Name: 线粒体源肽治疗中 ERK 活化的亚细胞分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习利用亚细胞分离技术检测线粒体源肽刺激后ERK活化及磷酸化蛋白定位的方法。该技术适用于SH-SY5Y和HEK293细胞，为研究线粒体生物学和细胞信号传导提供可靠方案。

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本研究工作获得了SJK的艾里森/美国衰老研究基金会衰老研究项目博士后奖学金，以及PC获得的格伦基金会奖项和美国国立卫生研究院（NIH）资助（1P01AG034906，1R01GM 090311，1R01ES 020812）的支持。所有作者均出现在影片中。

1. 肽处理细胞
<ol>
	<li>接种两百万个SH-SY5Y或HEK293细胞（2 × 10⁶）6) 转入10 cm培养皿中，培养2天</li>
	<li>（可选）次日，用无血清的DMEM培养基洗涤细胞一次，若处理需在无血清培养基中进行，则加入无血清DMEM培养基过夜孵育。</li>
	<li>第3天，将S14G-humanin肽溶解于经0.2 µm滤膜过滤的蒸馏水中，重悬配制成1 mM的储存液。 
	注意：肽应溶解于适当的溶剂中，具体溶剂可根据肽的序列特性确定例如，总电荷）如果肽段为商业产品，制造商可能会提供相关信息。例如，S14G-humanin、SHLP2、SHLP6 和 MOTS-c 可溶于水。将肽段分装为适当的体积（例如，50 μL）以避免反复冻融。解冻后请勿再次使用。</li>
	<li>将预热的含血清或无血清培养基分装至50 mL锥形管中，并加入室温保存的1 mM储备液，使其达到工作浓度（例如，1 µM，10 µM。</li>
	<li>更换为6 mL步骤1.4中制备的肽溶液，孵育细胞适当时间。 
	注意：根据您激活 ERK 的实验条件选择孵育时间。</li>
</ol>
2. 细胞质与细胞核的亚细胞组分分离
<ol>
	<li>用 10 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞两次，加入 5 mL 冰冷的 PBS 刮下细胞，并将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除 PBS，将沉淀重悬于 200 µL 冰冷的裂解缓冲液中（10 mM HEPES pH = 7.6，3 mM MgCl2，10 mM KCl，5% (v/v) 甘油，1% 非离子型表面活性剂 (C13H22O(C2H4O)n)，蛋白酶/磷酸酶抑制剂）。 
	注意：为保持蛋白质的磷酸化状态，需新鲜添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂，且样品应始终置于冰上。避免反复冻融。在 -80 °C 冻存前，应将样品分装为小份（例如 50 μg）。</li>
	<li>将重悬的沉淀在冰上孵育 15 分钟，然后在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>收集上清液作为细胞质组分，保留沉淀用于获取核组分。</li>
	<li>将上清液在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片及其他污染物，然后将上清液转移至新的微量离心管中。此即为胞质溶胶组分。</li>
	<li>将沉淀重悬于 200 μL 冰冷的洗涤缓冲液中（10 mM HEPES pH = 7.6，1.5 mM MgCl2，420 mM NaCl，25% (v/v) 甘油，0.2 mM EDTA，蛋白酶/磷酸酶抑制剂），并在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 100 μL 冰冷的核提取缓冲液中（20 mM HEPES pH = 7.6，1.5 mM MgCl2，420 mM NaCl，25% (v/v) 甘油，0.2 mM EDTA，蛋白酶/磷酸酶抑制剂），并在冰上进行 10 次超声处理（每次开启 5 秒，关闭 10 秒，振幅 30%）。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的微量离心管中。此即为核组分。</li>
	<li>使用 BCA 法测定蛋白含量。</li>
</ol>
3. 粗线粒体组分
<ol>
	<li>用 10 mL 冰冷的 PBS 清洗每个 10 cm 培养皿中的细胞，加入 5 mL 冰冷的 PBS，并使用细胞刮刀将细胞刮下。 
	注意：使用三个 10 cm 培养皿的细胞可获得足够产量的线粒体，用于 Western Blotting。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，并将三个 10 cm 培养皿的细胞悬液合并至同一个 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 600 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>吸除 PBS，将沉淀重悬于 1 mL 冰冷的线粒体分离缓冲液（10 mM Tris-MOPS，1 mM EGTA/Tris，200 mM 蔗糖，调节 pH 至 7.4）中。</li>
	<li>在冰上使用带有聚四氟乙烯涂层研杵的 2 mL 匀浆器，匀浆细胞 25 次。 
	注意：此步骤对维持线粒体完整性并最大化线粒体组分得率至关重要。匀浆次数应根据不同细胞类型进行优化。开始操作前需预先冷却匀浆器。</li>
	<li>将匀浆液转移至微量离心管中，在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟，以去除细胞核和未破裂的细胞。</li>
	<li>收集上清液，转移至新的微量离心管中，在 4 °C 条件下以 7,000 × g 离心 10 分钟。 
	注意：沉淀较松散，收集上清液时应小心操作，避免扰动沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用 200 μL 冰冷的线粒体分离缓冲液重悬，并将溶液转移至新的微量离心管中。在 4 °C 条件下以 7,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>重复步骤 3.8 以洗涤沉淀。此步骤中无需将上清液转移至新的微量离心管。</li>
	<li>弃去洗涤后沉淀中的上清液，将含有线粒体的沉淀用 50 μL RIPA 缓冲液重悬。</li>
	<li>将悬液置于冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的微量离心管中。此即为线粒体组分。</li>
	<li>使用 BCA 法测定蛋白含量。</li>
</ol>
4. 磷酸化特异性蛋白的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（8-16%预制胶），并将蛋白质转移至PVDF膜4。</li>
	<li>用含5% BSA的TBST（0.1% Polysorbate 20）在室温下孵育膜30分钟，以封闭背景中的非特异性结合位点。 
	注意：检测磷酸化蛋白时，应使用BSA而非脱脂奶粉封闭。奶粉中含有大量酪蛋白（一种丰富的磷蛋白），会导致非特异性信号升高。</li>
	<li>将膜与一抗（抗磷酸化ERK1/2抗体）在4 °C下孵育过夜。</li>
	<li>次日，在室温下用TBST（0.1% Polysorbate 20）洗涤膜三次，每次5分钟。</li>
	<li>在室温下用二抗（抗兔IgG-HRP）孵育膜1小时。</li>
	<li>在室温下用TBST（0.1% Polysorbate 20）洗涤膜三次，每次5分钟。</li>
	<li>将膜与ECL溶液孵育，并在成像仪中对膜进行成像。</li>
	<li>用洗脱缓冲液在室温下洗脱膜15分钟，然后用TBST洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>使用抗总ERK1/2抗体重复步骤4.2至4.7。</li>
	<li>为检测各组分纯度，进行SDS-PAGE并使用识别各细胞区室标志物的抗体进行免疫印迹（例如，核组分用Lamin B1，胞质用GAPDH，线粒体用TOM20）。</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Pinchas Cohen 是 CohBar 公司的股东和顾问。Kelvin Yen 曾担任 CohBar 公司的顾问。

在此，我们证明了人源素肽介导的ERK1/2激活可在两种不同的细胞类型中发生，并且活化ERK1/2的亚细胞定位可能因条件不同而有所差异（例如，肽的剂量、时间点和细胞类型）。已有研究表明，人源素通过两种不同的受体传递信号22,23，这或许可以解释两种细胞系之间信号传导的差异，以及对人源素不同剂量的需求。这一现象的生理学意义尚未得到充分研究，但可能提示了一种HN在不同组织中产生依赖性反应的潜在机制。
ERK1/2 的磷酸化在 ERK1/2 信号通路中起着关键作用，且 ERK1/2 的磷酸化状态呈现动态变化。优化实验条件以确定在特定条件或刺激下 ERK1/2 磷酸化的时间点至关重要。为此，可尝试不同的刺激条件（例如，刺激剂量和培养基），并进行时间进程实验，以确定磷酸化水平达到最高的时间点。大多数研究仅关注全细胞裂解液中的 ERK1/2 磷酸化情况。然而，由于 ERK1/2 可在特定亚细胞区域与不同靶分子相互作用，并调控不同的下游级联反应，...

新兴研究表明，线粒体衍生肽（mitochondrial-derived peptides, MDPs）在细胞保护和代谢过程中发挥着重要作用1,2,3。了解在MDPs存在条件下信号转导通路的变化，有助于揭示MDPs调控多种功能的作用机制。首个被发现的MDP——humanin，已被证实可通过与其受体结合，促进细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2）的磷酸化4,5。然而，ERK1/2激活后的下游效应仍尚未被充分研究。
ERK1/2级联反应是多种细胞过程的关键介导因子，包括增殖、细胞迁移、细胞代谢、存活以及凋亡6,7,8。为了协调这些不同的细胞过程，ERK1/2的活性和亚细胞定位受到磷酸酶和支架蛋白的严格调控9,10。除了翻译后修饰外，ERK1/2的动态穿梭也调节其信号功能、活性和特异性11,12。ERK1/2主要定位于细胞质13。一组锚定蛋白和支架蛋白有助于将ERK1/2保留在细胞骨架结构上、细胞器表面或细胞质中呈弥散分布13。在受到刺激后，ERK1/2被磷酸化，并从其锚定蛋白上解离，从而促使ERK1/2转位至其他亚细胞区域，包括细胞核、线粒体、高尔基体和溶酶体14,15,16。
尽管已知人源性蛋白humanin能够激活ERK1/2信号通路，但ERK1/2的激活仅在全细胞裂解液中被观察到。如前所述，由于ERK1/2的亚细胞定位在其下游效应中起关键作用，因此有必要同时分析磷酸化ERK1/2的亚细胞定位及其总体水平，以全面理解humanin诱导的ERK1/2激活及其下游靶点的激活情况。
为了确定活化型ERK1/2的作用靶细胞器，我们进行了亚细胞组分分离，随后对磷酸化的ERK1/2进行蛋白质印迹分析。该方法易于实施，仅需使用常规的实验室设备和试剂。所分离的亚细胞组分纯度较高，使得实验结果易于解释。免疫染色法检测ERK1/2可能获得类似结果，但某些亚细胞结构较难清晰观察，需要特殊的固定和通透处理方法。ERK1/2在不同亚细胞区域中的表达水平存在差异，若仅检测全细胞裂解液，这种差异可能导致假阳性或假阴性信号。因此，利用分离的亚细胞组分进行免疫印迹分析，能够更准确地揭示ERK1/2的定位情况。
该方法的多功能性使得可以对实验方案进行修改，以研究其他刺激物的影响，包括其他MDPs或如STAT3等其他信号分子的转位。最近发现的小分子人源素样肽（SHLPs）由16S rRNA区域编码，该区域也是人源素（humanin）的编码区，SHLPs与HN具有相似但不同的特性17。例如，SHLP2和SHLP3在处理8小时后激活ERK1/2，而人源素在5分钟内即可激活ERK1/2。检测不同肽处理下ERK1/2的亚细胞定位将有助于我们更深入理解这些肽的生物学功能。越来越多的证据表明，信号分子的亚细胞定位在其下游效应中起着关键作用。例如，STAT3传统上被认为在静息细胞中主要定位于细胞质，随后在细胞因子刺激下转入细胞核以激活基因表达18。STAT3也可转位至线粒体，调控三羧酸（TCA）循环和ATP的生成19。在自噬调控方面，STAT3在不同亚细胞区域的定位以多种方式调节自噬过程20。例如，核内STAT3通过转录调控自噬相关基因，发挥自噬调节因子的作用；细胞质中的STAT3则通过与自噬信号分子相互作用，持续抑制自噬；线粒体中的STAT3通过抑制氧化应激诱导的自噬，从而抑制和阻止线粒体自噬（mitophagy）。因此，这种亚细胞组分分离方法对于理解其他信号分子以及ERK1/2的功能至关重要。

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>细胞信号传导</td><td>9102</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>磷酸化-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>细胞信号传导</td><td>4370</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>Lamin B1</td><td>细胞信号传导</td><td>12586</td><td>核标记物，稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>细胞信号传导</td><td>5174</td><td>胞质标记物，稀释比例 1:2,000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-17764</td><td>线粒体标记物，稀释比例 1:2,000</td></tr><tr><td>抗兔-HRP 偶联抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td>稀释比例 1:30,000</td></tr><tr><td>RIPA 裂解与提取缓冲液</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG 肽</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm 注射器滤器</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halt&amp;trade; 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas 光滑杵组织研磨器组件</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot 转膜模块</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 快速转膜系统</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF 转膜试剂盒</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 化学发光底物</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western blot 剥脱缓冲液</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪，型号：FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

线粒体衍生肽处理后用于erk激活的亚细胞组分分离

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

线粒体衍生肽（Mitochondrial-derived peptides, MDPs）是一类新型肽，由线粒体基因组中已知基因内的小型开放阅读框编码。MDPs 具有多种生物学效应，例如保护神经元免于凋亡、改善代谢指标以及保护细胞免受化疗损伤。Humanin 是首个被发现的 MDP，也是 MDP 家族中研究最为深入的肽。Humanin 的膜受体及下游信号通路已得到系统表征。近年来新发现的其他 MDPs，如 MOTS-c 和 SHLP1-6，其信号传导机制仍有待阐明。本文介绍一种基于细胞培养的方法，用于确定这些肽的功能。特别是，细胞分馏技术结合蛋白质印迹法（western blotting），可实现对关键信号分子激活状态和转位过程的定量分析。尽管存在其他细胞分馏方法，但本文所述方法简便且直接。这些方法可用于进一步阐明此类肽及其他治疗剂的作用机制。

采用本文所述方法，我们在完全培养基中分别用1 μM和100 μM的S14G-humanin（一种强效的humanin类似物21）处理HEK293和SH-SY5Y细胞，处理时间为指定时长（图1A和图1B）。随后，我们检测了总蛋白提取物中ERK1/2在Thr202/Tyr204位点的总形式及其磷酸化形式。结果显示，S14G-humanin处理可增加ERK1/2在其调控位点Thr202/Tyr204的磷酸化水平。ERK1/2的亚细胞定位在其信号转导功能中起重要作用，尤其影响其作用特异性。为了明确S14G-humanin介导的ERK1/2激活的作用靶点，我们分析了S14G-humanin处理后总ERK1/2及其磷酸化形式的亚细胞分布。在HEK293细胞中，磷酸化...

本方案描述了如何使用线粒体来源的肽段刺激细胞，并评估磷酸化蛋白的信号级联反应及其定位。

线粒体衍生肽处理后用于ERK激活的亚细胞组分分离

线粒体源性肽（Mitochondrial-derived peptides, MDPs）是一类由已知基因内小开放阅读框编码的新型肽类，这些基因位于……

本实验的总体目标是确定由线粒体来源肽刺激的细胞中所涉及的下游信号级联反应。该方法可以回答线粒体来源肽研究领域中的关键问题，例如涉及哪些信号通路，以及这些反应发生的位置。该技术的主要优势在于操作直接且相对易于实施。我们最初在研究人源素介导的ERK信号通路时提出了该方法的想法，但此前获得的下游信息十分有限。Subscale Kersher方法使我们对人源素介导的信号转导作用有了更深入的认识。按照文本中的实验方案，在铺板后的第三天，将SH-SY5Y或HEK293细胞以每孔10的6次方个细胞接种，并清洗两次。将S14G人源humanin肽溶解于0.2微米滤过的蒸馏水中，并将其重悬为1毫摩尔的储备液。在15毫升锥形管中分装预热的含血清或无血清培养基，加入室温保存的humanin肽储备液，配制为工作浓度。立即将细胞中的培养基替换为6 mL肽溶液，并在适当时间内孵育细胞。用10 mL预冷的PBS洗涤细胞两次。然后用 5 毫升预冷的 PBS 刮取培养皿上的细胞，并将细胞悬液转移至 15 毫升锥形离心管中。在 4°C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。将沉淀重悬于200微升预冷的裂解缓冲液中，冰上孵育15分钟。在250 × g、4 °C条件下离心5分钟。收集上清液作为细胞质组分，沉淀用于制备核组分。在4°C条件下，以18000 × g离心上清液10分钟，以去除细胞碎片及其他污染物。然后将上清液转移至新的微量离心管中。此为胞质溶胶组分。将沉淀物重悬于200微升预冷的洗涤缓冲液中，在250 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，加入100微升预冷的核提取缓冲液重悬沉淀物，然后在冰上超声处理样品10次。再次离心样品，然后将上清液转移至新的微量离心管中。为分离粗线粒体组分，使用10毫升预冷的PBS缓冲液洗涤每个10厘米培养皿中的细胞。然后加入5毫升预冷的PBS，用细胞刮刀刮下细胞。将细胞悬液转移至一个15毫升的锥形离心管中。随后在4°C条件下以600 × g离心10分钟。吸去 PBS，加入 1 毫升预冷的线粒体分离缓冲液重悬沉淀。然后在冰上使用聚四氟乙烯涂层的研杵，用 2 毫升匀浆器匀浆 25 次。将匀浆液转移至微量离心管中，在 4°C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟，以去除细胞核和未破碎的细胞。然后收集上清液，转移至新的微量离心管中，在4°C条件下以7000 × g离心10分钟。弃去上清液后，用200 µL预冷的线粒体分离缓冲液重悬沉淀，并将溶液转移至新的微量离心管中。在4°C条件下以7000 × g再次离心10分钟。重复洗涤后，用15 µL RIPA裂解液重悬沉淀，并将悬液置于冰上孵育10分钟。然后在4 °C条件下以16000 ×g离心15分钟。将上清液（即线粒体组分）转移至新离心管中。根据文本方案进行蛋白质定量并执行Western印迹。按照本视频中演示的步骤，使用1和100微摩尔S14G人源性人in（一种高效的人in类似物）处理HEK293和SH-SY5Y细胞，并从总蛋白提取物中分析ERK12在苏氨酸202和酪氨酸204位点的总形式及其磷酸化形式。如图所示，S14G humanin 处理可增加 ERK12 及其调控位点苏氨酸-202、酪氨酸-204 的磷酸化水平。为了明确 S14G humanin 介导 ERK12 激活的作用靶点，分析了 S14G humanin 处理后总 ERK12 和磷酸化 ERK12 的亚细胞定位。如这些 Western 印迹结果所示，在 HEK293 细胞中，磷酸化的 ERK12 在细胞质和细胞核中均有所增加，但在线粒体中未见增加。然而，在 SH-SY5Y 细胞中，细胞质、细胞核和线粒体中的磷酸化 ERK 水平均下降。这表明 S14G 人源素介导的 ERK 磷酸化可能在不同细胞类型和不同条件下发挥不同的作用。一旦掌握，细胞核组分分离可在 1 小时内完成，线粒体组分分离可在 1 小时 30 分钟内完成。在进行该实验操作时，重要的是要始终将所有样品置于冰上。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如共免疫沉淀和质谱分析，以研究信号分子的下游靶标。

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线粒体源肽治疗中 ERK 活化的亚细胞分离

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过表达蛋白激酶C同工酶的肾细胞中线粒体功能与细胞活力的评估

本实验步骤介绍了如何从成年小鼠脑组织中分离线粒体相关内质网膜（MAMs），以及从MAMs和线粒体组分中提取糖鞘脂富集的微结构域组分。...

线粒体相关内质网膜（MAMs）和糖鞘脂富集微区（GEMs）：从小鼠脑组织中分离

比较样品间线粒体膜电位可提供有关细胞状态的重要信息。本文详细描述了分离线粒体以及利用荧光法检测其对抑制剂和解偶联剂反应的实验步骤。通过细胞培养和细胞应激动物模型的应用，展示了该实验方案的方法学特点及其应用价值。...

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RAS病是一类由RAS-MAPK信号通路过度激活引起的多系统遗传综合征。随着大量潜在致病变异不断被发现，亟需对其进行功能验证，然而临床前证据的缺乏限制了治疗策略的开发。本文中，我们描述了一种在Teen-报告基因斑马鱼中通过活体FRET成像检测RAS病相关ERK活化水平及其在胚胎发育过程中药物调控作用的体内实验方案。...

一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

学习利用亚细胞分离技术检测线粒体源肽刺激后ERK活化及磷酸化蛋白定位的方法。该技术适用于SH-SY5Y和HEK293细胞，为研究线粒体生物学和细胞信号传导提供可靠方案。

线粒体衍生肽处理后用于ERK激活的亚细胞组分分离

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