Name: 应用脑注射策略建立小鼠 Zika 病毒诱发神经系统疾病模型: 胚胎、新生儿和成人 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习脑内注射技术建立寨卡病毒感染小鼠模型，用于研究胚胎、新生儿及成年阶段神经系统病理机制。该方法有助于探索病毒诱导小头畸形的发病机理及潜在治疗策略。

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作者谨此感谢罗切斯特大学的 Abdellatif Benraiss 博士在学习成年动物和新生动物手术技术过程中提供的指导与讨论。作者还感谢佐治亚大学的 James Lauderdale 博士提供立体定位仪器设备，以及在建立本技术方法过程中所进行的有益讨论；同时感谢 ARCS（Advancement for Research College Scientists）基金会提供的支持，以及美国国立卫生研究院（NIH）的资助（NINDS 资助号 R01NS096176-02、R01NS097231-01）。 &amp;#38; F99NS105187-01)

所有动物使用方案均遵循南加州大学和佐治亚大学的动物护理指南。&#160;对妊娠母鼠和成年鼠实施安乐死的方法依据批准的方案进行：先使用二氧化碳窒息法，随后以颈椎脱位作为辅助方法以确保安乐死完成。新生幼鼠通过断头法实施安乐死。
警告：以下实验方案涉及病原性病毒的操作。操作病毒时必须采取适当的预防措施。所有实验方案在实施前必须获得相应机构委员会的批准。
1. 寨卡病毒胚胎颅内接种
<ol>
	<li>对于定时妊娠交配，将交配后当天的中午定为E0.5。在一天结束时将小鼠配对，并于次日清晨检查阴栓&#160;以减少交配时间的变异性。</li>
	<li>手术前准备玻璃针。拉制针头并在适当位置切断&#160;其长度的1/3，然后使用带有水滴的微管拉针仪以45°角进行打磨，直至尖端孔径达到50–70 µm。在体视显微镜下检查针尖质量及是否有断裂。</li>
	<li>将病毒分装物置于冰上。手术前，将ZIKV注射混合液装入已准备好的玻璃注射针中。组装无漏气注射器（50 µL容量）、鲁尔锁接头和管路，并用矿物油充分填充注射器及管路。填充完成后，安装针头，并吸取约6–7 µL的ZIKV至针头中（约1 µL相当于1.7 × 106 TCID50/mL</li>
	<li>向妊娠的 C57BL/6J 或 129S1/SvImJ 小鼠注射盐酸氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg），胚胎注射时间为胚胎第 14.5 天（E14.5，用于颅内注射）或胚胎第 10.5 天（E10.5，用于宫内注射）&#160;mg/kg）溶于无菌生理盐水中，通过腹腔注射以对母体进行麻醉。或者，可根据情况采用吸入式异氟烷（isoflurane）在监控下对母体实施麻醉，并配备废气清除系统。皮下注射缓释布托啡诺（buprenorphine-SR）（0.5–1.0 mg/kg）以诱导镇痛。</li>
	<li>对麻醉后的母鼠进行足趾或尾部夹捏测试，然后将其仰卧置于符合动物使用标准的加热垫上（尺寸为100 × 200 × 2.5 mm的温控垫）。&#160;趾夹钳未经灭菌处理，不可用于手术中接触组织。也可戴手套用手测试趾夹退缩反射。 
	注意：&#160;请咨询您所在机构的兽医工作人员，以确定首选的围手术期加热方法。在加热垫与动物之间放置了一层覆盖物。</li>
	<li>涂抹眼用软膏&#160;眼睛</li>
	<li>剃除腹部表面毛发，并用碘伏和酒精各消毒三次。交替使用碘伏和酒精擦拭，擦拭时以手术区域为中心，由内向外做环形擦拭。</li>
	<li>用无菌布覆盖手术部位周围的皮肤，以避免切口和器械受到污染。 
	注意：无菌手术巾的开口不应大于已准备好的手术区域；无菌手术巾的开口内不应看到任何毛发。</li>
	<li>用镊子将母鼠腹部皮肤与腹壁分离，使用无菌手术剪在正中矢状线处沿下腹部做1-1.5 cm的切口。该切口将依次穿过皮肤并深入腹腔，使胚胎暴露出来。 
	注意：使用手术剪切开皮肤和腹膜层。无菌器械和手套&#160;每次手术均使用上述材料。</li>
	<li>在一小块无菌纱布中央剪开一个切口，将其覆盖于手术切口上方。用无菌生理盐水润湿。小心地将胚胎经切口拉出，使其置于无菌纱布上，注意每次拉出的胚胎数量不超过4–5个&#160;一次专注于一个子宫角&#160;时间。</li>
	<li>在接种前及整个接种过程中，使用无菌生理盐水水化胚胎，以确保胚胎不会干燥。记录已注射的胚胎及其在容器中的位置&#160;子宫角&#160;因此，每个胚胎被视为独立的实验，因为胚胎在发育过程中不会改变位置 在子宫内（继续进行步骤1.15以进行宫内注射）。</li>
	<li>用解剖刀轻轻置于胚胎头部下方。使用灯光充分照亮胚胎，以便观察头部及颅骨缝。 
	注意：遵循无菌操作技术，包括使用无菌外科手套和器械。在操作非无菌物品（如光源）后，&#160;手套应&#160;在接触无菌器械和无菌区域之前，需更换为新的无菌手套。</li>
	<li>通过灯（置于头部后方以增强可视性）和空闲的手指操作胚胎，调整其头部位置，直至胚胎头部紧贴子宫壁，并用非优势手固定。 
	注意：胚胎的定位是操作中的关键步骤，也是最需要练习的技术。手指压力过大可能损伤胚胎膜，导致胚胎死亡；压力不足则会使注射困难。</li>
	<li>以沿颅缝走行的血管为引导，注射ZIKV病毒（约1 µL，1.7 × 106 将TCID50/mL的墨西哥分离株MEX1-44通过组装好的注射器和针头注入E14.5胚胎脑的侧脑室。使用对照培养基进行假注射作为对照。</li>
	<li>为提高妊娠保留率，应避免向靠近卵巢的两个胚胎以及靠近上阴道的两个胚胎注射病毒图1A总体而言，每窝注射的胚胎数不超过6个，以缩短手术时间并防止胚胎丢失。</li>
	<li>将注射后的胚胎放回怀孕母鼠体内，并向腹腔内注入约0.5 mL无菌生理盐水。缝合时，先用4.0无菌缝线缝合腹膜肌肉层，再缝合外部皮肤层。&#160;建议使用间断缝合；若小鼠啃咬缝线，可能导致伤口裂开。</li>
	<li>将小鼠放入一个部分悬空的笼子中&#160;在加热垫上，以便小鼠在需要时可逃至非加热区域。密切观察母鼠&#160;在麻醉恢复期间（1 - 2 小时）。根据具体实验要求，在手术后培养胚胎不同时间。</li>
	<li>宫内注射
	<ol>
		<li>将一侧子宫角及胚胎暴露后，使用1 mL注射器和27G针头注射100 μL寨卡病毒（106 TCID50 将悬浮于100 μL DMEM中的单位（units）或对照培养基注入子宫腔或胎盘组织中。标记已注射的胚胎，以便进行胚胎期解剖。更多细节请参见先前已发表的研究。18.</li>
		<li>将已注射的胚胎放回怀孕母鼠体内，并向腹腔注入约 0.5 mL 无菌生理盐水。&#160;最后，先缝合腹膜肌肉层，再用4.0无菌缝线缝合外部皮肤层。建议采用间断缝合；若小鼠啃咬缝线，可能导致伤口裂开。</li>
		<li>将小鼠放入&#160;一个部分搁置的笼子&#160;在加热垫上放置，以便小鼠在需要时可逃至非加热区域。密切观察母鼠&#160;在麻醉恢复期间（1 - 2 小时）。根据具体实验要求，在手术后培养胚胎不同时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 新生儿脑内接种寨卡病毒：P0/P1
<ol>
	<li>确保气密性注射器（10 µL 容量）和针头无堵塞。使用三支 20 mL 一次性注射器各安装 26 号针头进行清洗和测试：一支装入生理盐水，一支装入 70% 乙醇，一支装入空气，以清除残留液体。若此前用于病毒注射，需用 0.1% 次氯酸钠溶液消毒。</li>
	<li>将病毒置于冰上。用生理盐水填充注射器以减少死体积，并吸入 0.75 µL 空气，以分隔生理盐水与注射材料。</li>
	<li>为注射后的幼鼠准备一个预热并加湿的恢复室。使用加热模块，将一个可封闭的容器（如空的吸头盒）内放入无菌纱布，并用生理盐水湿润以增加湿度。在开始注射前将其预热。</li>
	<li>设置显微注射仪，包括泵和控制器。确定特定注射器的设备类型代码（即，对于10 µL注射器，设备类型为 &#34;D&#34;). 确定注射速度。</li>
	<li>在手术装置附近收集出生后第0或第1天的幼鼠（P0/P1）。用病毒溶液填充注射器。用70%乙醇消毒幼鼠头部固定装置。</li>
	<li>将幼崽用一层薄纱布包裹，完全埋入冰中以达到麻醉状态。幼崽冷冻麻醉持续5分钟。通过执行以下操作确保幼崽已充分麻醉以进行注射：&#160;尾部/脚趾夹捏无反应。这大约可维持15分钟的麻醉状态。</li>
	<li>将幼鼠置于头部固定装置上，用碘伏对头部表面进行消毒，&#160;乙醇（三次）&#160;然后用无菌擦拭布（异丙醇或70%乙醇）擦干。</li>
	<li>马克&#160;用黑色记号笔标记λ并记录&#160;的&#160;使用立体定位仪在λ点处确定坐标。测量从λ点到眼缘的距离&#160;从立体定位坐标λ点开始&#160;计算从λ点到眼睛距离的2/5处（如果双侧半球均需注射，则两侧均需计算）。</li>
	<li>在注射位点钻孔前，重新检查麻醉深度。使用26号针头在注射位置小心且表浅地穿刺幼鼠的头皮和颅骨（幼鼠颅骨非常柔软），以创建注射针的开口。</li>
	<li>将注射针插入穿刺部位，当针尖刚刚穿透皮肤时，使用立体定位仪确定注射位点（侧脑室）的深度为1 mm。</li>
	<li>当针头下降至注射深度后，设置微量注射器进行注射：以 10 nL/s 的速度注射 1 µL 病毒，约 1.5 分钟内完成 1 µL 的注射（约 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV</li>
	<li>注射结束后，等待30秒，然后通过旋转螺钉（背侧方向）以0.5 mm为步长逐步撤出针头，每次撤出后等待30秒。 
	注意：这可以减少注射病毒的泄漏。</li>
	<li>移除后，立即用更多病毒（不同病毒或模拟对照应分别装入不同的注射器/针头）重新装填针头和注射器，或立即将幼鼠从头部固定装置转移至预热的加湿培养箱中。每隔几分钟观察幼鼠一次，以评估其恢复情况。将幼鼠放回同窝幼鼠中。</li>
</ol>
3. 成年个体脑内接种寨卡病毒
<ol>
	<li>向成年小鼠腹腔注射&#160;盐酸氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）&#160;用无菌生理盐水稀释以诱导麻醉。皮下注射缓释布托啡诺（0.5–1.0 mg/kg）以诱导镇痛。&#160;用足趾/尾部夹捏法检测小鼠的麻醉状态，随后将其固定于立体定位仪（带加热垫）上，以在手术过程中固定头部。&#160;</li>
	<li>将眼用软膏涂抹于眼睛&#160;防止小鼠眼睛在手术过程中变干。从眼睛后方开始剃除头皮毛发，直至耳部前端。用碘伏和70%乙醇对暴露的皮肤消毒三次。&#160;交替使用碘伏和酒精棉片；以环形动作从手术区域向外擦拭。</li>
	<li>在切开皮肤前重新检查麻醉深度。使用手术刀在已消毒的头部正中矢状线上做一处0.5 cm的切口，暴露下方组织。&#160;前囟。使用棉签进行滚动操作，清除颅骨表面的脑膜组织，同时将皮肤从注射部位推开。</li>
	<li>从...开始&#160;前囟，对准手术钻头，并使用以下坐标确定注射位点：前后向 -0.5 mm，内外侧 ±1.5 mm。使用控制脚踏板缓慢钻颅，仅钻透颅骨，直至为针头清理出穿刺孔。</li>
	<li>将钻头更换为体视定位仪上的微量注射泵和气密性注射器（10 µL 容量）。在生理盐水溶液与病毒液之间保留一小段气泡，吸取约 4–5 µL 病毒液。根据所用注射器的容量确定设备类型代码（例如，10 μL 注射器对应代码 D）。将针头下降至 DV：脑表面下 -1.5 mm。为注射 1 µL 病毒液，设定注射速率为 10 nL/s，持续注射约 1.5 分钟，完成 1 µL 的注入。</li>
	<li>注射完成后，等待30秒，然后以每次0.5 mm的幅度逐步撤出针头，每次移动后等待30秒。此操作可减少病毒溶液的回流和泄漏。</li>
	<li>注射完成后，用镊子松解皮肤并复位暴露的颅骨。使用4.0缝线将头皮缝合。&#160;将小鼠从立体定位仪中取出。&#160;将小鼠置于部分放置在加热垫上的笼子中，以便小鼠在需要时可移动至无加热区域，并在小鼠从麻醉中恢复期间（1 - 2 h）进行监测。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在胚胎期、新生期和成年期对脑内接种寨卡病毒（ZIKV）的方法，用于研究ZIKV对脑发育造成的损伤。该方法虽然简单直接，但研究者需注意若干事项，以确保研究质量以及相关人员的安全。
DENV 与黄病毒属中的 ZIKV 密切相关。目前尚未发现 DENV 与人类儿童脑部疾病存在因果关联。采用胚胎接种法（约 1 µL 的 3.4 x 10⁷ PFU/mL DENV2 病毒液），DENV2 可成功感染并在发育中的脑组织中复制。5 TCID50/mL) (图 2D）。因此，除了使用未感染的Vero细胞培养基（模拟处理）外，还可以利用登革病毒（DENV）感染作为阴性对照，以研究寨卡病毒（ZIKV）在发育中大脑中的特异性致病机制。必须注意避免病毒泄漏 在子宫内这可能导致其他胚胎受到意外污染。因此，有必要通过分离每个胚胎的脑组织，随后进行qRT-PCR或TCID50检测，以确认感染与非感染个体。可在病毒溶液中添加染料以直观确认注射过程，但需验证染料本身是否会造成损伤。
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小头症是一种由于大脑发育缺陷导致的疾病，表现为新生儿头部尺寸小于平均水平。小头症患儿的症状表现多样，可能包括发育迟缓、癫痫发作、智力障碍、听力损失、视力问题以及运动和平衡障碍等，具体表现取决于疾病的严重程度和病因。1,2,3该疾病具有多因素病因，遗传因素、病原体以及环境因素均与小头症的发生相关。4,5,6,7,8,9在2015至2016年寨卡病毒（ZIKV）疫情暴发之前，根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，美国每10,000名新生儿中有8名被诊断为小头症102月1日st 2016年，世界卫生组织宣布寨卡病毒为国际关注的公共卫生紧急事件，原因是感染寨卡病毒（ZIKV）的孕妇所分娩的婴儿中，小头症诊断病例显著增加，令人担忧11,12美国疾病控制与预防中心（CDC）近期一项关于美国寨卡病毒（ZIKV）病例的研究表明，与未感染个体相比，母亲在孕期感染ZIKV会使胎儿发生小头症的风险增加20倍，且美国感染ZIKV的母亲中有4%产下了患有小头症的婴儿。11巴西地区孕妇感染寨卡病毒（ZIKV）后，与小头症相关的出生缺陷发生率据报道高达受感染母亲所生婴儿的17%，表明拉丁美洲可能存在其他因素加剧了此类风险13. 虽然我们已知寨卡病毒（ZIKV）可在神经前体细胞（NPC）群体中引起小头畸形及致病过程7,8,14，寨卡病毒（ZIKV）在发育中脑部的完整致病机制仍不明确。建立动物模型以进一步研究与ZIKV感染相关的脑部异常疾病机制至关重要。
为了直接研究寨卡病毒（ZIKV）对大脑发育的影响，我们首先建立了一种小鼠模型，通过在胚胎第14.5天（E14.5）向脑内接种ZIKV7。选择这一阶段是因为它被认为相当于人类妊娠第一孕期的末期14。采用这种胚胎期脑内注射方法（注射量约为1 µL，病毒滴度为1.7 × 106 组织培养感染剂量（TCID50/mL）），幼鼠可存活至出生后第5天（P5）。这些新生小鼠表现出多种表型，与感染ZIKV的人类婴儿中观察到的表现相似，包括脑室扩大、神经元丢失、轴突稀疏、星形胶质细胞增生以及小胶质细胞活化12,15。新生小鼠的大脑相对不成熟，类似于人类胎儿中期妊娠时的大脑发育阶段16，而小鼠的大脑发育包含显著的出生后阶段。为了研究妊娠后期阶段的感染，本文还描述了一种出生后感染的方法。在出生后第1天（P1）感染ZIKV的新生小鼠，可在注射后存活达13天。此前已有研究报道通过血液传播途径在成年小鼠中建立ZIKV感染模型17，但该方法需使用干扰素（IFN）调节因子转录因子IRF-3、-5、-7三重敲除小鼠品系。本实验方案描述了一种通过脑室内接种ZIKV的方法，以避免在成年小鼠模型中抑制其抗病毒免疫应答。尽管该方法绕过了小鼠的免疫系统，但其感染途径并不能直接模拟自然感染过程。为直接解决这一差异，实验者可采用宫内感染ZIKV的方式，替代颅内注射途径。该技术借鉴了先前的研究工作18，本文在胚胎期感染方案中对此技术进行了简要描述。
本技术所使用的寨卡病毒毒株包括墨西哥分离株 MEX1-447,19 和1947年分离的非洲分离株 MR-76620。寨卡病毒 MEX1-44 于2016年1月从墨西哥恰帕斯州一只感染的埃及伊蚊（Aedes aegypti）中分离获得。我们经许可通过加尔维斯顿德克萨斯大学医学分部（UTMB）获得了该病毒。此外，在一项比较研究中，本技术也用于接种2型登革病毒（DENV2）。DENV2 毒株 S16803（GenBank 序列号 GU289914）于1974年从泰国患者样本中分离，并在 C6/36 细胞中传代。在用于小鼠注射前，该病毒由世界新发病毒和节肢动物传播病毒参考中心（WRCEVA）在 Vero 细胞中传代两次。这表明，该技术同样适用于多种寨卡病毒毒株及其他可能影响大脑发育的黄病毒。

<table><tbody><tr><td>柔性传动轴钻机悬挂电机</td><td>Leica</td><td>39416001</td><td></td></tr><tr><td>小鼠立体定位仪</td><td>Kopf</td><td>04557R</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 微量注射泵控制器</td><td>WPI</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 超微量泵</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Modulamp</td><td>Schott</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁紧接头管路（19 号规格）</td><td>Hamilton</td><td>90619</td><td></td></tr><tr><td>熔点毛细管</td><td>Kimble</td><td>34500-99</td><td>玻璃针头</td></tr><tr><td>Fluoro-Max：红色荧光微球</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25</td><td>无需稀释；用于练习注射</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L，型号 1701 LT SYR</td><td>Hamilton</td><td>80001</td><td>用于胚胎接种</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L，型号 1701 RN SYR，小型可拆卸针头，26s 规格，2 英寸，2 型尖端</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>用于新生鼠/成年鼠</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon 尼龙缝线</td><td>Ethicon</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>VWR</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器研磨仪</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF 染料</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td>与 0.5% 染料一同注射</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>黄病毒属群特异性抗原抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB10216</td><td>小鼠 IgG2a，1:400（&lt;strong class=&quot;xfig">图 2&lt;/strong&gt;，&lt;strong class=&quot;xfig">图 3&lt;/strong&gt;）</td></tr><tr><td>Pax6</td><td>DBHB</td><td>Pax6-s</td><td>小鼠 IgG1，1:20</td></tr></tbody></table>

建立寨卡病毒诱导的神经系统疾病小鼠模型：采用脑内注射策略的胚胎期、新生期及成年期研究

胚胎期、新生期、成年期、脑内注射、寨卡病毒、神经系统疾病、小鼠模型

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

寨卡病毒（ZIKV）是一种黄病毒，目前在北美、中美和南美洲呈地方性流行。现已明确，ZIKV 可导致小头畸形及其他脑部异常。然而，ZIKV 在发育中脑组织中致病机制仍不明确。在神经科学研究中，颅内手术方法常用于探讨正常与异常脑发育及脑功能相关的问题。本实验方案采用经典外科技术，描述了可在小鼠神经系统中模拟 ZIKV 相关人类神经系统疾病的方法。虽然直接脑内接种并不能模拟病毒的自然传播途径，但该方法可使研究人员针对 ZIKV 感染发育中脑组织后的后果提出特定科学问题。本方案详细阐述了在胚胎期、新生期和成年期进行脑室内接种 ZIKV 的操作步骤。一旦掌握，该方法将成为一种简便且可重复的技术，操作时间仅需数小时。

图中展示了我们用于寨卡病毒（ZIKV）胚胎脑部接种的注射方法示意图，包括脑内注射（图1A）以及子宫内和胎盘内注射（图1B），说明了手术过程中应如何观察和定位妊娠母鼠及其胚胎（胚胎接种方案）。图2A 显示了E18.5脑皮层中ZIKV（MEX1-44）感染情况（使用黄病毒属群特异性抗原抗体进行免疫染色，绿色），Pax6（红色）标记发育中皮层的神经前体细胞（NPCs）。ZIKV于E14.5胚胎脑内接种。通过对组织样本进行TCID50检测7，我们的病毒增殖曲线分析表明，ZIKV可在发育中的脑组织中高效复制和增殖（图2B、2C），结果与已发表文献一致7。图2D...

本文介绍了一种在小鼠中建立寨卡病毒诱导的小头畸形模型的方法。该方案包括在胚胎期、新生期和成年期对小鼠进行脑内接种寨卡病毒的技术。

寨卡病毒（ZIKV）是一种黄病毒，目前在北美洲、中美洲和南美洲呈地方性流行。现已证实，ZIKV 可导致小头症……

本文所介绍的手术方法的总体目标是建立寨卡病毒颅内感染的体内模型。该方法有助于解决该领域中的关键问题，例如寨卡病毒在脑组织中的病理学特征及其在早期和晚期发育阶段以及成年阶段的感染机制。该技术的主要优势在于能够简便地实现对脑组织的定向感染。该技术的应用前景涉及寨卡病毒所致小头症或其他神经发育障碍的治疗或诊断。尽管该方法可为研究寨卡病毒的致病机制提供见解，也可用于研究其他黄病毒感染在脑组织中的影响，例如登革病毒。手术前，先将气密式50微升注射器的鲁尔锁接头和管路组装好，然后将寨卡病毒注射液注入已准备好的玻璃注射针中。用矿物油充分浸润组装好的注射器和管路。浸润完成后，安装针头并吸取约六到七微升病毒液。对怀有 E14.5 胚胎的母鼠进行麻醉后，通过捏压脚趾或尾巴来测试麻醉深度。当达到外科麻醉平面时，确保将动物仰卧于加热垫上。剃除腹部表面的毛发，并用碘酒和酒精消毒三次。用无菌布巾覆盖手术区域周围的皮肤，以避免切口和器械受到污染。用镊子夹起腹部皮肤并提起，然后使用无菌剪刀在腹部下方沿正中矢状线剪开一个1至1.5厘米的切口，暴露胚胎。接着，在一小块无菌纱布的中部剪开一条缝隙，将其覆盖在手术切口上。用无菌生理盐水润湿切口和纱布。然后，将胚胎轻轻拉过切口，使其停留在纱布上，注意每次取出的胚胎不要超过四到五个。在接种前及整个接种过程中，使用无菌生理盐水润湿胚胎，以确保胚胎不会干燥。用光源照射待注射的胚胎，以便观察头部及颅骨缝合线，然后将刮勺轻轻置于待注射胚胎的头部下方，调整胚胎位置，直至其头部紧贴子宫壁。用非优势手固定胚胎。使用注射器将寨卡病毒或对照培养基注入胚胎脑部的侧脑室。对于E11.5阶段的宫内注射，使用1毫升注射器和27号针头将寨卡病毒或对照培养基注入宫腔内。为提高妊娠成功率，应避免将两个胚胎注射至卵巢附近，以及将另外两个胚胎注射至阴道上部附近。若进行宫内注射，应将胚胎注入宫腔内或胎盘中。将胚胎放回妊娠母鼠体内，并向腹腔内注入约0.5毫升无菌生理盐水。用4-0无菌缝线缝合腹膜肌肉层和外部皮肤层。将动物置于加热垫上，并在麻醉恢复期间进行监测。将病毒在冰上解冻，然后用生理盐水填充注射器以减少注射器内的死体积，再进行装液。吸取最多0.75微升空气，以将生理盐水溶液与注射材料分隔开。准备一个加温加湿的恢复室：将一个可密封的容器内放置无菌纱布，置于设定为37°C的加热台上，并用生理盐水浸湿。在设置好微量注射泵和控制器后，用病毒填充注射器，并用70%乙醇对手术装置的泵头支架进行消毒。随后，将新生幼鼠置于低温麻醉环境中5分钟，通过轻捏尾巴或脚趾无反应来确认麻醉程度足以进行注射。将幼鼠固定于头部固定装置上。先用碘酒对头部表面进行消毒，再用乙醇擦拭，最后用酒精棉片擦干。用黑色记号笔标记λ点，然后测量从λ点到眼睛边缘的距离，并利用立体定位坐标计算从λ点到眼睛的2/5距离。接着，使用26号针头

establishing-mouse-models-for-zika-virus-induced-neurological

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

应用脑注射策略建立小鼠 Zika 病毒诱发神经系统疾病模型: 胚胎、新生儿和成人

本视频展示了脑型疟疾小鼠实验模型的建立。从感染疟原虫的按蚊中分离出的子孢子被用于感染小鼠，以模拟人类脑型疟疾的病理过程。 疟原虫伯氏疟原虫将感染的雌性蚊子注入被固定的实验小鼠尾静脉，可导致血脑屏障破坏和脑部炎症，从而引发脑型疟疾。该感染小鼠模型为研究脑型疟疾提供了重要的工具 体内...

利用宿主蚊媒来源的子孢子建立小鼠实验性脑型疟疾模型

本视频展示了在发育中的大脑中建立寨卡病毒感染体外模型的方法。利用包含干细胞、神经前体细胞（NPCs）和神经元的玫瑰花结样结构的人脑类器官，进行寨卡病毒感染。该病毒可感染神经前体细胞并诱发细胞凋亡，从而破坏类器官的正常发育。...

建立寨卡病毒感染脑类器官的体外模型

本视频展示了构建中枢神经系统感染小鼠模型的方法。通过颅内和腹腔联合注射，将病毒接种于 suckling...

建立中枢神经系统感染的小鼠模型

该视频展示了在成年小鼠脑内注射寨卡病毒悬液以诱导神经退行性变的过程。将麻醉后的小鼠固定于立体定位仪中，于暴露的颅骨上钻孔以便注射。将寨卡病毒悬液注入脑组织中。病毒感染引发炎症反应，进而导致神经退行性变。...

建立寨卡病毒感染成年小鼠神经退行性变模型

本视频展示了一种用寨卡病毒感染人类胎儿神经干细胞的操作流程。感染后的细胞可用于进一步的研究。...

寨卡病毒感染胎儿神经干细胞

本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。...

新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导

本方案描述了一种用于模拟寨卡病毒感染发育中人脑的技术。研究人员可利用野生型或经基因改造的干细胞系，通过该技术揭示可能影响寨卡病毒感染胚胎早期脑部感染及其导致小头畸形的各种机制或治疗方法。...

模拟寨卡病毒感染人类发育中大脑 体外 利用干细胞衍生的大脑类器官

本文详细介绍了在体外培养中扩增人类胎儿脑神经干细胞的方法，以及如何将这些细胞分化为多种神经元亚型和星形胶质细胞，重点阐述了利用神经干细胞研究寨卡病毒感染的应用。...

寨卡病毒感染培养的人类胎儿脑神经干细胞用于免疫细胞化学分析

本文描述了一种用于评估Zika病毒（ZIKV）感染的Ifnar1-/-小鼠模型中免疫豁免器官内抗原特异性T细胞反应的实验方案。该方法对于研究ZIKV疫苗的细胞保护机制和免疫病理发生机制至关重要，同时也可用于评估疫苗的有效性。...

评估感染寨卡病毒的Ifnar1-/-小鼠免疫豁免器官中病毒特异性T细胞应答

本文介绍了一种建立免疫健全的ICR（Institute of Cancer...

一种模拟登革病毒感染所致急性病毒性脑炎的小鼠模型

本实验方案的目的是通过从感染小鼠的多个器官中分离和定量寨卡病毒，展示研究病毒性疾病的常用技术。...

从小鼠多个器官中分离与定量寨卡病毒

学习脑内注射技术建立寨卡病毒感染小鼠模型，用于研究胚胎、新生儿及成年阶段神经系统病理机制。该方法有助于探索病毒诱导小头畸形的发病机理及潜在治疗策略。

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