂解的蛋白质加载到钴固定化金属亲和色谱柱上，该色谱柱用补充有 5 毫摩尔咪唑的缓冲液 A 平衡。

收集流出液以去除裂解的六组氨酸标记的硫氧还蛋白和 TEV 蛋白酶。使用 30 kdalton 截留分子量的离心过滤器将流出液浓缩至 3 至 4 mL。然后，将浓缩的蛋白质加载到用缓冲液 A 平衡的 Superdex 200 体积排阻层析柱上进行最终纯化。

将样品放入馏分收集器的 96 孔架中。蛋白质以二聚体的形式洗脱。通过将洗脱曲线与色谱柱校准曲线进行比较来选择相关馏分。

此时，使用 SDS-PAGE 评估制剂的纯度。最后，确定下游实验所需的蛋白质浓度，并在液氮中快速冷冻纯化的浓缩蛋白质等分试样。将等分试样储存在零下 80 摄氏度直至使用。

为确保蛋白质能够承受冻融循环，请解冻冷冻蛋白质的等分试样。将等分试样以 21， 000 g 离心 10 分钟，以去除不溶性聚集体。离心后，收集上清液。

接下来，使用超高效液相色谱系统将蛋白质加载到用 TNXB 预平衡的 Superdex 200 分析柱上。监测色氨酸荧光以检测蛋白质的洗脱曲线。请务必提供用于分子量评估的有效校准曲线，该曲线可通过 SEC 色谱柱制造商获得。

为确保纯化蛋白质的活性，首先将 5 微摩尔纯化的 DHDDS 与 10 微摩尔 FPP 和 50 微摩尔 C14 IPP 混合。在缓冲液 A 中加入 0.5 毫摩尔氯化镁，在 22 至 30 摄氏度下引发反应。在立即淬灭反应后，通过加入 15 微升补充有 20 毫摩尔 EDTA 的缓冲液 A，在反应中加入 15 微升样品，在反应中吸取 15 微升样品。

然后，加入 1 毫升水饱和的 1-丁醇，充分涡旋以提取反应产物。该协议可以在此处停止，并且可以保留样品以备后用。接下来，将闪烁鸡尾酒添加到样品中。

使用闪烁计数器，定量丁醇相（包括 C14）的反应产物以及 15 微升反应的放射性，代表总放射性。最后，通过计算总 C14 IPP 浓度的利用百分比来计算每个时间点的净 C14 IPP 掺入量，并将结果绘制为时间的函数。预计随着时间的推移，C14 IPP 的净掺入量会增加。

此处显示了在每个纯化步骤中获得的样品。该 SDS-PAGE 分析显示 DHDDS 的逐步纯化，从而获得高度纯化的产物。该色谱图代表了纯化酶的分析尺寸排阻色谱结果，揭示了仅观察到该蛋白质为同型二聚体。

此处，箭头指示 void 体积。一项具有代表性的时间依赖性活性测定显示，C14 IPP 掺入在 6 小时内明显上升，验证了纯化的酶是否有效。一旦掌握，这种简单的制备可以在 2 到 3 天内完成，从而产生高纯度和活性的酶。

观看此视频后，您应该对如何从大肠杆菌中过表达和纯化人顺式异戊二烯基转移酶以及以时间依赖性方式测量其活性有很好的了解。