评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

本实验的总体目标是利用单细胞凝胶电泳法（也称为彗星实验）来研究遗传毒性试剂在癌细胞中的作用效果。该方法适用于多种遗传毒理学研究，可用于早期药物候选物的筛选以及DNA损伤与修复的基础研究。

该技术为定量评估DNA损伤提供了一种直接的方法，且具有高效、操作简便和相对经济的优点。通过微波炉加热1%琼脂糖溶液2至3分钟，或直至琼脂糖完全熔化，以制备用于载玻片涂布的琼脂糖溶液。

将玻璃显微镜载玻片浸入琼脂糖中，然后用无绒布擦拭载玻片的一面。将载玻片平放在平面上晾干。干燥后应形成一层透明的琼脂糖薄膜。

使用前将包被的载玻片置于 37 摄氏度环境中。化疗的治疗效果通过在添加了 10% FBS、100 单位/毫升青霉素和 10 微克/毫升链霉素的 DMEM/Ham F-12 培养基中培养的 U251 胶质瘤细胞进行评估。用 1 毫升胰蛋白酶消化细胞 3 分钟，然后使用含 FBS 的 DMEM/Ham F-12 培养基中和胰蛋白酶。

将细胞收集到15毫升离心管中，以300 ×g离心4分钟，吸除上清液。

将细胞用1×PBS重悬至浓度为每毫升2×10⁵个细胞。细胞应在开始实验前立即制备，并在操作过程中避光处理。

所有操作均在弱光下进行，以防止损伤。将细胞悬液与1%熔化的低熔点琼脂糖按1:10的体积比混合，轻轻吹打混匀。

立即吸取30 µL滴加到载玻片上。用移液枪吸头的尖端将琼脂糖混合物涂布均匀，以确保形成一层薄层。将载玻片平放在4°C、避光条件下静置10分钟。

将载玻片浸入4 °C的裂解液中，避光孵育1小时至过夜。对于碱性彗星实验，轻轻将载玻片从裂解液中取出，沥去多余液体，再轻轻浸入AES溶液中，于4 °C避光条件下孵育1小时，以使DNA解旋。在电泳载玻片槽中加入预冷的AES溶液。

切勿超过载玻片上方0.5厘米。将载玻片放入并盖上盖子。将电源电压设置为每厘米1伏，在4°C下运行30分钟。

电泳完成后，倒掉载玻片上多余的AES溶液。将载玻片在室温蒸馏水中轻轻浸入两次，每次5分钟。随后，将载玻片在室温下轻轻浸入70%乙醇中5分钟。

进行中性彗星实验时，轻轻将载玻片从裂解液中取出，沥去多余液体，然后在4摄氏度避光条件下浸入NES溶液中30分钟。在电泳载片槽中加入预冷的NES溶液，液面高度不得超过载玻片上方0.5厘米。将载玻片放入槽内，并盖上盖子。

将电源电压设置为每厘米1伏，于4摄氏度运行45分钟。从载玻片上移除多余的缓冲液。将载玻片轻轻浸入室温的DNA沉淀溶液中，孵育30分钟。

30分钟后，将载玻片轻轻浸入室温的70%乙醇中，孵育30分钟。首先将载玻片在37摄氏度避光条件下干燥10–15分钟，开始此步骤。接着，在每张载玻片的干燥琼脂糖上加入50–100 µL绿色荧光核酸染色液，在室温避光条件下染色15分钟。

用蒸馏水短暂冲洗载玻片，然后在黑暗条件下于 37 摄氏度完全干燥。在彗星载玻片染色后立即进行图像采集与分析。将载玻片置于带载物台的荧光显微镜下。

选择10倍物镜，并确保琼脂糖凝胶面向物镜。从每张染色的彗星载玻片上随机采集图像。避免采集边缘区域以及气泡周围的区域。

确保每条彗星尾呈水平分布。彗星头部应位于左侧，尾部朝向右侧。将每张图片以二值化格式保存，DNA 染色为亮色，背景为暗色。

进行图像分析时，首先使用工具栏左侧的“选择要分析的文件”按钮，将所有图像加载到彗星分析软件中。此时应出现一个图像查看窗口。在屏幕上绘制一个测量框，并根据细胞彗星的大小调整其尺寸。

根据图像点击“调整”以设置头部、彗星和尾部的阈值，然后点击“开始测量”。使用框架选择一个细胞，并通过点击“检测彗星”按钮来启动测量。

在轮廓窗口中将显示带有选定测量参数的强度图像。单击“存储结果”按钮以保存结果。每种处理至少分析50个细胞。

碱性与中性彗星实验的结果显示，经阿霉素处理的UT51细胞其彗星尾更长且DNA强度更高，提示存在大量断裂DNA的积累。无论是碱性还是中性彗星实验的定量分析均表明，阿霉素处理后彗星尾的形成显著增加，表明发生了DNA损伤。PARP抑制剂奥拉帕利与烷化剂替莫唑胺联合处理可显著增强胶质瘤细胞的DNA损伤，表现为彗星尾信号长度和强度的增加。

单独使用奥拉帕利时，未引起DNA损伤，但它增强了替莫唑胺的遗传毒性作用。单药及联合治疗下胶质瘤细胞的代表性图像显示，经替莫唑胺与奥拉帕利联合处理的细胞具有更长且强度更高的彗尾。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在五小时内完成。该技术建立后，为基因毒性研究领域的科研人员提供了测量多种真核细胞（如培养细胞或从生物体中分离的细胞）DNA链断裂的方法，开辟了新的研究途径。

观看本视频后，您应能充分理解如何在单细胞水平上利用彗星实验（comet assay）评估一种基因毒性试剂的作用效果。请务必注意，操作损伤性试剂时可能存在极高危险性。在进行本实验操作时，应始终采取必要的预防措施，例如穿戴实验服和手套。