Name: 高通量并行测序在金黄叙利亚仓鼠感染期间测量钩端螺旋体螺旋体转插入突变体的适应性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 了解高通量转座子测序技术，用于鉴定钩端螺旋体在金黄叙利亚仓鼠感染模型中的毒力基因。该方法可高效筛选大量突变体，减少动物使用，适用于急性和慢性感染研究。

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本工作由退伍军人事务部杰出奖（授予 D.A.H.）和美国国立卫生研究院资助 R01 AI 034431（授予 D.A.H.）支持。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管我们已展示了通过腹腔接种42株L. interrogans突变株的仓鼠初步实验结果17，但我们预计可通过Tn-Seq技术筛选更大规模的突变株库。由于接合子的频率较低（每次接合产生100–200个接合子），需要进行多次接合反应才能获得足够数量的突变株用于大规模Tn-Seq实验。在液体培养基中维持大量突变株会带来操作上的挑战，需加以解决。可使用深孔96孔板进行培养。培养物的密度可通过分光光度计在420 nm波长下测定光密度进行监测。所需动物数量的确定部分取决于输入菌株库的规模，必须通过功效分析来确定。对于大规模实验，我们建议在生物统计学家的指导下进行功效分析。
瓶颈效应可能影响从输出池中回收随机突变体的效率。尽管在我们的初步研究中未观察到严重的瓶颈效应17（图7），但大规模实验仍可能受到突变体随机丢失的影响。通过增加输入池中每个突变体的细胞数量以提高挑战剂量，可最大限度地降低出现瓶颈效应的可能性<sup cla...

对于某些细菌（如钩端螺旋体属 Leptospira spp.）而言，由于可用的遗传工具有限，致病基因的鉴定较为困难。一种常用的方法是通过随机转座子诱变构建突变体文库，随后确定每个突变体中转座子的插入位点，并在动物模型中对各个转座子突变体进行致病性检测。该方法耗时长、成本高，且需要使用大量实验动物。
当随机诱变技术首次被开发用于病原体时 问号钩端螺旋体通过在动物模型中测试单个突变株，鉴定了与毒力相关的基因1根据突变体在信号传导或运动性中的潜在作用，或其定位于外膜或细胞表面的预测结果进行筛选。由于大多数钩端螺旋体 基因编码功能未知的假定蛋白质2根据这些标准筛选突变体，会限制发现新的钩端螺旋体毒力基因的能力。
最近，研究人员利用仓鼠和小鼠模型对L. interrogans转座子突变株文库进行了感染性筛选3。每只动物接种一个包含多达10种突变株的混合文库。若通过血液和肾脏培养物的PCR检测到某突变株，则判定其具有感染性。由于需要对文库中的每种突变株分别进行PCR反应，该方法耗时费力。此外，由于未对培养物中各突变株的频率进行定量，该策略倾向于识别出高度减毒的突变株。
我们描述了一种转座子测序（Tn-Seq）技术，作为一种更高效筛选毒力基因的策略。Tn-Seq包括通过转座子诱变构建突变体文库，随后进行大规模并行测序4,5,6。简言之，将转座子突变体混合后接种动物，并从不同器官中回收（输出文库）。提取输出文库的DNA，并用限制性内切酶消化或通过超声波剪切。随后进行两轮针对转座子插入位点连接区域的PCR扩增，此步骤可添加测序所需的接头。最终的PCR产物通过高通量测序进行分析，以确定文库中每个突变体的转座子插入位点及其相对丰度，并与突变体文库的初始组成进行比较。
该方法的主要优势在于能够利用少量动物同时筛选大量突变体。Tn-Seq 无需预先了解转座子插入位点，从而提高了发现新基因功能的可能性 钩端螺旋体-参与毒力的特异性基因，且耗时更短、效率更高。由于在易感致死性感染的啮齿类动物模型中，组织内的钩端螺旋体负荷量相对较高（通常为104 至 108 细菌/克组织7,8,9 以及在储存宿主中10,11，组织可直接进行分析，无需培养，从而减少了因培养导致的偏差 体外 生长
在迄今为止所报道的大多数细菌病原体的 Tn-Seq 研究中，插入突变的高频率允许使用包含大量突变体的混合菌群进行感染，这些突变体 collectively 在每个基因内具有多个位置紧密相邻的转座子插入4,12,13,14。Tn-Seq 也已针对突变频率显著较低的细菌进行了开发6。对于Leptospira，可通过接合将携带转座子的可移动质粒导入细菌，从而构建转座子突变体文库，具体方法如 Slamti et al15 所述。然而，L. interrogans 的转座子突变频率较低。当将 Himar1 转座子通过接合质粒导入时，据报道在 L. interrogans 的 Lai 菌株中，每个受体细胞的接合转化频率仅为 8.5 × 10-816，且在大多数其他 L. interrogans 菌株中也可能同样低下。本文所描述的方案部分基于 Borrelia burgdorferi 的类似方法，该菌的转座子插入突变频率同样较低6。
在采用该方案17进行的初步实验中，我们对钩端螺旋体曼蜡血清型菌株 L495（L. interrogans serovar Manilae strain L495）进行了转座子诱变，选择该菌株的原因是其他研究团队已成功在该菌株中获得转座子插入突变体，且其毒力的LD50（半数致死剂量）较低1。我们通过Tn-Seq筛选了42个突变体，鉴定出多个毒力缺陷的候选突变体，其中包括两个在候选腺苷酸环化酶基因中发生插入的突变体。在仓鼠模型中对这两个突变体进行单独验证，结果证实它们确实存在毒力缺陷17。

<table><tbody><tr><td>来自&lt;em&gt;Streptomyces kanamyceticus&lt;/em&gt;的硫酸卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>2,6-二氨基庚二酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>盐酸二水 Spectinomycin 五水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>配备暗场聚光镜的 Axio Lab A1 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液与组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Model 505 超声破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>2.5&quot; 杯状探头</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>第 3.1.2.4 步</td></tr><tr><td>末端脱氧核苷酸转移酶</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 主混合液</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>基因组文库制备，第 3.4 步</td></tr><tr><td>DreamTaq 主混合液</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>转座子插入位点鉴定，第 1.2 步</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/USB Products</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 梯度 PCR 仪</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>第 3.6 步</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>第 3.6 步</td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>第 3.6 步</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀 No10</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>塑料 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; EDTA 2 ml 采血管</td><td>BD vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>带 26G x &amp;frac12;&amp;rdquo; 针头的 U-100 注射器</td><td>BD vacutainer</td><td>329652</td><td>腹腔注射攻毒，第 2.2.1 步</td></tr><tr><td>3 mL 带鲁尔锁扣针头的注射器</td><td>BD vacutainer</td><td>309657</td><td>心脏穿刺，第 2.4.2 步</td></tr><tr><td>25G X 5/8&amp;rdquo; 针头</td><td>BD vacutainer</td><td>305901</td><td>心脏穿刺，第 2.4.2 步</td></tr><tr><td>带塞子的 25 mm 烧结玻璃底座</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>过滤装置系统，第 1.1.7 步</td></tr><tr><td>25 mm 铝制弹簧夹</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>过滤装置系统，第 1.1.7 步</td></tr><tr><td>15 ml 硼硅酸盐玻璃漏斗</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002514</td><td>过滤装置系统，第 1.1.7 步</td></tr><tr><td>125 ml 带侧管的锥形瓶</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002505</td><td>过滤装置系统，第 1.1.7 步</td></tr><tr><td>醋酸纤维素滤膜 VVPP（孔径 0.1 mm；直径 25 mm）</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量并行测序检测适应性 问号钩端螺旋体 转座子插入突变体在金黄叙利亚仓鼠感染过程中的研究

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

在本文中，我们描述了一种转座子测序（Tn-Seq）技术，用于鉴定和定量 问号钩端螺旋体 在感染金黄叙利亚仓鼠期间适合度发生变化的突变株。Tn-Seq 技术结合了随机转座子诱变与高通量测序技术的优势。将转座子突变株混合物（输入池）接种至动物体内，数天后采集血液和组织样本，以鉴定并定量各器官中突变株的数量（输出池）。通过将输出池与输入池进行比较，评估突变株的适合度变化 体内 每个突变株的适应性。该方法能够在有限数量的动物中筛选大量突变株库。经过少量修改后，本方案可适用于任何钩端螺旋体病动物模型，包括储存宿主模型（如大鼠）和急性感染模型（如仓鼠），以及 体外 研究。Tn-Seq 提供了一种强大的工具，用于筛选具有特定表型的突变体 体内 和 体外 适合度缺陷

通过接合方式构建L. interrogans转座子突变体文库需要使用过滤装置，如图1所示。每次接合反应可获得100至200个接合子。
通过半随机PCR扩增转座子末端及其邻近宿主序列，对每个突变体中产生的PCR产物进行测序，以确定转座子插入位点15 (图2A）。半随机PCR结果的一个示例如下所示 图2B在大多数情况下，使用 Deg1 和 Tnk1 引物进行第一轮 PCR，以及使用 Tag 和 TnkN1 引物进行第二轮 PCR 时，会观察到一条主导扩增条带。然而，由于五聚体序列的特异性较低（&#8230;N10在Deg1引物的3'端包含简并序列（GATAT-3'），该引物将在钩端螺旋体基因组...

我们在此介绍一种将转座子诱变与高通量测序相结合的技术，用于在仓鼠攻毒后鉴定并定量组织中的转座子钩端螺旋体突变株。该方案可用于筛选突变株在动物体内的存活与播散能力，也可应用于 体外 研究。

在本文中，我们描述了一种转座子测序（Tn-Seq）技术，用于鉴定和定量在适应性方面发生改变的问号钩端螺旋体突变体……

该高通量转座子测序技术的总体目标是鉴定并量化在体内和体外存在适应性缺陷的转座子突变株，从而确定与钩端螺旋体毒力相关的基因。该方法有助于解答钩端螺旋体研究领域中的关键问题，例如鉴定参与细菌在宿主中定植、播散和存活的基因。该技术的主要优势在于，仅需使用有限数量的实验动物即可对大量突变株进行筛选。尽管该方法旨在研究问号状钩端螺旋体（Leptospira interrogans）突变株在急性钩端螺旋体病仓鼠模型中的适应性，但它也可应用于慢性感染模型、体外研究以及其他钩端螺旋体菌株。本实验操作将由我实验室的两位博士后 Kritel Lourdault 和 Karen Evangelista 演示。首先，组装一个过滤装置。将底座放置在125毫升带侧臂的锥形瓶上。在底座上放置一张醋酸纤维素滤膜，并用夹子将漏斗固定在底座上。将过滤装置连接至真空系统。接下来，将五毫升钩端螺旋体培养物和零点五毫升大肠杆菌培养物加入漏斗中。开启真空泵以过滤溶液。然后将滤膜有菌面朝上放置于添加了二氨基庚二酸（DAP）的 EMJH 平板上。将培养板在30摄氏度下过夜孵育。次日，将滤膜转移至含有1毫升EMJH培养基的15毫升离心管中，涡旋振荡10秒，使细菌释放到悬浮液中。随后，用玻璃珠或涂布棒将悬浮液均匀涂布于五块添加了卡那霉素的EMJH平板上。用封口膜包裹平板，并在 30 摄氏度下倒置培养，直至菌落可见。当菌落可见时，分别挑取并转移至含有卡那霉素的 3 毫升 EMJH 培养基中。然后在 30 摄氏度下以 150 rpm 振荡培养 7 至 10 天，或培养至细胞密度达到每毫升 1 亿个细胞。为了确定转座子插入位点，进行巢式PCR。首先，配制第一次PCR的反应混合液。然后，将培养物的样品加入PCR反应混合液中。完成第一次反应后，准备第二次PCR的混合液。从第一次PCR中取2 µL PCR产物加入到完整的反应体系中。运行PCR后，在琼脂糖凝胶上检测产物。通过测序产物来确定转座子插入位点。开始动物实验前，首先在添加卡那霉素的 EMJH 培养基中培养单个突变株，然后使用暗视野显微镜测定培养物的密度。将每种培养的突变株用 EMJH 稀释至相同密度，然后取等体积的各突变株混合，制备输入池。随后按照文本方案中所述对动物进行攻毒实验。所需动物数量取决于输入池的大小。务必咨询生物统计学家以确定接种动物的数量。感染后培养四天，然后按照文本方案中所述收获血液和组织。为了从血液样本中提取DNA，使用市售的提取试剂盒。对于组织样本，将50至80毫克的组织切成1毫米见方的小块。然后，将切碎的组织转移至螺口管中，并用精密天平称重。接下来，向试管中加入 500 µL 无菌 PBS。使用破碎仪均质化处理 1 分钟。然后取相当于 25 mg 组织的体积用于提取 DNA。根据制造商说明书使用商用试剂盒。将DNA溶解于100微升洗脱缓冲液中

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

高通量并行测序在金黄叙利亚仓鼠感染期间测量钩端螺旋体螺旋体转插入突变体的适应性

使用转座子诱变法构建 Enterobacter sp. YSU 营养缺陷型菌株

Coxiella burnetii 转座子突变体的构建及多表型高内涵筛选

本文介绍了一种利用细菌接合技术在大肠杆菌（Escherichia coli）或福氏志贺菌（Shigella...

利用细菌接合在肠杆菌科菌株（如Escherichia coli或Shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库

将成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白9核酸酶（CRISPR/Cas9）系统通过原核显微注射导入，是制备基因工程改造的金黄地鼠的一种高效方法。本文中，我们详细描述了利用CRISPR/Cas9系统制备基因敲除地鼠的原核显微注射技术流程。...

通过CRISPR/Cas9复合物原核显微注射制备基因工程金黄地鼠

基因编辑，CRISPR/Cas9，原核注射，金黄地鼠，转基因动物，基因敲入，基因敲除，模式生物，生殖技术，胚胎操作

这种基于分子的方法通过量化独特的基因组DNA条形码，可精确且准确地检测微生物，从而评估细菌的适应性。该方案描述了计算沙门氏菌（Salmonella）菌株竞争指数的方法；然而，该技术可轻松适用于需要对任何遗传上可改造的生物体进行绝对定量的各种实验方案。...

基于数字PCR的竞争指数用于高通量分析细菌适应性 沙门菌

通过测序实现的相互半合子化（RH-seq）是一种强大的新方法，可用于定位物种间性状差异的遗传基础。该方法利用转座子诱变生成半合子池，并通过高通量测序结合竞争性生长来追踪其适合度。对所得数据的分析可精确定位控制该性状的基因。...

Saccharomyces 酵母物种间热耐受性差异的全基因组范围相互半合子分析遗传定位

我们描述了一种在革兰氏阴性细菌中构建饱和转座子突变文库的方法，以及随后为高通量测序制备DNA扩增子文库的步骤。以ESKAPE病原体Acinetobacter...

在革兰氏阴性菌中构建转座子插入文库用于高通量测序

本文描述了CRISPR干扰技术（CRISPRi）在钩端螺旋体属（Leptospira）中实现特异性基因沉默的应用。Leptospira细胞通过接合转化方式导入表达dCas9（催化失活的Cas9）和单导向RNA（sgRNA）的质粒，其中sgRNA负责与目标基因组位点进行碱基配对。本文还介绍了验证基因沉默效果的方法。...

钩端螺旋体（Leptospira）致病种中CRISPR干扰（CRISPRi）技术在基因沉默中的应用

这是一种用于鉴定候选昆虫定植因子的改良方法 伯克霍尔德菌属 有益共生菌。通过转座子突变构建的随机突变文库感染甲虫宿主，比较定植后的文库复杂性与对照组培养的文库复杂性 体外.

转座子插入测序作为解析Burkholderia gladioli在绒毛丽金龟（Lagria villosa）体内共生定植因子的工具

本文通过生物发光成像和PCR技术，对经腹腔（IP）或牙龈内（IG）途径感染L. infantum-Luc的金黄地鼠进行纵向评估。在感染后第1天（1 dpi）、感染后第1周（8 dpi）和感染后第3周（22 dpi）对动物进行评估，并于感染后第50天（50th...

体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

本方案提供了一种模块化的生物安全二级（BSL-2）工作流程，结合结晶紫生物量测定、延时相差动力学分析、共聚焦三维/基质成像、扫描电镜超微结构观察以及一种 体内 仓鼠感染模型用于培养、定量、表征及研究 钩端螺旋体...

一种用于Leptospira生物膜定量、结构与功能分析的模块化工作流程

了解高通量转座子测序技术，用于鉴定钩端螺旋体在金黄叙利亚仓鼠感染模型中的毒力基因。该方法可高效筛选大量突变体，减少动物使用，适用于急性和慢性感染研究。

高通量并行测序检测适应性问号钩端螺旋体转座子插入突变体在金黄叙利亚仓鼠感染过程中的研究

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