Name: 检测莱姆病螺旋体,螺旋体螺旋体, 在蜱中使用巢式 PCR (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 了解使用巢式PCR检测蜱虫中伯氏疏螺旋体的方法。该技术通过扩增OspA和FlaB基因，为莱姆病监测提供高灵敏度、高特异性的分子工具，支持公共卫生风险评估。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢Kami Harris在引物设计方面的帮助，感谢Ashley McKibbon和Jessica Thomas-Ebbett负责拍摄，同时感谢John Blakely、Alexandra Foley-Eby、Chris Langley、Julie Lewis、Kelsey McIntyre、Ashley McKibbon、Chris Zinck以及狗狗Rosie参与视频拍摄。A. M. K. 获得了加拿大莱姆病研究基金会的支持，项目资金由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）提供。M. K. B. W. 获得了新不伦瑞克创新基金会（NBIF）的薪金资助。

1. 蜱虫DNA的提取
<ol>
	<li>通过野外采集或从兽医及公众处被动监测获取蜱虫。蜱虫应通过冷冻致死，放入密封袋中，并在室温下邮寄。
	<ol>
		<li>使用提交表格，收集有关接触日期、地理地点、蜱虫附着状态、宿主物种以及宿主近期旅行史的信息。</li>
		<li>由于巢式PCR inherently 易受污染，需确保实验室工作区设置合理，以最大限度减少样本间的交叉暴露。这包括在相互隔离良好的独立专用区域中进行实验流程的不同步骤，各区域应彻底清洁并灭菌，并确保所有仪器无污染物。</li>
		<li>收到样本后，在体视镜下根据鉴定检索表32对蜱虫进行拍照，并确定其种类、发育阶段、性别及吸血程度。</li>
		<li>在无菌条件下，使用无菌剃须刀片或手术刀将蜱虫纵向切开，将两个蜱体片段分别放入不同的微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为提取总DNA，可采用任何能够获得适用于PCR模板的分离方法；本方案展示了一种简单的基于螯合的提取方法。
	<ol>
		<li>首先向蜱虫片段中加入适量（通常为50–200 µL）裂解型螯合试剂。具体体积取决于样本大小和吸血程度；应参考试剂制造商提供的指导说明。使用微型研磨杵充分匀浆。</li>
		<li>将样本置于60 °C水浴中孵育45分钟，并短暂涡旋振荡。</li>
		<li>在台式微量离心机中以16,276 × g（13,300 rpm）离心4分钟。</li>
		<li>将上清液转移至含有50 µL异丙醇的新鲜标记微量管中，通过倒置混合均匀，然后按步骤(1.2.3)重新离心。</li>
		<li>倾去上清液，并用50 µL 70%乙醇冲洗DNA沉淀。</li>
		<li>用移液器吸除多余乙醇，将沉淀在室温下静置空气干燥15分钟。</li>
		<li>为重悬DNA，加入50 µL 1 mM Tris（pH 7.0），并在60 °C水浴中孵育1小时。提取的DNA现可于-20 °C保存，用于后续分子分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Borrelia OspA 和 FlaB 的巢式 PCR 检测。
注意：Lorenz（2012）对常规 PCR 原理和实践提供了概述33。
<ol>
	<li>合成或获取特异性针对 Borrelia 基因的外侧和内侧寡核苷酸引物。引物组合、相应的扩增子大小及熔解温度见表1。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td>基因靶标</td>
			<td colspan="2">序列 (5’-3’)</td>
			<td>扩增子大小</td>
			<td>退火温度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlaB Out Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlaB Out Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlaB In Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlaB In Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OspA Out Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OspA Out Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OspA In Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OspA In Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：伯氏疏螺旋体FlaB和OspA基因巢式PCR的内侧和外侧引物 
在实际操作中， FlaB 引物检测 B. burgdorferi s.s. 及其他近缘种 伯氏疏螺旋体 基因种，而 OspA 引物仅捕获 B. burgdorferi s.s. 两个位点均扩增成功表明 B. burgdorferi s.s.
<ol start="2">
	<li>使用紫外线和70%乙醇对PCR操作柜进行预灭菌。 
	注意：为尽量减少潜在的样本污染，该工作区应与蜱虫解剖、DNA提取和凝胶电泳的操作区域分开。
	<ol>
		<li>进行首次PCR扩增时，使用上游引物与上述步骤1.0中获得的模板DNA，并按照表2所述配制反应体系。同时，设置阳性对照反应，加入经验证的Borrelia DNA；并设置阴性对照反应，即不加模板DNA的反应体系，以检测试剂和气溶胶污染。在所有其他组分加入完毕后最后加入DNA，以最大限度减少试剂污染风险。确保在添加试剂过程中，所有试管始终处于封闭状态，并在加入DNA后立即盖紧试管盖，然后再打开其他试管&#160;。</li>
		<li>将热循环仪程序设置如下：95 °C 预变性5 min；进行40个循环（95 °C 变性15 s，退火温度退火30 s，72 °C 延伸45 s）；72 °C 最终延伸5 min；然后在4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行第二轮PCR扩增，操作与第一轮相似，但使用内侧引物，并以上一轮PCR产物（步骤2.2.2中获得）2 µL作为模板。 
	注意：反应体系体积详见表2。为避免扩增产物交叉污染，必须确保模板DNA最后加入，且每次仅打开一个样本对应的试管。 
	&#160;
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td>组分</td>
				<td>PCR #1 体积</td>
				<td>PCR #2 体积</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Taq聚合酶预混液（2X）</td>
				<td>12.5 µL</td>
				<td>12.5 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>无核酸酶水</td>
				<td>8.5 µL</td>
				<td>8.5 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>10 µM 正向与反向引物</td>
				<td>1.0 µL 外侧引物</td>
				<td>1.0 µL 内侧引物</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>DNA模板</td>
				<td>2.0 µL，来自样本提取（1.2.7）</td>
				<td>2.0 µL，来自第一轮PCR（2.2.2）</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	表2：第一轮和第二轮PCR扩增反应体系。 
	&#160;
	<ol>
		<li>热循环仪程序设置与之前相同，但需根据内侧引物调整退火温度（参见表1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 琼脂糖凝胶电泳与成像
注意：有关通过电泳分离 DNA 的基本操作步骤，请参见 Lee et al., 201234。
<ol>
	<li>使用20X SB缓冲液（0.2 M NaOH，0.8 M 硼酸，pH 8）配制1.2%琼脂糖凝胶，稀释至1X，并在倒胶前加入约5 µL DNA染料（如需对凝胶进行预染色）。</li>
	<li>取各实验组和对照组样本的第二轮（内侧）PCR反应产物10 µL，与5 µL的100 bp DNA Marker一同上样。
	<ol>
		<li>在107 V（5 V/cm）条件下电泳1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用凝胶成像仪（透射光源）及配套相机和软件观察并记录凝胶图像。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

数十年来，基于PCR的技术在检测节肢动物和哺乳动物样本中的Borrelia方面持续证明了其价值，无论这些Borrelia来源于环境还是临床样本。PCR相较于既往的监测方法具有诸多优势。尤其重要的是，它不依赖于抗体试剂的开发和性能，而只需修改引物序列即可轻松适应新目标的检测。PCR还可并行检测多个基因位点，既可独立进行，也可通过多重反应实现。该技术适用于多种类型的样本输入，包括新鲜或存档的蜱虫22、动物或人类体液以及切除的组织25。此外，PCR扩增产物还可进一步处理，例如通过限制性内切酶消化、探针杂交或测序，以更深入地了解微生物的种类信息21。
作为一种临床工具，PCR 在概念上优于标准血清学诊断方法，因为它能够直接指示细菌的存在，而不是依赖宿主免疫反应作为感染的间接指标。然而，莱姆病与相对较低的微生物负荷（&#60;50 个生物体/mL 尿液或血浆）以及短暂的螺旋体血症相关，这可能导致假阴性结果25。该技术在临床中的敏感性因组织类型、感染阶段和样本状况而有显著差异，在现有针对血液、脑脊液和活检组织的研究中，敏感性范围为 12.5% 至 62%36。如果在细菌培养之后进行 PCR，则分子检测敏感性的局限性就不再成为问题；然而，从临床标本中分离出有活性的螺旋体同样具有挑战性。直到最近，才优化出可提高回收率的实验方案35。与此同时，一只感染的成年蜱虫肠道平均可携带 2,000 至超过 50,000 个 Borrelia37,38,39，这一数量明确处于巢式 PCR（nPCR）的检测范围内。因此，该方案非常适用于蜱类监测工作。
尽管巢式PCR具有诸多优势，但它也带来了一些挑战，因此该技术准确报告蜱感染的能力取决于基因和扩增子的策略性选择、严谨的实验流程——以从样本中提取高质量DNA并最大限度减少样品间的交叉污染，以及使用适当的对照来检测实验室环境和试剂中的污染物。在开展任何实验之前，应明确界定研究的范围和目的，以便选择合适的基因位点及其特定区域。如果目标是对引起莱姆病的Borrelia burgdorferi sensu lato复合体进行无偏倚筛查，则引物的设计应能够以相似的亲和力和扩增效率检测所有相关菌株，同时不扩增无关生物体25。新引物可通过Primer-BLAST等软件工具进行in silico设计与评估40，但在用于未知样本前，还必须通过标准参考分离株进行实验验证。DNA提取过程的目标是从混合环境样本（蜱组织匀浆）中回收完整的微生物模板。在进行PCR之前，可选步骤之一是评估所提取DNA的完整性。此外，可同时设置平行反应以扩增蜱的看家基因。该方法还可用于指示反应体系中是否存在抑制物，从而增强对Borrelia阴性结果的信心——即阴性结果归因于目标生物的缺失，而非反应中存在抑制性污染物。
巢式PCR方法灵敏度的提高是以可能产生假阳性结果的污染风险为代价的。外源性模板可能在蜱虫解剖和DNA提取过程中，或在外层和内层扩增反应体系构建过程中被引入样本。因此，遵循PCR最佳操作规范以避免模板或扩增子交叉污染尤为重要。这些措施包括使用具有独立气流的独立工作区，必要时在PCR仪和生物安全柜中进行操作，对表面和试剂进行彻底的化学和物理清洁与灭菌，以及谨慎操作DNA41。无模板对照对于识别储存试剂的污染也至关重要。巢式PCR的一个特殊薄弱环节是在将第一轮反应产物转移至第二轮PCR反应管时的扩增子操作。由于目标DNA在阳性样本中已经经历了指数级富集，该步骤特别容易发生交叉污染，因此已开发出单管巢式PCR方案以克服这一局限。在此方法中，针对特定基因的两对引物被同时加入同一反应管中，整个两轮PCR过程均保持密封31。外层和内层引物对必须具有不同的热力学特性，使得外层引物对在较高的退火温度下扩增模板，而该温度足以抑制内层引物的结合。在第二轮反应中，退火温度降低以适配内层引物对。这种方法不仅规避了一个潜在的干扰步骤，还允许采用额外的防污染措施31,42。然而，这种改良可能会牺牲部分检测灵敏度。无论采用何种方法，增加对同一样本独立进行的技术重复次数，将有助于识别偶然性污染。
自巢式PCR（nPCR）问世以来，分子检测技术不断发展，这些新技术相较于早期设计具有某些优势，但成本也相应增加。顾名思义，定量PCR（qPCR，又称实时RT-PCR）能够对样本中的病原体进行定量，而传统技术仅能提供定性结果43。据报道，qPCR的灵敏度与nPCR相似38，但其性能可能因引物特性而有所波动28。一种qPCR的改进方法采用分子信标（MB）替代传统的TaqMan探针，在临床样本中检测Borrelia方面也展现出良好前景44,45,46。由于分子信标具有独特的二级结构，据报道其背景荧光较低而特异性信号更强，因而具有更高的灵敏度47。临床前评估表明，该方法的潜在检出限为每样本1至10个螺旋体44,45。此外，该技术已成功应用于多重反应，可同时检测哺乳动物宿主基因44及其他蜱传病原体45，而这一功能在nPCR中较难实现。其他技术改进还包括微滴数字PCR（ddPCR），该技术可在无需标准曲线的情况下实现DNA定量39,48。该方法对Borrelia的最低检测限同样约为每样本10个螺旋体39。与nPCR相比，这些方法还具有降低污染风险的优势，因其仅需单一扩增程序。
如果监测的目标是分析蜱虫中多种多样的细菌组成，16S rRNA 宏基因组筛查则是一种理想的选择49。尽管该方法成本较高，需要大多数分子生物学实验室所不具备的专用DNA测序仪，并且需要更复杂的基于生物信息学的数据解读，但它能够捕获更广泛的微生物种类，从而更准确地反映媒介生物的病原体负荷。
尽管qPCR及其衍生方法是定量应用的首选技术，宏基因组学筛查可提供蜱微生物组的广泛名录，但针对媒介中一种或少数几种病原体是否存在进行的靶向监测，通常仅需进行有无的二元报告。在这种情况下，这些更新、更复杂的方法可能会给流程引入不必要的复杂性和经济负担。因此，常规PCR（nPCR）经受住了时间考验，仍是蜱虫检测中的关键技术。

莱姆病（Lyme disease, LD）是北半球最常见的虫媒传染病，其发病率持续上升1。这种致衰性疾病的病原体为莱姆病（LB）复合群的螺旋体（通常称为 Borrelia burgdorferi 广义上（sensu lato，或 s.l.），该类群历史上包含北美主要的病原体， B. burgdorferi 严格意义上（s.s），此外 B. afzelii 和 B. garinii 广泛分布于欧洲和亚洲，是具有新兴临床意义的物种2,3。这些细菌通过受感染的节肢动物叮咬传播给人类 Ixodes 蜱虫2. 尽管北美主要的传播媒介是 I. scapularis 和 I. pacificus该属内的多个物种被发现可携带并传播该细菌4在人类中， B. burgdorferi 可引起多系统症状，影响皮肤、关节、心脏、神经系统、内分泌腺、胃肠道及内脏器官5,6,7,8,9,10美国疾病控制与预防中心目前估计，每年在美国有超过 300,000 例新发人类病例11,12尽管在疾病早期诊断和治疗时预后通常较好，但研究表明，接受推荐抗生素治疗方案的患者中，有10%至60%在治疗结束后仍持续出现症状，这一现象被称为“治疗后莱姆病综合征”（Post Treatment Lyme Disease Syndrome, PTLDS）。13,14,15此外，由于对蜱虫叮咬缺乏认知、初期疾病的非特异性表现，以及在感染初期使用传统基于血清学的诊断方法时敏感性较低，可能导致临床干预的延迟。未能及时并恰当地治疗将导致症状进展，进而出现日益严重的致残性并发症。16,17因此，莱姆病的预防是风险管理的基石。应对这一日益严重威胁的策略包括加强监测措施，以确定病原体在蜱虫中的流行情况，并识别需要关注的地理区域。
本文展示了巢式聚合酶链式反应（nPCR）作为一种分子筛查工具在鉴定感染蜱虫中的应用价值。为了提高特异性，采用两个Borrelia基因进行平行扩增。鞭毛蛋白B（FlaB）编码鞭毛的主要丝状蛋白18，该基因位于单一的线性染色体上；而外表面蛋白A（OspA）的脂蛋白产物介导蜱虫中肠定植，由质粒编码19,20。实验流程包括蜱虫采集、DNA提取，随后进行第一轮PCR以检测Borrelia特异性位点。第二轮PCR则以第一轮反应的产物作为新模板，扩增出更小的内部片段。当通过琼脂糖凝胶电泳可检测到两个Borrelia基因的内侧扩增子时，即判定该蜱虫为Borrelia burgdorferi阳性。
自20世纪90年代初以来，巢式PCR技术以及FlaB和OspA基因靶标已被广泛用于莱姆病螺旋体的生态学监测和临床检测21,22,23,24,25。在分子检测方法建立之前，通常通过将蜱虫肠道内容物进行抗Borrelia免疫荧光（IF）染色、微生物培养或联合使用这些方法来评估蜱虫感染情况26。这些方法存在固有的局限性，包括Borrelia生长缓慢且营养需求苛刻27、抗体性能问题，以及免疫荧光检测需要使用活蜱21。随后，PCR技术被引入，以实现对感染媒介的快速、灵敏且特异的鉴定。相比传统方法，PCR具有显著优势，例如无需依赖培养，可直接应用于多种类型的样本，包括死亡或存档的蜱虫，而这些样本原本不适合进行检测21,22。巢式实验设计通过在两轮连续扩增中使用两套不同的基因特异性引物，进一步提高了传统PCR的特异性和灵敏度25,28。
实验成功在很大程度上依赖于基因的合理选择和扩增子的设计。为了准确检测Borrelia burgdorferi的存在，引物应能特异性识别相关病原体，而不与同属Borrelia的回归热螺旋体发生交叉反应。以FlaB基因为例，这种特异性可通过靶向该基因内部的可变区实现，而非针对多种细菌共有的相对保守的侧翼序列（图1）24,29,30。
<img alt="巢式PCR示意图，使用引物扩增FlaB基因：外侧引物Fwd/Rev，内侧引物Fwd/Rev。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：以Borrelia FlaB基因为靶标的巢式PCR（nPCR）原理示意图。该基因的5'和3'末端在伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）复合群以外的生物中也普遍存在，因此这些区域不适合用于莱姆病致病原的特异性检测。通过选择保守性较低的内部序列作为引物靶区，进行两轮PCR扩增，最终检测到一个位于内部的扩增片段。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
在对其分辨能力的测试中，内层 FlaB 引物被用于检测80多种不同的 Borrelia 分离株，结果发现仅能识别与莱姆病相关的菌株24。巢式PCR（nPCR）的最低检测限在纯培养条件下已被记录为624至1031个细菌，尽管通过将扩增产物进行Southern印迹并使用放射性标记或化学发光探针杂交，可进一步提高其灵敏度。联合使用这些技术可将检测阈值降低至单个螺旋体31。相比之下，传统的未使用探针的单轮PCR最低可检测到104个螺旋体31。然而应注意的是，在处理复杂的环境样本和临床样本时，由于存在大量无关DNA及潜在的抑制物质，检测的灵敏度会降低。这些问题在很大程度上可通过使用巢式PCR（nPCR）加以克服。
尽管过去几十年来分子技术取得了进步，巢式PCR（nPCR）仍然是现代监测工作中的常用技术。只要在本方案的设计和实施过程中谨慎操作，该方法就是一种强大、灵活且相对简单的检测蜱媒介中病原体存在的方法。

<table><tbody><tr><td>LabGard II 级 A2 型生物安全柜</td><td>Nuaire</td><td>ES AIR NU-543&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>厚度 0.22 mm</td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL 微量管）</td><td>Axygen</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>AquaGenomic&amp;nbsp;</td><td>MultiTarget Pharmaceuticals</td><td>2030</td><td>DNA 提取试剂</td></tr><tr><td>微量管研磨杵</td><td>Diamed</td><td>DIATEC610-1551</td><td>适用于 1.5 mL 管</td></tr><tr><td>水浴锅 - Isotemp 202</td><td>Fishse Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Labnet</td><td>S0100 CAN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 24D 数字微型离心机</td><td>Labnet</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>引物合成</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>PCR 操作柜</td><td>Misonix</td><td>PCR6-482</td><td></td></tr><tr><td>带平盖的 0.2 mL PCR 管</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix 2x</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>随 GTG 试剂提供</td></tr><tr><td>Spectrafuge Mini 微型离心机</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 染料（10,000X 浓缩液）</td><td>EDVOTEK</td><td>608</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose LE（分子生物学级琼脂糖）</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>GD 100 bp DNA Marker</td><td>FroggaBio</td><td>DM001-R500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>电泳电源&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>VWR 105</td><td>EC Apparatus Corporation</td></tr><tr><td>Fluor-S MultiImager&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-7700（序列号 433B0154）</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D 分析软件（版本 4.5.2）</td><td>BioRad</td><td>1709600</td><td></td></tr></tbody></table>

使用巢式 pcr 在蜱虫中检测莱姆病螺旋体 borrelia burgdorferi

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

莱姆病是一种严重的虫媒传染病，由疏螺旋体属（Borrelia burgdorferi sensu lato）螺旋体引起，通过感染的硬蜱属（Ixodes）蜱虫叮咬传播给人类。在北美，主要的致病原是伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi sensu stricto）。随着地理风险区域的扩大，有必要支持强有力的监测项目，以测定蜱虫感染率，并将结果传达给临床医生、兽医和公众。巢式聚合酶链式反应（nPCR）分子检测技术长期以来被用于此目的，目前仍是在蜱虫和野生动物中检测疏螺旋体属（Borrelia）的一种核心、经济且可靠的方法。
本文展示了将巢式PCR（nPCR）应用于蜱虫DNA提取物，以鉴定受感染样本的方法。两个独立的 B. burgdorferi 靶点，编码基因 鞭毛蛋白B (FlaB）和 外膜蛋白A (OspA), 已广泛使用该技术。该方案包括蜱虫采集、DNA 提取，然后进行第一轮 PCR 以检测这两种目标物 伯氏疏螺旋体特异性位点。随后的聚合酶链式反应（PCR）以第一次反应的产物作为新模板，扩增出更小的内部片段。巢式PCR方法提高了常规PCR的特异性和灵敏度。当两个内侧扩增子均检测到时，该蜱虫被视为病原体阳性 伯氏疏螺旋体 基因可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

巢式PCR（nPCR）是一种提高病原体检测特异性和灵敏度的精巧方法，尤其适用于分析复杂的环境样本。如图所示 图1，两轮PCR扩增靶向一个策略性区域的 伯氏疏螺旋体 FlaB 位点（以及 OspA，未展示）可用于报告存在的 Borrelia burgdorferi 通过生成较短的内部扩增子来检测细菌。经凝胶电泳分离后， FlaB 和 OspA 可对每只蜱虫的反应产物进行目视评分，并与对照组进行比较。在 图2每个凝胶的顶部均标有独特的样本编号，最左侧和最右侧紧邻分子量标记的位置分别显示无模板对照和气溶胶污染对照。
在部分实验样本中可清晰观察到强健的扩增条带，且能轻松将其与多余的引物和残留 DNA 区分开来（图2）。根据既定的实验设计原则，当平行设置的阴性对照未出现扩增，且由 FlaB 和 OspA 引物均产生内侧扩增子时，可判定该蜱样本对 Borrelia 呈阳性。在此情况下，样本 T907、T604 和 T606 符合莱姆病原体的检测标准（图2）。相比之下，T923 仅在 OspA 基因上呈阳性，这一结果可能存在多种解释：A）来源蜱虫实际不携带 Borrelia，但外侧或内侧 OspA PCR 反应被模板 DNA 意外污染（需注意，通过阴性对照已排除试剂系统性污染）；B）蜱虫携带莱姆病 Borrelia，但因模板量过低或实验操作误差导致 FlaB 未能扩增；或 C）存在某种生物体含有保守的 OspA 序列，但缺乏 Flagellin 基因，或其 FlaB 靶向区域序列与引物的同源性不足，无法有效结合。事实上，已在多种生物（包括植物和动物）中观察到 OspA 序列的相似性28。相反的情况，即仅扩增出更为保守的 Flagellin 基因而未扩增出 OspA 基因，则可能提示存在一种相关的 Borrelia 物种。在实际操作中，该方案产生的 OspA 单一阳性结果多于 FlaB 引物，表明情况 A 是最不可能的解释。然而，在未对存疑样本进行进一步实验分析的情况下，无法确定单一阳性结果的来源。增加技术重复次数可能有助于明确此类样本的真实状态，因为先前反应中偶然引入的污染物不会存在于存档的 DNA 中。但如果使用这些引物的后续反应仍无法得出明确结论，则可通过 PCR 检测其他 Borrelia 基因位点。对这些反应生成的扩增子还可进行测序，并在不同分离株间进行比对，以辅助鉴定其身份并评估菌株间的分化程度。Sapi 及其同事曾以人类临床样本为例展示了这一工作流程35。
综合考虑所有因素，该方案所述的实验流程和判读标准预计产生的假阳性率和假阴性率分别为0.17%和0.0063%。
<img alt="电泳凝胶，DNA条带，DNA标记，350 bp，447 bp，OspA FlaB，分子生物学分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2检测 Borrelia burgdorferi 通过nPCR对单个蜱虫进行检测 FlaB 和 OspA 每个蜱虫对应的编号显示在凝胶图像顶部，其身份信息按垂直方向对齐，以报告检测结果 OspA 和 FlaB 每个样本中的条带。图像左侧标注为 B 的泳道代表无模板对照，而右侧标注为 A 的泳道为气溶胶对照，用于检测实验室环境中的污染。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

巢式PCR是一种灵敏、特异且操作简便的技术，可用于检测蜱虫DNA提取物中的莱姆病病原体——伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）。初次PCR实验使用基因特异性引物扩增出较长的产物片段，这些片段随后作为模板，在第二轮反应中利用内部引物进行扩增。

使用巢式 PCR 在蜱虫中检测莱姆病螺旋体 Borrelia burgdorferi

莱姆病是一种由疏螺旋体属（Borrelia burgdorferi sensu lato）螺旋体引起的严重虫媒感染，这些螺旋体通过……传播

莱姆病是一种由疏螺旋体病原体伯氏疏螺旋体复合体（Borrelia burgdorferi sensu lato）引起的致残性疾病。该细菌通过感染蜱虫叮咬传播给人类，可引起影响皮肤、关节、心脏和神经系统的多系统症状。日常活动如遛狗和徒步旅行可能增加人们感染莱姆病的风险。因此，应对这一日益严重威胁的策略包括加强监测措施，以反映病原体在蜱虫中的流行情况，并确定需要关注的地理区域。本视频展示了巢式聚合酶链式反应作为伯氏疏螺旋体分子筛查工具的应用价值。为提高特异性，本方法针对外膜蛋白A基因和鞭毛蛋白B基因进行扩增。该实验流程从蜱虫采集、DNA 提取开始，随后进行第一轮 PCR 以检测伯氏疏螺旋体特异性位点。第二轮 PCR 则以第一轮反应的产物作为新模板，扩增出更小的内部片段。当通过琼脂糖凝胶电泳可检测到两个伯氏疏螺旋体基因的内部扩增子时，即判定该蜱虫对病原体呈阳性。被动监测借助公众和兽医的帮助，收集蜱虫并送检。在此过程中，重要的是要记录蜱虫宿主、接触日期和地点等信息。在实验室中，应首先对蜱虫进行拍照，并根据与标准检索表的形态学比对进行种类鉴定。巢式PCR的高灵敏度使其容易受到污染，因此样本处理的每个步骤都应在独立且洁净的区域进行，并需设置多个对照，以确保试剂和环境无污染物。工作区域妥善准备后，在灭菌的生物安全柜中将蜱虫切成两半，并将其中一半放入微量离心管中。任何能够获得适用于PCR模板的DNA提取方法均可使用。本视频演示了一种基于螯合的简单DNA提取方法。首先，根据蜱虫片段的大小，加入适量的裂解螯合缓冲液，并使用微型离心管研磨杵进行匀浆。将样品在60摄氏度的水浴中孵育45分钟，涡旋振荡，然后离心内容物。等待期间，为每个样本准备新的微量离心管，每管分装 50 µL 异丙醇。将上清液转移至新的微量离心管中，通过倒置混匀，然后同前次一样重新离心。此次弃去上清液，并用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。用移液器去除残留液体，并在室温下将沉淀空气干燥15分钟。最后，向每份沉淀中加入50 µm的1毫摩尔Tris溶液，并在60°C水浴中孵育1小时以重新溶解DNA。样品现可于-20°C保存，用于后续分子分析。首先使用紫外光和70%乙醇对PCR操作柜进行消毒。反应体系包含含有聚合酶的预混液、水、正向和反向外侧引物，以及上一步骤中提取的DNA。针对每只蜱样本，分别设置独立的反应以单独检测OspA和FlaB。将样品进行瞬时离心，放入热循环仪中，并设置程序。初始PCR实验使用基因特异性的外侧引物，扩增出较长的产物片段。第一次反应产生的PCR产物随后作为后续扩增的模板。该巢式PCR使用基因特异性引物，这些引物与第一轮扩增产物内部区域退火，从而生成新的、更短的DNA片段。将第二轮反应的产物与分子质量参照标记物一同上样至1.2%琼脂糖凝胶中，电泳1小时。最后，使用凝胶成像仪观察结果。在此示例中，每条泳道代表一个不同的蜱虫样本，均针对 OspA 和 FlaB 进行了分析。仅部分泳道中存在扩增产物。尽管这两个样本均产生了 OspA 的 PCR 产物，但只有其中一个检测到 FlaB。样本必须在两个基因上均产生条带才能判定为阳性。通过直接观察PCR产物，即可确定每只蜱虫的伯氏疏螺旋体感染状态。总体而言，巢式PCR是一种灵敏度高、特异性强且相对简便的技术，可用于伯氏疏螺旋体的监测。此类项目产生的数据有助于确定莱姆病的地理关注区域，并估计该病原体在自然界中的流行程度。

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

检测莱姆病螺旋体,螺旋体螺旋体, 在蜱中使用巢式 PCR

莱姆病的研究通常需要制备感染伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）的蜱虫，这一过程通常需要数周时间。本文我们展示一种基于显微注射的蜱虫感染方法，可在数小时内完成。同时，我们还展示了一种用于在蜱虫体内原位定位伯氏疏螺旋体（B.

蜱虫肠道内莱姆病病原体快速转移与定位方法

莱姆病是北美地区报告最多的虫媒传播疾病。其致病菌为伯氏疏螺旋体（Borrelia...

莱姆病研究中用于传播和异体诊断的动物蜱虫喂养

体外转录实验可用于解析伯氏疏螺旋体（Borreliella burgdorferi）中转录调控的机制。本方案描述了纯化伯氏疏螺旋体（B.

Borreliella（Borrelia）burgdorferi 体外转录实验的关键组分

噬菌体在细菌细胞间转移DNA的能力使其成为对其宿主细菌进行遗传操作的有效工具。本文介绍了一种诱导、回收和使用φBB-1噬菌体的方法，该噬菌体是 Borrelia...

噬菌体介导的莱姆病螺旋体 Borrelia burgdorferi 遗传操作

体外 培养是一种直接检测活菌存在的方法。本方案描述了多种细菌的培养方法 伯氏疏螺旋体 螺旋体， 包括那些 Borrelia burgdorferi 广义复合体，回归热 伯氏疏螺旋体 物种，以及 Borrelia...

伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）复合体及回归热疏螺旋体的培养方法

采用三通道双报告荧光流式分析系统，建立了一种基于微球的多重免疫测定方法，可同时检测血清样本中针对多种引起欧洲和北美莱姆病的Borrelia物种抗原所产生的IgG和IgM抗体。...

多重血清学检测中不同抗体类别同时检测

本研究设计了一种点印迹法，用于检测水样中三个主要进化枝的Leptospira。该方法可特异性识别地高辛标记探针所靶向的极微量DNA，并通过抗地高辛抗体实现便捷检测。该技术是一种用于筛查的有效且令人满意的工具。...

聚合酶链式反应和点杂交技术用于水样中Leptospira的检测

本文介绍了在临床研究中使人暴露于肩突硬蜱（Ixodes...

一种用于人类接触幼虫期Ixodes scapularis蜱虫的实验暴露模型

Solaris qPCR 基因表达检测试剂盒是一类新型的预设计 qPCR 引物/探针组合，旨在简化 qPCR...

使用赛默飞世尔科技 Solaris qPCR 检测试剂盒进行定量实时 PCR

定量实时PCR（qRT-PCR）是一种有效检测不同昆虫组织和发育阶段mRNA水平的工具。本报告展示了利用qRT-PCR测定入侵性昆虫物种翡翠 ash 蛀虫（emerald ash...

利用实时荧光定量PCR分析翡翠灰螟（Agrilus planipennis）中的基因表达

了解使用巢式PCR检测蜱虫中伯氏疏螺旋体的方法。该技术通过扩增OspA和FlaB基因，为莱姆病监测提供高灵敏度、高特异性的分子工具，支持公共卫生风险评估。

使用巢式 PCR 在蜱虫中检测莱姆病螺旋体 Borrelia burgdorferi

探索更多视频