活体细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的基本过程

这种基于显微镜的方法的总体目标是观察细菌细胞生长过程中的中心过程。这种方法使我们能够解决细菌学中的重要问题，例如在细菌细胞生长和分裂过程中如何协调基本过程。这项技术的主要优点是我们能够使用荧光试剂来观察活细胞中的细菌细胞表面和结构。

在这里，我们使用这种方法来深入了解根癌农杆菌的基本过程。然而，这个过程也可以用于其他细菌来研究它们的生长。首先，使用无菌木棒或移液器吸头接种 3 毫升 ATGN 生长培养基，其中有一个野生型或突变型 A.Tumifaciens 菌株的菌落。

在 28 摄氏度和 225 RPM 下培养培养物过夜。第二天，使用分光光度计测量 OD 600。然后，将细胞培养物稀释至约 0.2 的 OD 600 并继续将细胞生长至约 0.6 的 OD 600。

将 1 mL 指数培养物分配到三个微量离心管中。并在台式离心机中以 7， 000 x g 的离心速度沉淀细胞 5 分钟。将每个细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，然后加入 1 μL DMSO Orange 储备液或 DAPI 储备液。

通过移液轻轻混匀，并将重新悬浮的细胞在黑暗中孵育 5 分钟。以 7， 000 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀，然后将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，以去除多余的试剂。然后，再洗涤细胞两次，并将沉淀重悬于 50 μL PBS 或培养基中。

对于同步延时成像，将来自每次处理的 10 微升细胞混合在一个新的微量离心管中。要制备用于细胞成像的琼脂糖垫，请使用盖玻片作为指导，然后用手术刀在边缘周围切割 22 x 22 毫米见方的实验室胶片。从实验室胶片的中心切出一个正方形，留下大约 2 到 5 毫米的边界作为琼脂糖垫的垫圈。

然后，丢弃中间的切口。将薄膜垫圈放在载玻片上，用不含氨水和酒精的清洁剂清洁。并使用设置为 70 摄氏度的加热块或火焰加热载玻片，直到薄膜略微融化到玻璃上。

接下来，通过在小烧瓶中混合大约 0.075 克琼脂糖和 5 毫升培养基来制备琼脂糖溶液。在微波炉中加热溶液，定期旋转混合，直到琼脂糖溶解且溶液澄清。将琼脂糖溶液保持在 55-70 摄氏度，并在 48 小时内将其用于构建多个琼脂糖垫。

将温热的琼脂糖培养基移液到垫圈的中心。然后，将盖玻片放在垫圈上以均匀分布琼脂糖。将玻片放在凉爽的水平表面上凝固约两分钟。

现在，小心地将盖玻片从琼脂糖垫上滑下，然后让琼脂糖垫在室温下风干 1 到 2 分钟，直到琼脂糖垫表面干燥。琼脂糖垫的正确结构对于获得高质量图像至关重要。不要尝试在坏的垫子上成像。

如果琼脂糖垫变干、出现波纹或撕裂，最好不要偷懒，而是制作一个新的垫子。然后，使用手术刀去除一小条琼脂糖，形成一个大约 2 x 7 到 10 毫米的气穴。A.Tumefacien 细胞往往在气穴附近生长得最好。

在琼脂糖垫上点 0.8 至 1 μL 细胞。然后轻轻地将盖玻片放在琼脂糖垫的顶部，以将细胞分布在琼脂糖垫的表面上。对于长期延时成像，使用熔化的 Valap 密封盖玻片的边缘。

请务必使用 Valap 密封盖玻片的所有边缘和角落。否则，可能会导致琼脂糖垫延时成像期间漂移。要进行落射荧光显微镜检查，请将浸油放在所需的物镜上，然后将倒置的载玻片放入载物台上的载玻片支架中。

使用聚焦旋钮使单元格聚焦。使用所需的荧光滤光片采集相位或 DIC 和荧光图像。或者，通过随机选择靠近琼脂糖垫气穴的十个细胞区域来获取多个 x、y 位置。

设置时间序列采集以在所需的时间间隔进行同相或 DIC 成像。如图所示，通过离心洗涤后直接从培养物中对细胞进行成像，并在细胞与 0.1% DMSO 一起孵育后，结果表明单独的 DMSO 不会影响细胞形态。活的 A.Tumefaciens 细胞中的 Orange 和 DAPI 标记的 DNA。

在晚期分裂前细胞中，用 Orange 染色观察到两个不同的类核细胞，而 DNA 标记在 DAPI 染色下显得更弥漫。在这个延时实验中，相同比例的未标记、DAPI 标记和橙色标记的野生型 A.Tumefaciens，当用相差显微镜成像时，所有细胞都生长，表明两种染色都不会影响细胞生长。细胞也在使用 TRITC 滤光片的落射荧光显微镜下在相差下生长。

然而，当使用 DAPI 过滤器成像时，细胞在一小时内停止生长。遵循类似的方法，其他荧光试剂也可用于可视化细菌细胞壁或膜。此外，许多这些荧光染料可以组合以提供细菌细胞表面的全面图像。

活细菌中基本过程的可视化令人兴奋，因为它为研究条件突变体或非模型细菌中的这些过程提供了可能性。这使我们能够加强对不同细菌种类的研究。