利用彗星试验评价体外DNA 损伤
October 11th, 2017
彗星试验是一种有效的方法来检测 dna 损伤, 包括单和双 dna 断裂。我们描述了碱性和中性彗星检测肿瘤细胞 DNA 损伤, 以评估化疗的治疗效果。
本实验的总体目标是使用单细胞电泳测定（也称为彗星测定）研究遗传毒性剂在癌细胞中的有效性。该程序是衡量四种遗传毒理学研究的一种意义。它适用于不同的评估，例如早期候选药物选择以及 DNA 损伤和修复的基础研究。
该技术提供了一种定量评估 DNA 损伤的直接方法。而且，它高效、易于执行且相对便宜。通过在微波炉中熔化 1% 的琼脂糖 2 到 3 分钟或直到琼脂糖完全熔化，制备用于载玻片包被的琼脂糖。
将显微镜玻璃玻片浸入琼脂糖中，并使用无绒布擦拭玻片的一侧。将载玻片放在平坦的表面上风干。干燥后应形成透明的琼脂糖膜。
使用前将涂布的玻片置于 37 摄氏度下。在补充有 10% FBS、每毫升 100 单位青霉素和 10 微克/毫升链霉素的 DMEM/Ham F-12 培养基中培养的 U251 神经胶质瘤细胞中评估化疗的治疗效果。使用 1 毫升胰蛋白酶消化细胞 3 分钟，然后使用含 FBS 的 DMEM/Ham F-12 培养基中和胰蛋白酶。
将细胞收集在 15 毫升试管中。并以 300 倍 G 旋转 4 分钟。吸出培养基。
并将细胞以每毫升 10 倍至第五个细胞的两倍浓度悬浮在 1x PBS 中。细胞，应在开始测定前立即制备。而且应该在黑暗中处理。
所有这些都在昏暗的灯光下进行，以防止损坏。将细胞悬液与 1% 熔融的低熔点琼脂糖以 1 比 10 的体积比混合。通过上下移液轻轻混匀。
并立即将 30 μL 移液到载玻片上。使用移液器吸头的滑块涂抹琼脂糖混合物，以确保形成薄层。将玻片平放在 4 摄氏度的黑暗中，放置 10 分钟。
将载玻片浸入 4 摄氏度的裂解溶液中，在黑暗中放置 1 小时至过夜。对于碱性彗星检测，轻轻地从裂解液中取出载玻片，排干多余的液体，然后将载玻片轻轻浸入 AES 中，在 4 摄氏度的黑暗中放置 1 小时，以使 DNA 解旋。在电泳载玻片托盘中添加预冷的 AES。
不要超过载玻片上方 0.5 厘米。将玻片放入其中并盖上盖子。将电源电压设置为每厘米 1 伏特，并在 4 摄氏度下运行 30 分钟。
电泳完成后，从载玻片中排出多余的 AES。将玻片在室温下轻轻浸入蒸馏水中两次，每次 5 分钟。之后，将玻片在室温下轻轻浸入 70% 乙醇中 5 分钟。
对于中性彗星测定，轻轻地从裂解液中取出载玻片，排干多余的液体，然后在 4 摄氏度的黑暗中轻轻浸入 NES 中 30 分钟。在电泳载玻片托盘中加入预冷的 NES，在载玻片上方不超过 0.5 厘米。将玻片放入其中并盖上盖子。
将电源电压设置为每厘米 1 伏特，并在 4 摄氏度下运行 45 分钟。从载玻片中排出多余的缓冲液。将玻片在室温下轻轻浸入 DNA 沉淀溶液中 30 分钟。
30 分钟后，将玻片在室温下轻轻浸入 70% 乙醇中 30 分钟。通过在 37 摄氏度的黑暗中干燥载玻片 10-15 分钟来开始此过程。接下来，将 50-100 μL 绿色荧光核酸染色液滴到每张玻片的干燥琼脂糖上，并在室温下避光染色 15 分钟。
用蒸馏水短暂冲洗玻片，并在 37 摄氏度下在黑暗中完全干燥。在对彗星载玻片染色后立即进行图像采集和分析。将载玻片放在带有载玻片架的荧光显微镜下。
选择 10X 物镜，并确保琼脂糖凝胶面向物镜。从每张染色的彗星载玻片中随机捕获图像。避开边缘和气泡周围的区域。
确保每个彗星尾巴水平分布。彗星头应该从左边开始，彗星头应该从右边开始。将每张图片保存为具有明亮 DNA 染色和深色背景的二进制格式。
对于图像分析，首先使用位于工具栏左侧的 Select Files to Analyze 按钮将所有图像加载到彗星分析软件中。此时应显示一个图像视图窗口。在屏幕上绘制一个测量框，并根据单元的彗星调整其大小。
单击调整以根据图像设置头部、彗星和尾部的阈值。然后点击 开始测量.使用框架选择一个细胞，然后单击 Assay the Comet 按钮激活测量。
强度图像将显示在配置文件窗口中，其中包含选定的测量参数。通过单击 Store Results 按钮保存结果。每次处理至少分析 50 个细胞。
碱性和中性彗星测定的结果表明，阿霉素处理的 UT51 细胞的彗尾较长且具有更高的 DNA 强度，表明片段化 DNA 的大量积累。碱性或中性彗星测定的定量分析显示，阿霉素处理后彗尾形成显著增加，表明 DNA 损伤。PARP 抑制剂奥拉泊尼和烷化剂替莫唑胺的联合治疗显着增强了神经胶质瘤细胞中的 DNA 损伤，这反映在彗尾信号的长度和强度增加上。
单独的 Olaporib 不会引入 DNA 损伤。其中，因为它增强了替莫唑胺的遗传毒性作用。单一和联合治疗下神经胶质瘤细胞的代表性图像显示了用替莫唑胺和奥拉波尼处理的细胞的更长和更高强度的彗尾。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五个小时内完成。开发后，这项技术为遗传毒性领域的研究人员测量多种类型的核细胞中的 DNA 链断裂铺平了道路。如培养的细胞或从生物体中分离的细胞。
观看此视频后，您应该对如何使用 Comet 检测在单细胞水平上研究遗传毒性药物的有效性有很好的了解。不要忘记，使用损伤试剂可能非常危险。在执行此程序时，应始终采取预防措施，例如穿着实验室外套和手套。
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概览
彗星测定法是一种用于检测DNA损伤的有价值技术，包括单链和双链断裂。本文描述了碱性和中性彗星测定法来评估癌细胞中的DNA损伤，特别是在化疗治疗的背景下。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因毒性
- 癌症研究
- DNA损伤评估
背景
- 彗星测定法允许在单个细胞水平评估DNA损伤。
- 它适用于各种情况，包括药物候选物选择。
- 这种方法高效、简单且经济实惠。
- 它提供了DNA损伤的定量测量。
研究目的
- 调查基因毒性剂在癌细胞中的有效性。
- 评估化疗对DNA完整性的治疗效果。
- 加深对DNA损伤和修复机制的理解。
使用的方法
- 琼脂糖的制备用于载玻片涂层。
- 执行碱性和中性彗星测定法。
- 定量评估DNA损伤。
- 在癌细胞研究中应用彗星测定法。
主要结果
- 彗星测定法有效地检测癌细胞中的DNA损伤。
- 碱性和中性测定法都提供可靠的测量。
- 该技术展示了化疗对DNA完整性的影响。
- 结果支持其在药物候选物评估中的使用。
结论
- 彗星测定法是一种评估DNA损伤的稳健方法。
- 它对癌症治疗研究有益。
- 进一步的研究可以扩展其在基因毒性测试中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of DNA damage is critical for evaluating genotoxic agents during early oncology drug discovery and preclinical development. The comet assay enables direct, single-cell measurement of DNA strand breaks, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in candidate selection. Its reproducibility and efficiency make it a valuable tool for portfolio triage and translational research alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of genotoxic mechanisms in candidate compounds.
- Supports functional target validation by quantifying DNA damage response.
- Facilitates mechanistic de-risking and prioritization of oncology assets.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, quantitative readout for DNA damage in cell-based assays.
- Enables standardization and reproducibility across compound screening campaigns.
- Supports scalable evaluation of genotoxicity for lead optimization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical DNA damage endpoints with translational biomarker strategies.
- Enables continuity from in vitro discovery to in vivo validation of genotoxic effects.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for combination therapies.
Pipeline & Workflow Integration
The comet assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing actionable DNA damage data for early-stage oncology programs and supporting lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies DNA strand breaks to clarify genotoxic mechanisms and validate therapeutic hypotheses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound comparison and assay standardization.
- Analytics: Enables statistical analysis of DNA damage intensity and tail length across treatment groups.
- Translational Research: Bridges in vitro DNA damage findings with preclinical biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable platform for genotoxicity assessment across diverse cell models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genotoxicity studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable DNA damage quantification.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in oncology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of drug candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, electrophoresis, and fluorescence imaging.
- Needs access to fluorescence microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various eukaryotic cell types and experimental conditions.
- Practical limitations include handling hazardous reagents and ensuring consistent sample preparation.
