线粒体衍生肽处理后用于ERK激活的亚细胞组分分离

本实验的总体目标是确定由线粒体来源肽刺激的细胞中所涉及的下游信号级联反应。该方法可以回答线粒体来源肽研究领域中的关键问题，例如涉及哪些信号通路，以及这些反应发生的位置。该技术的主要优势在于操作直接且相对易于实施。

我们最初在研究人源素介导的ERK信号通路时提出了该方法的想法，但此前获得的下游信息十分有限。Subscale Kersher方法使我们对人源素介导的信号转导作用有了更深入的认识。按照文本中的实验方案，在铺板后的第三天，将SH-SY5Y或HEK293细胞以每孔10的6次方个细胞接种，并清洗两次。

将S14G人源humanin肽溶解于0.2微米滤过的蒸馏水中，并将其重悬为1毫摩尔的储备液。在15毫升锥形管中分装预热的含血清或无血清培养基，加入室温保存的humanin肽储备液，配制为工作浓度。

立即将细胞中的培养基替换为6 mL肽溶液，并在适当时间内孵育细胞。用10 mL预冷的PBS洗涤细胞两次。

然后用 5 毫升预冷的 PBS 刮取培养皿上的细胞，并将细胞悬液转移至 15 毫升锥形离心管中。在 4°C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。

将沉淀重悬于200微升预冷的裂解缓冲液中，冰上孵育15分钟。在250 × g、4 °C条件下离心5分钟。收集上清液作为细胞质组分，沉淀用于制备核组分。

在4°C条件下，以18000 × g离心上清液10分钟，以去除细胞碎片及其他污染物。然后将上清液转移至新的微量离心管中。此为胞质溶胶组分。

将沉淀物重悬于200微升预冷的洗涤缓冲液中，在250 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，加入100微升预冷的核提取缓冲液重悬沉淀物，然后在冰上超声处理样品10次。

再次离心样品，然后将上清液转移至新的微量离心管中。为分离粗线粒体组分，使用10毫升预冷的PBS缓冲液洗涤每个10厘米培养皿中的细胞。

然后加入5毫升预冷的PBS，用细胞刮刀刮下细胞。将细胞悬液转移至一个15毫升的锥形离心管中。随后在4°C条件下以600 × g离心10分钟。

吸去 PBS，加入 1 毫升预冷的线粒体分离缓冲液重悬沉淀。然后在冰上使用聚四氟乙烯涂层的研杵，用 2 毫升匀浆器匀浆 25 次。将匀浆液转移至微量离心管中，在 4°C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟，以去除细胞核和未破碎的细胞。

然后收集上清液，转移至新的微量离心管中，在4°C条件下以7000 × g离心10分钟。弃去上清液后，用200 µL预冷的线粒体分离缓冲液重悬沉淀，并将溶液转移至新的微量离心管中。在4°C条件下以7000 × g再次离心10分钟。

重复洗涤后，用15 µL RIPA裂解液重悬沉淀，并将悬液置于冰上孵育10分钟。然后在4 °C条件下以16000 ×g离心15分钟。将上清液（即线粒体组分）转移至新离心管中。

根据文本方案进行蛋白质定量并执行Western印迹。按照本视频中演示的步骤，使用1和100微摩尔S14G人源性人in（一种高效的人in类似物）处理HEK293和SH-SY5Y细胞，并从总蛋白提取物中分析ERK12在苏氨酸202和酪氨酸204位点的总形式及其磷酸化形式。

如图所示，S14G humanin 处理可增加 ERK12 及其调控位点苏氨酸-202、酪氨酸-204 的磷酸化水平。为了明确 S14G humanin 介导 ERK12 激活的作用靶点，分析了 S14G humanin 处理后总 ERK12 和磷酸化 ERK12 的亚细胞定位。如这些 Western 印迹结果所示，在 HEK293 细胞中，磷酸化的 ERK12 在细胞质和细胞核中均有所增加，但在线粒体中未见增加。

然而，在 SH-SY5Y 细胞中，细胞质、细胞核和线粒体中的磷酸化 ERK 水平均下降。这表明 S14G 人源素介导的 ERK 磷酸化可能在不同细胞类型和不同条件下发挥不同的作用。一旦掌握，细胞核组分分离可在 1 小时内完成，线粒体组分分离可在 1 小时 30 分钟内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要始终将所有样品置于冰上。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如共免疫沉淀和质谱分析，以研究信号分子的下游靶标。