Name: 利用彗星试验评价体外DNA 损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习彗星试验技术用于评估体外DNA损伤，通过碱性及中性电泳方法定量检测癌细胞中的单双链断裂。该方法高效简便，适用于基因毒性研究与化疗药物筛选。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所（NCI）和癌症研究中心（CCR）的院内研究计划资助。所有作者均获得了美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所（NCI）和癌症研究中心（CCR）的院内研究基金。

1. 准备试剂
<ol>
	<li>1× PBS
	<ol>
		<li>将 100 mL 10x PBS 用 900 mL dH₂O 稀释2O，并使用 pH 计将 pH 调至 7.4。室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂解液（LS）
	<ol>
		<li>配制 2.5 M NaCl、100 mM 二钠 EDTA、10 mM Tris 碱和 200 mM NaOH 于 900 mL 去离子水中2O；通常需要约 20 分钟使混合物完全溶解。使用 pH 计将 pH 调至 10。加入 1% 十二烷基肌氨酸钠和 1% Triton X-100，定容至 1,000 mL。冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碱性电泳液（AES），pH &gt;13
	<ol>
		<li>配制 200 mM NaOH 和 1 mM EDTA 二钠盐于 800 mL 去离子水中2O. 调节pH值，并确保其为pH &gt;13. 将最终体积调至 1,000 mL。使用前新鲜配制并冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中性电泳溶液（NES）
	<ol>
		<li>通过将 100 mM Tris 碱和 300 mM 醋酸钠溶于 1,000 mL dH₂O 中，配制 1,000 mL 中性电泳缓冲液2O. 用冰醋酸将 pH 调至 9.0，冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA沉淀溶液（DPS）
	<ol>
		<li>10 mL 7.5 M 醋酸铵储备液的配制。取6.7 mL 7.5 M醋酸铵与43.3 mL 95%乙醇混合，制得50 mL DNA沉淀溶液。室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色液
	<ol>
		<li>添加 1 µL 10,000倍绿色荧光核酸染料（例如，SYBR Green）溶于30 mL Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM disodium EDTA，pH 7.4）中，保存于 4 °C避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1% 低熔点琼脂糖
	<ol>
		<li>融化1%低熔点琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O中）2O）中用微波炉加热。每15-20秒摇动一次琼脂糖，确保琼脂糖完全熔化。将琼脂糖置于 37 °C 使用前在水浴中孵育至少 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预热移液器吸头
	<ol>
		<li>将 P200 移液器吸头的细端切去 3 mm，并在 37 °C 在移取琼脂糖之前。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备彗星凝胶电泳载玻片
<ol>
	<li>载玻片包被
	<ol>
		<li>融化1%琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O中）2在微波炉中加热 2 - 3 分钟，或直至琼脂糖完全融化。将玻璃载玻片浸入琼脂糖中，并用无绒擦拭纸擦拭载玻片的一面。</li>
		<li>将载玻片平放在平坦的表面上晾干或加热处理 50 °C 以加快干燥；干燥后应形成透明的琼脂糖膜。将包被好的载玻片放入 37 °C 使用前</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>胶质瘤细胞的培养与处理
		<ol>
			<li>在添加了10% FBS、100 U/mL 青霉素和 10 µg/mL 链霉素在 37 °C 含5% CO₂2.</li>
			<li>使用1 mL胰蛋白酶消化细胞3分钟，用含FBS的DMEM-Ham F-12培养基中和胰蛋白酶。将细胞收集至15 mL离心管中，300 × g离心4分钟，吸除上清液，用培养基重悬细胞至浓度为2 × 10⁶个/mL5 细胞/mL，溶于1×PBS中。 
			注意：细胞样本应在开始实验前立即制备，所有样本均需在避光或弱光环境中操作，以防止光照引起的DNA损伤。</li>
			<li>将细胞悬液与1%熔融的低熔点琼脂糖（置于 37 °C) 按1:10 (v/v) 比例混合，轻轻吹打混匀，立即移液 30 µL 将混合物移至载玻片上。用移液器吸头的侧面涂抹琼脂糖/细胞混合物，以确保形成一层薄层。</li>
			<li>将载玻片平放于 4 °C 在黑暗中静置10分钟。将凝胶时间延长至30分钟可提高样品在高湿度环境中的附着性。</li>
			<li>将载玻片浸入 4 °C 在黑暗中静置1小时至过夜。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单细胞电泳
<ol>
	<li>进行碱性（步骤 3.2）或中性（步骤 3.3）彗星实验</li>
	<li>对于碱性彗星实验
	<ol>
		<li>小心将载玻片从 LS 中取出，沥干多余缓冲液，然后轻轻浸入 AES 中，在 4 °C 下孵育 1 小时以使 DNA 解链。将载玻片避光保存。</li>
		<li>向电泳载玻片槽中加入预冷的 AES，液面高度不得超过载玻片上方 0.5 cm（取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽内并盖上盖子。将电源电压设为 1 V/cm（电极之间的距离），在 4 °C 下电泳 30 分钟。</li>
		<li>沥干载玻片上多余的电泳液。在室温下将载玻片轻轻浸入 dH2O 中两次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在室温下将载玻片轻轻浸入 70% 乙醇中 5 分钟。进入步骤 4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于中性彗星实验
	<ol>
		<li>小心将载玻片从 LS 中取出，沥干多余缓冲液，然后在 4 °C 下轻轻浸入 NES 中 30 分钟。将载玻片避光保存。</li>
		<li>向电泳载玻片槽中加入预冷的中性电泳缓冲液，液面高度不得超过载玻片上方 0.5 cm（取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽内并盖上盖子。将电源电压设为 1 V/cm（电极之间的距离），在 4 °C 下电泳 45 分钟。</li>
		<li>沥干载玻片上多余的缓冲液。在室温下将载玻片轻轻浸入 DPS 中 30 分钟。</li>
		<li>在室温下将载玻片轻轻浸入 70% 乙醇中 30 分钟。进入步骤 4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 染色彗星载玻片
<ol>
	<li>将载玻片在37 °C下避光干燥10 - 15分钟。</li>
	<li>在每个干燥的琼脂糖凝胶上加入50 - 100 µL绿色荧光核酸染色液，室温避光染色15分钟。</li>
	<li>用dH2O短暂漂洗载玻片，并在37 °C下避光彻底干燥。随后进行图像采集与分析。</li>
</ol>
5. 图像采集与分析
注意：DNA断裂的可视化与定量基于落射荧光显微镜和彗星图分析软件（见材料表）12。
<ol>
	<li>将载玻片置于显微镜载物台上，确保琼脂糖凝胶面向物镜。使用配备10倍物镜的荧光显微镜，随机采集染色后彗星实验载玻片的图像。避免采集边缘区域及气泡周围的区域。</li>
	<li>确保每条彗星尾巴呈水平分布，彗星头部应位于左侧，尾部位于右侧。</li>
	<li>将每张图片以二进制TIF格式保存，使DNA染色明亮、背景黑暗。点击工具栏左侧的“选择要分析的文件”按钮，将图像加载到软件中。此时应出现一个图像查看窗口（图1).</li>
	<li>在屏幕上绘制一个测量框，并根据细胞彗星的大小调整其尺寸。点击“Adjust”按钮，根据图像设置头部、彗星和尾部的阈值，然后点击“Start measurements”按钮（图1).</li>
	<li>使用框架选择一个细胞，然后点击“检测彗星”按钮启动测量；选定测量参数的强度图像将显示在“轮廓”窗口。点击“存储结果”按钮可保存结果。图1). 
	注意：该软件会计算包括彗星尾部长度、带尾DNA百分比、尾矩（TM）和Olive尾矩（OTM）在内的各项参数。尾矩的计算公式如下： 
	<img alt="TM 计算公式；DNA 损伤分析；方程" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	<img alt="用于DNA损伤评估的OTM方程；公式表示为（Tail.mean减去Head.mean）除以100。" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"></li>
	<li>每种处理至少分析50个细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li>
<li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+comet+assay%3A+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li>
<li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li>
<li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+targeted+therapy%3A+The+past+or+future+of+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li>
<li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157(2015).</li>
<li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li>
<li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+Repair+in+Cancer%3A+Beyond+PARP+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li>
<li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

彗星试验是一种在细胞水平上检测单链和双链DNA断裂的有效工具。该试验已被广泛应用于遗传毒性研究和生物监测领域，被视为“金标准”。13，范围涵盖碱基损伤、DNA交联、药物开发以及对碱敏感位点。在本研究中，我们分别展示了碱性彗星实验和中性彗星实验的两种不同、逐步详述的操作方案。结合单细胞电泳、荧光显微镜观察及图像分析，碱性与中性彗星实验均可定量评估DNA损伤的程度 体外.
彗星实验的成功实施需要几个关键步骤。例如，在试剂配制过程中应格外注意。每种溶液都应新鲜配制，并在使用前于适当温度下放置至少30分钟，以防止样品制备过程中发生内源性DNA损伤或修复。另一个关键步骤是制备具有活性的单细胞悬液。使用前应将琼脂糖保持在37 °C，以最大限度地提高彗星载玻片制备过程中的细胞存活率。细胞/琼脂糖悬液应在实验开始前立即配制。使用移液器吸头的侧面来铺展细胞/琼脂糖悬液，有助于在载玻片上形成一层薄的琼脂糖，从而使大多数细胞在显微镜观察时处于同一焦平面上。可选地，可使用金刚石笔尖在载玻片边缘划痕，以增强琼脂糖的附着。
<p cla...

彗星试验最初由Ostling和Johanson于1984年在中性条件下通过证明DNA片段从细胞核中迁移而建立1该技术随后由 Singh 进一步发展 等，表明碱性条件显著提高了该检测方法的特异性和可重复性2自那时起，中性彗星实验主要用于检测双链DNA断裂，而碱性彗星实验对较小程度的DNA损伤更为敏感，可检测单链和双链DNA断裂、碱不稳定位点、DNA-DNA或DNA-蛋白交联，以及与不完全切除修复位点相关的DNA单链断裂。3,4两种检测方法均可实现对断裂DNA的可视化，为定量评估DNA损伤提供了简便的方法。彗星试验被认为是检测DNA损伤的敏感方法。 体外 和 体内 遗传毒理学研究，适用于多个研究领域，如早期药物候选物筛选、环境监测、人类生物监测以及DNA损伤与修复的基础研究5. 
该检测方法的原理是在电场作用下，断裂的DNA会从核样体（也称为“彗头”）迁移出来，并在琼脂糖凝胶中形成DNA染色区域（也称为“彗尾”）。通过核苷酸染色，可通过对单细胞电泳形成的“彗星”图像进行分析，定量评估DNA损伤程度。计算尾矩可进一步帮助比较不同实验组之间的DNA损伤水平。与传统的DNA损伤检测方法相比，彗星试验具有直接、灵敏、成本低且相对简便的优点。
放射治疗和化学治疗是通过在染色体上产生单链和双链DNA断裂来治疗癌症的常用策略6。近年来，DNA修复抑制剂的发展使得联合化疗能够产生更有效的基因毒性效应，从而可能减少贫血、感染和骨髓抑制等全身性副作用7,8。在本研究中，我们探讨了一种聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂奥拉帕利（Ola）9。PARP是一种丰富的核蛋白，通过形成聚（ADP-核糖）聚合物参与DNA碱基切除修复过程10。替莫唑胺（TMZ）是一种口服有效的烷化剂，已广泛用于胶质瘤患者的治疗。通过使用彗星实验定量DNA损伤，我们证明奥拉帕利与替莫唑胺联合使用可显著增强胶质瘤细胞中的DNA损伤，表明与单独使用替莫唑胺相比，奥拉帕利/替莫唑胺联合治疗是治疗胶质瘤的一种有效策略11。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS（含Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;，不含Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;）</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>月桂酰肌氨酸钠</td><td>Sigma</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃组织切片</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水平电泳槽</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Quincy Lab</td><td>Model 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

评估 体外 使用彗星试验检测dna损伤

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA损伤是细胞在其生命周期中常见的现象，定义为基因组DNA化学结构的改变。放射治疗和化学治疗等癌症疗法会引入大量额外的DNA损伤，从而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡，以限制癌症的进展。在实验性癌症治疗过程中对DNA损伤进行定量评估，是验证基因毒性试剂有效性的关键步骤。本研究聚焦于单细胞凝胶电泳实验（也称为彗星实验），该方法可用于体外定量单链和双链DNA断裂。in vitro。彗星实验是一种高效且易于操作的DNA损伤定量方法，具有时间与预算需求低、重复性高的优点。本文通过评估奥拉帕利与替莫唑胺联合治疗对中国台湾U251胶质瘤细胞的基因毒性效应，重点阐述彗星实验在临床前研究中的应用价值。

本方案详细描述了彗星实验操作与数据分析的逐步流程（图1）。碱性与中性彗星实验结果表明，经多柔比星处理的U251细胞（1 µM，20 h）其彗星尾更长且DNA强度更高，提示化疗导致断裂DNA大量累积（图2）。
碱性或中性彗星实验的定量分析均显示，经阿霉素处理后，彗星尾部的形成显著增加（图 3A）表明DNA损伤。结果以均值±标准误表示， t-检验用于统计比较。两种实验中尾矩的定量分析均证实平均尾矩增加：对于碱性彗星实验，0.134 ± 0.0448（n = 52）对比 13.84 ± 1.325（n = 51）， p &lt;0.01；中性彗星实验中，0.596 ± 0.06668（n = 78）与 9.979 ± 0.658（n = 51）相...

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。

评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

DNA损伤是细胞在其生命周期中普遍存在的现象，定义为基因组DNA化学结构的改变。癌症...

本实验的总体目标是利用单细胞凝胶电泳法（也称为彗星实验）来研究遗传毒性试剂在癌细胞中的作用效果。该方法适用于多种遗传毒理学研究，可用于早期药物候选物的筛选以及DNA损伤与修复的基础研究。该技术为定量评估DNA损伤提供了一种直接的方法，且具有高效、操作简便和相对经济的优点。通过微波炉加热1%琼脂糖溶液2至3分钟，或直至琼脂糖完全熔化，以制备用于载玻片涂布的琼脂糖溶液。将玻璃显微镜载玻片浸入琼脂糖中，然后用无绒布擦拭载玻片的一面。将载玻片平放在平面上晾干。干燥后应形成一层透明的琼脂糖薄膜。使用前将包被的载玻片置于 37 摄氏度环境中。化疗的治疗效果通过在添加了 10% FBS、100 单位/毫升青霉素和 10 微克/毫升链霉素的 DMEM/Ham F-12 培养基中培养的 U251 胶质瘤细胞进行评估。用 1 毫升胰蛋白酶消化细胞 3 分钟，然后使用含 FBS 的 DMEM/Ham F-12 培养基中和胰蛋白酶。将细胞收集到15毫升离心管中，以300 ×g离心4分钟，吸除上清液。将细胞用1×PBS重悬至浓度为每毫升2×10⁵个细胞。细胞应在开始实验前立即制备，并在操作过程中避光处理。所有操作均在弱光下进行，以防止损伤。将细胞悬液与1%熔化的低熔点琼脂糖按1:10的体积比混合，轻轻吹打混匀。立即吸取30 µL滴加到载玻片上。用移液枪吸头的尖端将琼脂糖混合物涂布均匀，以确保形成一层薄层。将载玻片平放在4°C、避光条件下静置10分钟。将载玻片浸入4 °C的裂解液中，避光孵育1小时至过夜。对于碱性彗星实验，轻轻将载玻片从裂解液中取出，沥去多余液体，再轻轻浸入AES溶液中，于4 °C避光条件下孵育1小时，以使DNA解旋。在电泳载玻片槽中加入预冷的AES溶液。切勿超过载玻片上方0.5厘米。将载玻片放入并盖上盖子。将电源电压设置为每厘米1伏，在4°C下运行30分钟。电泳完成后，倒掉载玻片上多余的AES溶液。将载玻片在室温蒸馏水中轻轻浸入两次，每次5分钟。随后，将载玻片在室温下轻轻浸入70%乙醇中5分钟。进行中性彗星实验时，轻轻将载玻片从裂解液中取出，沥去多余液体，然后在4摄氏度避光条件下浸入NES溶液中30分钟。在电泳载片槽中加入预冷的NES溶液，液面高度不得超过载玻片上方0.5厘米。将载玻片放入槽内，并盖上盖子。将电源电压设置为每厘米1伏，于4摄氏度运行45分钟。从载玻片上移除多余的缓冲液。将载玻片轻轻浸入室温的DNA沉淀溶液中，孵育30分钟。30分钟后，将载玻片轻轻浸入室温的70%乙醇中，孵育30分钟。首先将载玻片在37摄氏度避光条件下干燥10–15分钟，开始此步骤。接着，在每张载玻片的干燥琼脂糖上加入50–100 µL绿色荧光核酸染色液，在室温避光条件下染色15分钟。用蒸馏水短暂冲洗载玻片，然后在黑暗条件下于 37 摄氏度完全干燥。在彗星载玻片染色后立即进行图像采集与分析。将载玻片置于带载物台的荧光显微镜下。选择10倍物镜，并确保琼脂糖凝胶面向物镜。从每张染色的彗星载玻片上随机采集图像。避免采集边缘区域以及气泡周围的区域。确保每条彗星尾呈水平分布。彗星头部应位于左侧，尾部朝向右侧。将每张图片以二值化格式保存，DNA 染色为亮色，背景为暗色。进行图像分析时，首先使用工具栏左侧的“选择要分析的文件”按钮，将所有图像加载到彗星分析软件中。此时应出现一个图像查看窗口。在屏幕上绘制一个测量框，并根据细胞彗星的大小调整其尺寸。根据图像点击“调整”以设置头部、彗星和尾部的阈值，然后点击“开始测量”。使用框架选择一个细胞，并通过点击“检测彗星”按钮来启动测量。在轮廓窗口中将显示带有选定测量参数的强度图像。单击“存储结果”按钮以保存结果。每种处理至少分析50个细胞。碱性与中性彗星实验的结果显示，经阿霉素处理的UT51细胞其彗星尾更长且DNA强度更高，提示存在大量断裂DNA的积累。无论是碱性还是中性彗星实验的定量分析均表明，阿霉素处理后彗星尾的形成显著增加，表明发生了DNA损伤。PARP抑制剂奥拉帕利与烷化剂替莫唑胺联合处理可显著增强胶质瘤细胞的DNA损伤，表现为彗星尾信号长度和强度的增加。单独使用奥拉帕利时，未引起DNA损伤，但它增强了替莫唑胺的遗传毒性作用。单药及联合治疗下胶质瘤细胞的代表性图像显示，经替莫唑胺与奥拉帕利联合处理的细胞具有更长且强度更高的彗尾。一旦掌握，该技术若操作得当，可在五小时内完成。该技术建立后，为基因毒性研究领域的科研人员提供了测量多种真核细胞（如培养细胞或从生物体中分离的细胞）DNA链断裂的方法，开辟了新的研究途径。观看本视频后，您应能充分理解如何在单细胞水平上利用彗星实验（comet assay）评估一种基因毒性试剂的作用效果。请务必注意，操作损伤性试剂时可能存在极高危险性。在进行本实验操作时，应始终采取必要的预防措施，例如穿戴实验服和手套。

evaluating-in-vitro-dna-damage-using-comet-assay

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

利用彗星试验评价体外DNA 损伤

在本视频中，我们演示了一种碱性单细胞凝胶电泳实验方法，用于定量检测经阿霉素处理的细胞中单链和双链DNA断裂。在碱性条件下，DNA碱基对之间的氢键被破坏，导致DNA双链完全解旋和分离。在电泳过程中，未损伤和已损伤的DNA片段在琼脂糖凝胶中发生差异迁移，形成彗星状结构：迁移较慢的未损伤DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的损伤DNA片段则形成拉长的彗星尾部。...

碱性单细胞凝胶电泳：一种用于化疗后单个癌细胞DNA损伤定量检测的高灵敏度技术

该视频演示了在暴露于有害物质后，利用彗星实验检测DNA损伤的方法。在碱性条件下，DNA解旋并发生变性，经过电泳后，未受损和受损的DNA在琼脂糖凝胶中的迁移行为不同，形成彗星状结构。迁移较慢的未受损DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的受损DNA片段则形成拉长的彗星尾部。...

用于细胞DNA损伤检测的彗星实验

彗星试验是一种高效检测所有细胞（包括海马神经元）DNA中单链和双链断裂的方法，可检测碱性不稳定位点以及DNA-DNA/DNA-蛋白质交联。该方法利用不同DNA损伤程度导致DNA在电场中迁移率差异的原理进行检测。...

使用彗星试验法检测海马神经元中的DNA损伤

本文介绍了一种能够以前所未有的通量进行彗星实验检测DNA损伤的平台。该装置可将哺乳动物细胞排列成微阵列，并实现96个样品的并行处理。该方法有助于分析基础水平的DNA损伤、暴露诱导的DNA损伤以及DNA修复动力学。...

CometChip：一种用于在微阵列化人细胞中高通量检测DNA损伤的96孔平台

彗星试验用于检测由不同因素引起的DNA断裂。如果除氧化应激外的所有其他导致DNA损伤的因素均保持恒定，则DNA损伤程度可作为氧化应激的一个良好间接参数。本实验方案的目标是利用彗星试验对氧化应激进行间接测定。...

彗星试验作为系统性氧化应激的间接检测方法

碱性彗星实验用于检测真核细胞中的DNA链断裂。通过添加内切核酸酶III或人8-氧代鸟嘌呤-DNA-糖基化酶消化步骤，该实验可有效检测氧化性DNA损伤。本文描述了利用这些实验方法检测大鼠肝脏中DNA损伤的技术流程。...

体内 碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验用于检测大鼠肝脏中的DNA链断裂和氧化性DNA损伤

本方案描述了在动物尸检时制备高质量冷冻组织样本的几种方法，用于彗星试验以评估DNA损伤：1）剪碎的组织，2）胃肠道刮取的上皮细胞，以及3）需使用组织剪切装置均质化的立方体组织样本。...

使用冻存组织进行彗星实验以评估DNA损伤

彗星试验是检测DNA损伤的常用方法。本研究介绍了一种用于运行彗星试验代表性变体的载玻片操作方法。该方法显著增加了样本数量，同时缩短了试验运行时间、减少了载玻片操作步骤以及凝胶损伤的风险。...

一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法

本方案描述了一种通过彗星实验来定量分析I型和II型抑制剂在FLT3突变细胞中诱导DNA损伤差异的有效方法。...

彗星实验定量分析表达FLT3突变体的32D细胞在暴露于I型和II型FLT3抑制剂后的DNA损伤

关键词：彗星实验，DNA损伤，FLT3突变，32D细胞，I型FLT3抑制剂，II型FLT3抑制剂

本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验方法，可用于在三维环境中定量评估细胞的迁移和侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该实验适用于稀有和/或敏感细胞。...

向上迁移：一种简单灵活的体外三维侵袭实验方案

学习彗星试验技术用于评估体外DNA损伤，通过碱性及中性电泳方法定量检测癌细胞中的单双链断裂。该方法高效简便，适用于基因毒性研究与化疗药物筛选。

评估体外使用彗星试验检测DNA损伤

探索更多视频

评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

探索更多视频

评估体外使用彗星试验检测DNA损伤