检测莱姆病螺旋体,螺旋体螺旋体, 在蜱中使用巢式 PCR

莱姆病是一种由螺旋体病原体伯氏疏螺旋体引起的使人衰弱的疾病。这种细菌通过受感染的蜱虫叮咬传播给人类，并引起影响皮肤、关节、心脏和神经系统的多系统症状。遛狗和远足等日常活动会增加人们感染莱姆病的风险。

因此，应对这种日益增长的威胁的策略包括强有力的监测措施，这些措施可以指示蜱虫中的病原体流行情况并确定令人担忧的地理区域。该视频演示了巢式聚合物链式反应作为疏螺旋体分子筛选工具的实用性。具体而言，外表面蛋白 A 和鞭毛蛋白 B 基因都是扩增的靶标。

该工作流程从蜱虫收集、DNA 提取开始，然后进行第一轮 PCR 以检测疏螺旋体特异性位点。第二轮 PCR 使用第一反应的产物作为新模板，以生成更小的内部扩增片段。当琼脂糖凝胶电泳可以检测到来自两个疏螺旋体基因的内扩增子时，蜱虫被认为对病原体呈阳性。

被动监测寻求公民和兽医的帮助，以收集和提交蜱虫进行检测。作为此过程的一部分，捕获蜱虫宿主、日期和遭遇地点等信息非常重要。在实验室中，应首先根据与标准键的形态比较对蜱虫进行拍照和鉴定。

巢式 PCR 的敏感性使该技术容易受到污染，因此样品处理的每个阶段都应在单独、清洁的位置进行，并应包括多种对照，以确保试剂和环境没有污染物。适当准备工作区后，在消毒的生物安全柜中将蜱虫一分为二，然后将一半放入微量离心管中。可以使用任何产生 PCR 兼容模板的 DNA 分离程序。

该视频演示了一种简单的基于螯合的 DNA 提取方法。首先，根据蜱片段的大小加入适当体积的裂解螯合缓冲液，并使用微管杵匀浆。将样品在 60 °C 的水浴中孵育 45 分钟，涡旋，然后离心内容物。

等待时，通过分装 50 微米异丙醇为每个样品准备新鲜的微量离心管。将上清液转移到新的微量离心管中，倒置混匀，然后像以前一样重新离心。这一次，弃去上清液，用 70% 乙醇冲洗 DNA 沉淀。

使用移液管除去残留液体，并在室温下将沉淀风干 15 分钟。最后，向每个沉淀中加入 50 微米 1 毫摩尔 Tris，并在 60 度水浴中孵育 1 小时以重悬 DNA。样品现在可以储存在零下 20 摄氏度，以备将来进行分子分析。

首先使用紫外线和 70% 乙醇对 PCR 柜进行消毒。反应混合物由含有聚合酶、水、正向和反向外引物以及在先前程序中提取的 DNA 的预混液组成。设置单独的反应以独立检测每个蜱标本中的 OspA 和 FlaB。

脉冲离心样品，将它们放入热循环仪中，然后对机器进行编程。初始 PCR 实验使用产生长扩增子的基因特异性外引物。来自第一个反应的 PCR 产物然后成为后续扩增的模板。

这种巢式 PCR 使用基因特异性引物，在第一个扩增子内退火，以产生新的、更短的 DNA 片段。现在可以将第二个反应的产物上样到 1.2% 琼脂糖凝胶上的分子量参比分子量标准旁边，并电泳 1 小时。最后，使用透射仪观察凝胶。

在这个例子中，每个泳道代表一个不同的蜱标本，分析 OspA 和 FlaB。扩增子仅存在于部分泳道中。尽管这两个样品都产生了 OspA 的 PCR 产物，但其中只有一个样品捕获了 FlaB。

样品必须产生两个基因的条带才能被认为是阳性的。因此，对 PCR 产物进行目视检查可以确定每个蜱虫的疏螺旋体状态。总体而言，巢式 PCR 是一种敏感、特异性且相对简单的技术，可应用于疏螺旋体监测。

此类举措产生的数据有助于确定莱姆病的地理关注区域，并估计该病原体在自然界中的流行率。