Name: 利用彗星试验评价体外DNA 损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习彗星试验技术用于评估体外DNA损伤，通过碱性及中性电泳方法定量检测癌细胞中的单双链断裂。该方法高效简便，适用于基因毒性研究与化疗药物筛选。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所（NCI）和癌症研究中心（CCR）的院内研究计划资助。所有作者均获得了美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所（NCI）和癌症研究中心（CCR）的院内研究基金。

1. 准备试剂
<ol>
	<li>1× PBS
	<ol>
		<li>将 100 mL 10x PBS 用 900 mL dH₂O 稀释2O，并使用 pH 计将 pH 调至 7.4。室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂解液（LS）
	<ol>
		<li>配制 2.5 M NaCl、100 mM 二钠 EDTA、10 mM Tris 碱和 200 mM NaOH 于 900 mL 去离子水中2O；通常需要约 20 分钟使混合物完全溶解。使用 pH 计将 pH 调至 10。加入 1% 十二烷基肌氨酸钠和 1% Triton X-100，定容至 1,000 mL。冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碱性电泳液（AES），pH &gt;13
	<ol>
		<li>配制 200 mM NaOH 和 1 mM EDTA 二钠盐于 800 mL 去离子水中2O. 调节pH值，并确保其为pH &gt;13. 将最终体积调至 1,000 mL。使用前新鲜配制并冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中性电泳溶液（NES）
	<ol>
		<li>通过将 100 mM Tris 碱和 300 mM 醋酸钠溶于 1,000 mL dH₂O 中，配制 1,000 mL 中性电泳缓冲液2O. 用冰醋酸将 pH 调至 9.0，冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA沉淀溶液（DPS）
	<ol>
		<li>10 mL 7.5 M 醋酸铵储备液的配制。取6.7 mL 7.5 M醋酸铵与43.3 mL 95%乙醇混合，制得50 mL DNA沉淀溶液。室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色液
	<ol>
		<li>添加 1 µL 10,000倍绿色荧光核酸染料（例如，SYBR Green）溶于30 mL Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM disodium EDTA，pH 7.4）中，保存于 4 °C避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1% 低熔点琼脂糖
	<ol>
		<li>融化1%低熔点琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O中）2O）中用微波炉加热。每15-20秒摇动一次琼脂糖，确保琼脂糖完全熔化。将琼脂糖置于 37 °C 使用前在水浴中孵育至少 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预热移液器吸头
	<ol>
		<li>将 P200 移液器吸头的细端切去 3 mm，并在 37 °C 在移取琼脂糖之前。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备彗星凝胶电泳载玻片
<ol>
	<li>载玻片包被
	<ol>
		<li>融化1%琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O中）2在微波炉中加热 2 - 3 分钟，或直至琼脂糖完全融化。将玻璃载玻片浸入琼脂糖中，并用无绒擦拭纸擦拭载玻片的一面。</li>
		<li>将载玻片平放在平坦的表面上晾干或加热处理 50 °C 以加快干燥；干燥后应形成透明的琼脂糖膜。将包被好的载玻片放入 37 °C 使用前</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>胶质瘤细胞的培养与处理
		<ol>
			<li>在添加了10% FBS、100 U/mL 青霉素和 10 µg/mL 链霉素在 37 °C 含5% CO₂2.</li>
			<li>使用1 mL胰蛋白酶消化细胞3分钟，用含FBS的DMEM-Ham F-12培养基中和胰蛋白酶。将细胞收集至15 mL离心管中，300 × g离心4分钟，吸除上清液，用培养基重悬细胞至浓度为2 × 10⁶个/mL5 细胞/mL，溶于1×PBS中。 
			注意：细胞样本应在开始实验前立即制备，所有样本均需在避光或弱光环境中操作，以防止光照引起的DNA损伤。</li>
			<li>将细胞悬液与1%熔融的低熔点琼脂糖（置于 37 °C) 按1:10 (v/v) 比例混合，轻轻吹打混匀，立即移液 30 µL 将混合物移至载玻片上。用移液器吸头的侧面涂抹琼脂糖/细胞混合物，以确保形成一层薄层。</li>
			<li>将载玻片平放于 4 °C 在黑暗中静置10分钟。将凝胶时间延长至30分钟可提高样品在高湿度环境中的附着性。</li>
			<li>将载玻片浸入 4 °C 在黑暗中静置1小时至过夜。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单细胞电泳
<ol>
	<li>进行碱性（步骤 3.2）或中性（步骤 3.3）彗星实验</li>
	<li>对于碱性彗星实验
	<ol>
		<li>小心将载玻片从 LS 中取出，沥干多余缓冲液，然后轻轻浸入 AES 中，在 4 °C 下孵育 1 小时以使 DNA 解链。将载玻片避光保存。</li>
		<li>向电泳载玻片槽中加入预冷的 AES，液面高度不得超过载玻片上方 0.5 cm（取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽内并盖上盖子。将电源电压设为 1 V/cm（电极之间的距离），在 4 °C 下电泳 30 分钟。</li>
		<li>沥干载玻片上多余的电泳液。在室温下将载玻片轻轻浸入 dH2O 中两次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在室温下将载玻片轻轻浸入 70% 乙醇中 5 分钟。进入步骤 4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于中性彗星实验
	<ol>
		<li>小心将载玻片从 LS 中取出，沥干多余缓冲液，然后在 4 °C 下轻轻浸入 NES 中 30 分钟。将载玻片避光保存。</li>
		<li>向电泳载玻片槽中加入预冷的中性电泳缓冲液，液面高度不得超过载玻片上方 0.5 cm（取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽内并盖上盖子。将电源电压设为 1 V/cm（电极之间的距离），在 4 °C 下电泳 45 分钟。</li>
		<li>沥干载玻片上多余的缓冲液。在室温下将载玻片轻轻浸入 DPS 中 30 分钟。</li>
		<li>在室温下将载玻片轻轻浸入 70% 乙醇中 30 分钟。进入步骤 4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 染色彗星载玻片
<ol>
	<li>将载玻片在37 °C下避光干燥10 - 15分钟。</li>
	<li>在每个干燥的琼脂糖凝胶上加入50 - 100 µL绿色荧光核酸染色液，室温避光染色15分钟。</li>
	<li>用dH2O短暂漂洗载玻片，并在37 °C下避光彻底干燥。随后进行图像采集与分析。</li>
</ol>
5. 图像采集与分析
注意：DNA断裂的可视化与定量基于落射荧光显微镜和彗星图分析软件（见材料表）12。
<ol>
	<li>将载玻片置于显微镜载物台上，确保琼脂糖凝胶面向物镜。使用配备10倍物镜的荧光显微镜，随机采集染色后彗星实验载玻片的图像。避免采集边缘区域及气泡周围的区域。</li>
	<li>确保每条彗星尾巴呈水平分布，彗星头部应位于左侧，尾部位于右侧。</li>
	<li>将每张图片以二进制TIF格式保存，使DNA染色明亮、背景黑暗。点击工具栏左侧的“选择要分析的文件”按钮，将图像加载到软件中。此时应出现一个图像查看窗口（图1).</li>
	<li>在屏幕上绘制一个测量框，并根据细胞彗星的大小调整其尺寸。点击“Adjust”按钮，根据图像设置头部、彗星和尾部的阈值，然后点击“Start measurements”按钮（图1).</li>
	<li>使用框架选择一个细胞，然后点击“检测彗星”按钮启动测量；选定测量参数的强度图像将显示在“轮廓”窗口。点击“存储结果”按钮可保存结果。图1). 
	注意：该软件会计算包括彗星尾部长度、带尾DNA百分比、尾矩（TM）和Olive尾矩（OTM）在内的各项参数。尾矩的计算公式如下： 
	<img alt="TM 计算公式；DNA 损伤分析；方程" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	<img alt="用于DNA损伤评估的OTM方程；公式表示为（Tail.mean减去Head.mean）除以100。" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"></li>
	<li>每种处理至少分析50个细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li>
<li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+comet+assay%3A+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li>
<li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li>
<li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+targeted+therapy%3A+The+past+or+future+of+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li>
<li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157(2015).</li>
<li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li>
<li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+Repair+in+Cancer%3A+Beyond+PARP+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li>
<li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

彗星试验是一种在细胞水平上检测单链和双链DNA断裂的有效工具。该试验已被广泛应用于遗传毒性研究和生物监测领域，被视为“金标准”。13，范围涵盖碱基损伤、DNA交联、药物开发以及对碱敏感位点。在本研究中，我们分别展示了碱性彗星实验和中性彗星实验的两种不同、逐步详述的操作方案。结合单细胞电泳、荧光显微镜观察及图像分析，碱性与中性彗星实验均可定量评估DNA损伤的程度 体外.
彗星实验的成功实施需要几个关键步骤。例如，在试剂配制过程中应格外注意。每种溶液都应新鲜配制，并在使用前于适当温度下放置至少30分钟，以防止样品制备过程中发生内源性DNA损伤或修复。另一个关键步骤是制备具有活性的单细胞悬液。使用前应将琼脂糖保持在37 °C，以最大限度地提高彗星载玻片制备过程中的细胞存活率。细胞/琼脂糖悬液应在实验开始前立即配制。使用移液器吸头的侧面来铺展细胞/琼脂糖悬液，有助于在载玻片上形成一层薄的琼脂糖，从而使大多数细胞在显微镜观察时处于同一焦平面上。可选地，可使用金刚石笔尖在载玻片边缘划痕，以增强琼脂糖的附着。
<p cla...

彗星试验最初由Ostling和Johanson于1984年在中性条件下通过证明DNA片段从细胞核中迁移而建立1该技术随后由 Singh 进一步发展 等，表明碱性条件显著提高了该检测方法的特异性和可重复性2自那时起，中性彗星实验主要用于检测双链DNA断裂，而碱性彗星实验对较小程度的DNA损伤更为敏感，可检测单链和双链DNA断裂、碱不稳定位点、DNA-DNA或DNA-蛋白交联，以及与不完全切除修复位点相关的DNA单链断裂。3,4两种检测方法均可实现对断裂DNA的可视化，为定量评估DNA损伤提供了简便的方法。彗星试验被认为是检测DNA损伤的敏感方法。 体外 和 体内 遗传毒理学研究，适用于多个研究领域，如早期药物候选物筛选、环境监测、人类生物监测以及DNA损伤与修复的基础研究5. 
该检测方法的原理是在电场作用下，断裂的DNA会从核样体（也称为“彗头”）迁移出来，并在琼脂糖凝胶中形成DNA染色区域（也称为“彗尾”）。通过核苷酸染色，可通过对单细胞电泳形成的“彗星”图像进行分析，定量评估DNA损伤程度。计算尾矩可进一步帮助比较不同实验组之间的DNA损伤水平。与传统的DNA损伤检测方法相比，彗星试验具有直接、灵敏、成本低且相对简便的优点。
放射治疗和化学治疗是通过在染色体上产生单链和双链DNA断裂来治疗癌症的常用策略6。近年来，DNA修复抑制剂的发展使得联合化疗能够产生更有效的基因毒性效应，从而可能减少贫血、感染和骨髓抑制等全身性副作用7,8。在本研究中，我们探讨了一种聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂奥拉帕利（Ola）9。PARP是一种丰富的核蛋白，通过形成聚（ADP-核糖）聚合物参与DNA碱基切除修复过程10。替莫唑胺（TMZ）是一种口服有效的烷化剂，已广泛用于胶质瘤患者的治疗。通过使用彗星实验定量DNA损伤，我们证明奥拉帕利与替莫唑胺联合使用可显著增强胶质瘤细胞中的DNA损伤，表明与单独使用替莫唑胺相比，奥拉帕利/替莫唑胺联合治疗是治疗胶质瘤的一种有效策略11。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS（含Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;，不含Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;）</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>月桂酰肌氨酸钠</td><td>Sigma</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃组织切片</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水平电泳槽</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Quincy Lab</td><td>Model 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

评估 体外 使用彗星试验检测dna损伤

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA损伤是细胞在其生命周期中常见的现象，定义为基因组DNA化学结构的改变。放射治疗和化学治疗等癌症疗法会引入大量额外的DNA损伤，从而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡，以限制癌症的进展。在实验性癌症治疗过程中对DNA损伤进行定量评估，是验证基因毒性试剂有效性的关键步骤。本研究聚焦于单细胞凝胶电泳实验（也称为彗星实验），该方法可用于体外定量单链和双链DNA断裂。in vitro。彗星实验是一种高效且易于操作的DNA损伤定量方法，具有时间与预算需求低、重复性高的优点。本文通过评估奥拉帕利与替莫唑胺联合治疗对中国台湾U251胶质瘤细胞的基因毒性效应，重点阐述彗星实验在临床前研究中的应用价值。

本方案详细描述了彗星实验操作与数据分析的逐步流程（图1）。碱性与中性彗星实验结果表明，经多柔比星处理的U251细胞（1 µM，20 h）其彗星尾更长且DNA强度更高，提示化疗导致断裂DNA大量累积（图2）。
碱性或中性彗星实验的定量分析均显示，经阿霉素处理后，彗星尾部的形成显著增加（图 3A）表明DNA损伤。结果以均值±标准误表示， t-检验用于统计比较。两种实验中尾矩的定量分析均证实平均尾矩增加：对于碱性彗星实验，0.134 ± 0.0448（n = 52）对比 13.84 ± 1.325（n = 51）， p &lt;0.01；中性彗星实验中，0.596 ± 0.06668（n = 78）与 9.979 ± 0.658（n = 51）相...

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。

评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

DNA损伤是细胞在其生命周期中普遍存在的现象，定义为基因组DNA化学结构的改变。癌症...

本实验的总体目标是利用单细胞凝胶电泳法（也称为彗星实验）来研究遗传毒性试剂在癌细胞中的作用效果。该方法适用于多种遗传毒理学研究，可用于早期药物候选物的筛选以及DNA损伤与修复的基础研究。该技术为定量评估DNA损伤提供了一种直接的方法，且具有高效、操作简便和相对经济的优点。通过微波炉加热1%琼脂糖溶液2至3分钟，或直至琼脂糖完全熔化，以制备用于载玻片涂布的琼脂糖溶液。将玻璃显微镜载玻片浸入琼脂糖中，然后用无绒布擦拭载玻片的一面。将载玻片平放在平面上晾干。干燥后应形成一层透明的琼脂糖薄膜。使用前将包被的载玻片置于 37 摄氏度环境中。化疗的治疗效果通过在添加了 10% FBS、100 单位/毫升青霉素和 10 微克/毫升链霉素的 DMEM/Ham F-12 培养基中培养的 U251 胶质瘤细胞进行评估。用 1 毫升胰蛋白酶消化细胞 3 分钟，然后使用含 FBS 的 DMEM/Ham F-12 培养基中和胰蛋白酶。将细胞收集到15毫升离心管中，以300 ×g离心4分钟，吸除上清液。将细胞用1×PBS重悬至浓度为每毫升2×10⁵个细胞。细胞应在开始实验前立即制备，并在操作过程中避光处理。所有操作均在弱光下进行，以防止损伤。将细胞悬液与1%熔化的低熔点琼脂糖按1:10的体积比混合，轻轻吹打混匀。立即吸取30 µL滴加到载玻片上。用移液枪吸头的尖端将琼脂糖混合物涂布均匀，以确保形成一层薄层。将载玻片平放在4°C、避光条件下静置10分钟。将载玻片浸入4 °C的裂解液中，避光孵育1小时至过夜。对于碱性彗星实验，轻轻将载玻片从裂解液中取出，沥去多余液体，再轻轻浸入AES溶液中，于4 °C避光条件下孵育1小时，以使DNA解旋。在电泳载玻片槽中加入预冷的AES溶液。切勿超过载玻片上方0.5厘米。将载玻片放入并盖上盖子。将电源电压设置为每厘米1伏，在4°C下运行30分钟。电泳完成后，倒掉载玻片上多余的AES溶液。将载玻片在室温蒸馏水中轻轻浸入两次，每次5分钟。随后，将载玻片在室温下轻轻浸入70%乙醇中5分钟。进行中性彗星实验时，轻轻将载玻片从裂解液中取出，沥去多余液体，然后在4摄氏度避光条件下浸入NES溶液中30分钟。在电泳载片槽中加入预冷的NES溶液，液面高度不得超过载玻片上方0.5厘米。将载玻片放入槽内，并盖上盖子。将电源电压设置为每厘米1伏，于4摄氏度运行45分钟。从载玻片上移除多余的缓冲液。将载玻片轻轻浸入室温的DNA沉淀溶液中，孵育30分钟。30分钟后，将载玻片轻轻浸入室温的70%乙醇中，孵育30分钟。首先将载玻片在37摄氏度避光条件下干燥10–15分钟，开始此步骤。接着，在每张载玻片的干燥琼脂糖上加入50–100 µL绿色荧光核酸染色液，在室温避光条件下染色15分钟。用蒸馏水短暂冲洗载玻片，然后在黑暗条件下于 37 摄氏度完全干燥。在彗星载玻片染色后立即进行图像采集与分

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癌症研究

利用彗星试验评价体外DNA 损伤

在本视频中，我们演示了一种碱性单细胞凝胶电泳实验方法，用于定量检测经阿霉素处理的细胞中单链和双链DNA断裂。在碱性条件下，DNA碱基对之间的氢键被破坏，导致DNA双链完全解旋和分离。在电泳过程中，未损伤和已损伤的DNA片段在琼脂糖凝胶中发生差异迁移，形成彗星状结构：迁移较慢的未损伤DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的损伤DNA片段则形成拉长的彗星尾部。...

碱性单细胞凝胶电泳：一种用于化疗后单个癌细胞DNA损伤定量检测的高灵敏度技术

该视频演示了在暴露于有害物质后，利用彗星实验检测DNA损伤的方法。在碱性条件下，DNA解旋并发生变性，经过电泳后，未受损和受损的DNA在琼脂糖凝胶中的迁移行为不同，形成彗星状结构。迁移较慢的未受损DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的受损DNA片段则形成拉长的彗星尾部。...

用于细胞DNA损伤检测的彗星实验

彗星试验是一种高效检测所有细胞（包括海马神经元）DNA中单链和双链断裂的方法，可检测碱性不稳定位点以及DNA-DNA/DNA-蛋白质交联。该方法利用不同DNA损伤程度导致DNA在电场中迁移率差异的原理进行检测。...

使用彗星试验法检测海马神经元中的DNA损伤

本文介绍了一种能够以前所未有的通量进行彗星实验检测DNA损伤的平台。该装置可将哺乳动物细胞排列成微阵列，并实现96个样品的并行处理。该方法有助于分析基础水平的DNA损伤、暴露诱导的DNA损伤以及DNA修复动力学。...

CometChip：一种用于在微阵列化人细胞中高通量检测DNA损伤的96孔平台

彗星试验用于检测由不同因素引起的DNA断裂。如果除氧化应激外的所有其他导致DNA损伤的因素均保持恒定，则DNA损伤程度可作为氧化应激的一个良好间接参数。本实验方案的目标是利用彗星试验对氧化应激进行间接测定。...

彗星试验作为系统性氧化应激的间接检测方法

碱性彗星实验用于检测真核细胞中的DNA链断裂。通过添加内切核酸酶III或人8-氧代鸟嘌呤-DNA-糖基化酶消化步骤，该实验可有效检测氧化性DNA损伤。本文描述了利用这些实验方法检测大鼠肝脏中DNA损伤的技术流程。...

体内 碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验用于检测大鼠肝脏中的DNA链断裂和氧化性DNA损伤

本方案描述了在动物尸检时制备高质量冷冻组织样本的几种方法，用于彗星试验以评估DNA损伤：1）剪碎的组织，2）胃肠道刮取的上皮细胞，以及3）需使用组织剪切装置均质化的立方体组织样本。...

使用冻存组织进行彗星实验以评估DNA损伤

彗星试验是检测DNA损伤的常用方法。本研究介绍了一种用于运行彗星试验代表性变体的载玻片操作方法。该方法显著增加了样本数量，同时缩短了试验运行时间、减少了载玻片操作步骤以及凝胶损伤的风险。...

一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法

本方案描述了一种通过彗星实验来定量分析I型和II型抑制剂在FLT3突变细胞中诱导DNA损伤差异的有效方法。...

彗星实验定量分析表达FLT3突变体的32D细胞在暴露于I型和II型FLT3抑制剂后的DNA损伤

关键词：彗星实验，DNA损伤，FLT3突变，32D细胞，I型FLT3抑制剂，II型FLT3抑制剂

本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验方法，可用于在三维环境中定量评估细胞的迁移和侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该实验适用于稀有和/或敏感细胞。...

向上迁移：一种简单灵活的体外三维侵袭实验方案

学习彗星试验技术用于评估体外DNA损伤，通过碱性及中性电泳方法定量检测癌细胞中的单双链断裂。该方法高效简便，适用于基因毒性研究与化疗药物筛选。

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