Name: 活体细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的基本过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习使用荧光显微镜观察Agrobacterium tumefaciens等细菌细胞生长与分裂的基本过程。该方法利用荧光试剂实现活细胞成像，为微生物学研究提供实时可视化工具，可推广至多种细菌物种。

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我们感谢 Michael VanNieuwenhze（印第安纳大学）惠赠用于图2和图4的FDAAs。我们感谢Brown实验室成员在本文撰写过程中提供的反馈意见。Brown实验室关于A. tumefaciens细胞生长与分裂的研究由美国国家科学基金会（IOS1557806）资助。

1. A. tumefaciens 菌株的培养
<ol>
	<li>培养 A. tumefaciens 菌株
	<ol>
		<li>使用无菌的木签或移液器吸头，挑取单个目标菌株的菌落，接种于1 mL ATGN生长培养基中（培养基配方见材料列表）。 
		注意：对于 A. tumefaciens 在缺失菌株中，ATGN 培养基应含有 1 mM IPTG 作为诱导剂，以维持必需蛋白的生物合成。</li>
		<li>培养 A. tumefaciens 在ATGN中过夜培养菌株 28 °C 以225 rpm振荡培养。</li>
		<li>在 600 nm 处测定细胞的光密度（OD600) 使用分光光度计测定。将细胞培养液稀释至 OD600 = ~0.2 并继续培养至 OD600 = ~0.6 时停止。对于消耗型菌株，需在诱导剂存在下继续培养至 OD600 = ~0.6 时停止。</li>
		<li>使用野生型和突变型菌株 A. tumefaciens 在 OD600 约 0.6，用于靶标特异性染色和/或延时显微镜观察（见第 2 节和第 3.1 节）。对于诱导耗竭菌株，需洗去诱导剂（见第 1.2 节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导剂去除用于表征 A. tumefaciens 蛋白耗竭菌株
	<ol>
		<li>收集1 mL对数期培养物（OD600 在室温下，使用台式离心机以 7,000 × g 离心 5 分钟，收集菌体（OD600 ≈ 0.4–0.6）。</li>
		<li>洗涤：移除上清液，将沉淀物重悬于不含诱导剂的新鲜培养基中，按上述步骤（1.2.1）再次离心收集细胞。用新鲜培养基总共洗涤细胞3次。</li>
		<li>将最终沉淀重悬于新鲜培养基中，并将细胞浓缩至指定 OD600 = ~0.8，用于靶向特异性染料的即时染色（第2节和 图 4B- D）或延时显微镜（第3.2节和 图 4A）或者，在对细胞进行染色和成像之前，将细胞在不含诱导剂的培养基中培养所需的时间，以预先耗尽目标成分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 靶向特异性染色 A. tumefaciens 细胞
<ol>
	<li>荧光D-氨基酸细胞壁标记 
	注意：FDAAs 是一类无毒的荧光D-氨基酸，可被A. tumefaciens肽聚糖层高效整合。该简单的标记方法可用于活细胞中生长模式的检测6。四种FDAAs的合成方案已有文献报道38。
	<ol>
		<li>取500 µL对数期培养物（OD600 ≈ 0.4–0.6），在台式离心机中以7,000 × g离心5分钟，收集菌体沉淀。将菌体沉淀重悬于100 µL新鲜培养基中。</li>
		<li>向洗涤并浓缩后的菌体中加入5 µL 5 mM FDAA，在避光条件下孵育2分钟。 
		注意：应尽量避免FDAA暴露于光照。孵育时间可根据菌株生长速率进行调整。通常，孵育时间应为倍增时间的5–10%6。</li>
		<li>通过离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤菌体沉淀三次。</li>
		<li>将菌体沉淀重悬于约50 µL PBS中。 
		注意：重悬所用PBS体积可根据沉淀大小适当调整。</li>
		<li>取0.8–1 µL菌液点样至琼脂糖垫片上，立即使用落射荧光显微镜成像（见第3.1和3.2节）。
		<ol>
			<li>或者，可通过冰浴的70%乙醇固定细胞以终止标记反应。将菌体沉淀重悬于1 mL冰浴的70%乙醇中，冰上孵育15分钟。</li>
			<li>离心收集菌体，重悬于少量PBS中，以便后续成像。菌悬液可于4 °C保存，并在48小时内完成成像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用DAPI或Orange染料进行DNA染色 
	注意：为观察DNA结构，可使用DAPI或Orange染料对细胞进行标记。尽管Orange染料传统上被描述为“死细胞染料”，但其具有细胞膜通透性、光稳定性良好，且不影响细菌细胞的生长，因此适用于活细胞DNA成像10。在A. tumefaciens中，Orange染色在活细胞中效果良好，适用于延时显微成像（图3）。相比之下，DAPI染色所需的紫外光（UV）照射具有光毒性（图3），因此DAPI染色更适合用于活细胞的即时成像或固定细胞的染色。
	<ol>
		<li>细胞的DAPI染色
		<ol>
			<li>取1 mL对数期培养物（OD600 ≈ 0.4–0.6），在台式离心机中以7,000 × g离心5分钟，收集菌体沉淀。</li>
			<li>可选：染色前固定细胞，将菌体沉淀重悬于1 mL冰浴的70%乙醇中，冰上孵育10–15分钟。按2.2.1.1步骤所述离心收集细胞。</li>
			<li>将菌体沉淀重悬于含1 µL DAPI储备液（1 mg/mL；参见材料表）的1 mL PBS中。轻轻吹打混匀，避光孵育5分钟。</li>
			<li>以7,000 × g离心5分钟收集菌体，重悬于1 mL PBS中以去除过量DAPI。再洗涤两次，最终将菌体沉淀重悬于50 µL PBS或培养基中。</li>
			<li>取0.8–1 µL菌液点样至琼脂糖垫片上，立即使用落射荧光显微镜成像。见第3.1和3.2节。 
			注意：本方案不适用于观察染色体动态的延时显微成像（图3）。建议使用Orange染色作为替代方案（见第2.2.2节）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>活细胞的Orange染色</li>
		<li>取1 mL对数期培养物（OD600 ≈ 0.4–0.6），在台式离心机中以7,000 × g离心5分钟，收集菌体沉淀。将菌体沉淀重悬于含1 µL Orange储备液（见材料列表）的1 mL PBS中。轻轻吹打混匀，避光孵育5分钟。</li>
		<li>离心收集菌体，重悬于1 mL PBS中以去除过量Orange染料。再洗涤两次，最终将菌体沉淀重悬于50 µL PBS中。</li>
		<li>取0.8–1 µL菌液点样至琼脂糖垫片上，立即使用落射荧光显微镜成像。见第3.1和3.2节。 
		注意：本方案适用于活细胞，且适合用于观察染色体动态的延时显微成像（图3）。若无法立即成像，可使用冰浴的70%乙醇固定细胞（见第2.2.1.2节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜标记 
	注意：亲脂性苯乙烯类荧光染料FM 4-64已被广泛用于观察细菌细胞的膜结构。与其他多数细菌不同，FM 4-64标记的A. tumefaciens细胞并非均匀染色，而是常呈现“马蹄形”染色模式14,15。值得注意的是，新生生长极几乎无染料信号，而旧极则强烈染色。因此，FM 4-64可用于可视化A. tumefaciens的细胞生长模式及膜结构。
	<ol>
		<li>在1 mL对数期细胞培养物中加入FM 4-64至终浓度为8 µg/mL，室温避光孵育5分钟。</li>
		<li>将标记后的细胞在台式离心机中以7,000 × g离心5分钟，收集菌体沉淀，重悬于1 mL PBS中。共洗涤三次以去除过量染料。</li>
		<li>将细胞重悬于少量PBS中，点样至琼脂糖垫片上立即成像。（见第3.1和3.2节） 
		注意：必须立即成像以观察特征性染色模式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. A. tumefaciens 细胞的成像
<ol>
	<li>琼脂糖垫制备 
	注意：图1 展示了用于延时显微镜观察的典型琼脂糖垫的图像序列（图A）和示意图（图B）。琼脂糖垫通常按需制备。
	<ol>
		<li>3.1.1. 使用盖玻片作为模板，用手术刀沿其边缘在实验室用膜（见材料列表）上切割出一个 22 mm × 22 mm 的正方形。</li>
		<li>从实验室用膜中央切去一小块，留下约 2–5 mm 宽的边框，作为琼脂糖垫的垫圈。将切下的中心部分丢弃。</li>
		<li>将膜制垫圈放置于已用不含氨和酒精的清洁剂清洗过的载玻片（75 mm × 25 mm）上，并加热至膜在玻片表面轻微熔化（见图1A顶部图像）。可使用设定为 70 °C 的金属浴加热块边缘加热，或在火焰上轻微烘烤使膜熔化。</li>
		<li>在小烧瓶中将约 0.075 g 琼脂糖（见材料列表）与 5 mL 培养基混合，配制琼脂糖溶液。将溶液放入微波炉中加热，并间歇摇动，直至琼脂糖完全溶解且溶液澄清。将琼脂糖溶液保持在 55–70 °C，并在 48 小时内用于制备多个琼脂糖垫。</li>
		<li>用移液器将含 1.2–1.5% 琼脂糖的培养基加入垫圈中央。 
		注意：培养基体积通常为 50–60 µL，具体取决于垫圈大小。若将培养基加至冷的载玻片上，琼脂糖可能过快凝固，因此应将载玻片置于温热表面上。设定为 70 °C 的金属浴边缘是理想的加热位置。对于无需持续细胞生长的应用，可用纯水琼脂糖或缓冲液琼脂糖溶液（如磷酸盐缓冲液 PBS）替代含细胞培养基的琼脂糖。在成像营养缺陷型菌株时，培养基中可添加或不添加诱导剂。添加诱导剂可作为对照，而不添加诱导剂则可揭示营养缺陷表型。</li>
		<li>将盖玻片覆盖在垫圈上，以均匀分布琼脂糖。</li>
		<li>将载玻片置于凉爽、水平的表面上静置约 2 分钟，使其凝固。避免琼脂糖垫过度干燥，否则会导致表面起皱，并在滴加细胞悬液时造成液滴聚集。</li>
		<li>小心地将盖玻片从琼脂糖垫上滑离。 
		注意：请勿急于完成此步骤。琼脂糖垫容易撕裂，不平整的垫面会增加成像难度。</li>
		<li>让琼脂糖垫在室温下晾干 1–2 分钟，直至表面看起来干燥。使用手术刀切除一小条琼脂糖，形成一个气室（见图1A中间图像）；气室尺寸通常约为 2 mm × 7–10 mm，且 A. tumefaciens 细胞通常在气室附近生长状态最佳（图1C）。 
		注意：在固定细胞成像或无需监测生长的条件下，无需制作气室。</li>
		<li>在琼脂糖垫上点加 0.8–1 µL 细胞悬液，并用新的盖玻片覆盖。轻轻将盖玻片盖在琼脂糖垫上，使细胞均匀分布在垫表面。</li>
		<li>使用熔化的 VALAP 密封盖玻片边缘（配方见材料表；图1A底部图像）。若未完全密封盖玻片的所有边缘和角落，会导致琼脂糖垫干燥，从而在成像过程中引起细胞漂移。注意：仅在进行长期延时成像时才需要密封盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="琼脂糖垫装置示意图，农杆菌生长分析；显微镜观察，实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：琼脂糖垫的制备。 （A）琼脂糖垫制备流程的图像序列。图像1为带有实验室封膜垫片的载玻片。在图像2中，可观察到琼脂糖垫及气腔。最后，图像3显示了在盖玻片下完成的琼脂糖垫结构，并用VALAP密封。（B）提供了用于延时显微镜观察的琼脂糖垫示意图。示意图中标注了琼脂糖垫的关键结构特征。（C）气腔促进了农杆菌（A. tumefaciens）在琼脂糖垫上的生长。图中显示了野生型农杆菌（A. tumefaciens）在琼脂糖垫上培养20小时后的图像。图像拍摄位置距离气腔由近及远。每幅图像上方标注了图像最近边缘至气腔的距离。比例尺 = 10 µm。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>成像 
	注意：微分干涉差（DIC）、相差和落射荧光成像使用配备硬件自动对焦系统、自动载物台、标准滤光片、LED 光源、60倍油浸物镜（1.4 数值孔径，NA）用于相差或微分干涉差（DIC）成像，以及1K电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机的倒置显微镜进行。显微镜应置于温度可控的房间内。或者，也可使用载物台加热器或培养室以在成像过程中维持恒定温度。
	<ol>
		<li>落射荧光显微镜 
		注意：对活细胞进行荧光成像时，需限制图像采集次数并优化曝光时间，以最小化光漂白和光毒性。对于每种染料的成像，建议确定一个最佳曝光时间，既能提供足够的荧光信号，又不会导致光漂白或光毒性。在图2-4中，所有荧光图像均采用200 ms的曝光时间。对于图3所示的时间序列，图像每10分钟采集一次，持续3小时。
		<ol>
			<li>在所需物镜上滴加浸油，并将倒置玻片放入载物台的玻片夹中。使用调焦旋钮将细胞调至清晰对焦。</li>
			<li>采集相差（或DIC）图像以及所需荧光滤光片下的图像。 
			注意：图2、图3和图4中所用染料的最大激发和发射波长如下：HADA（405/460）、NADA（450/555）、TADA（555/570）、4-64（515/640）、DAPI（360/460）、Orange（547/570）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>延时显微镜成像 
		注意：在延时显微镜成像过程中，x、y和z位置、快门及荧光滤光片均由计算机控制。采用基于硬件的自动对焦系统是维持延时成像过程中焦点稳定性的最佳选择。或者，也可使用基于软件的自动对焦循环。
		<ol>
			<li>在所需物镜上滴加浸油，并将倒置玻片放入载物台的玻片夹中。使用调焦旋钮将细胞调至清晰对焦。</li>
			<li>可选：采集多个（x, y）位置。随机选取靠近琼脂糖垫气泡区域的10个细胞视野。</li>
			<li>设置时间序列采集程序，以所需时间间隔进行相差或DIC成像。 
			注意：对于图4所示的延时序列，采用30 ms曝光时间，每10分钟采集一次DIC图像，持续14小时。在延时显微镜成像中使用荧光成像时，应调整采集间隔和曝光时间，以最小化光漂白和光毒性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Daniel, R. A., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+morphogenesis+in+bacteria%3A+two+distinct+ways+to+make+a+rod-shaped+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell.</a> Cell. 113 (6), 767-776 (2003).</li>
<li>Tiyanont, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+peptidoglycan+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis+with+fluorescent+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).</li>
<li>Turner, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+architecture+can+specify+division+planes+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus.</a> Nat Commun. 1, 26(2010).</li>
<li>Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+cell+wall+dynamics+and+peptidoglycan+architecture+in+ovococcal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria.</a> Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).</li>
<li>Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+elongation+mode+in+Gram-negative+bacteria+is+determined+by+peptidoglycan+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture.</a> Nat Commun. 4, 1496(2013).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+probing+of+newly+synthesized+peptidoglycan+in+live+bacteria+with+fluorescent+D-amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).</li>
<li>Siegrist, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28D%29-Amino+acid+chemical+reporters+reveal+peptidoglycan+dynamics+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">(D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen.</a> ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).</li>
<li>Kepner, R. L., Pratt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorochromes+for+direct+enumeration+of+total+bacteria+in+environmental+samples%3A+past+and+present%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present.</a> Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案包含一系列用于研究根癌农杆菌（A. tumefaciens）野生型、突变株及缺陷株的实验步骤。值得注意的是，方案部分所列的所有步骤均可通过适当调整培养基、温度和生长速率等条件， readily 适用于其他细菌菌株。
使用靶向特异性染料是详细表征细菌细胞中细胞周期事件的有力工具。本文中，利用荧光标记的D-氨基酸观察肽聚糖的插入模式，使用4-64可视化脂质结构域，并用DAPI或Orange对拟核进行标记。每种实验方案均可通过优化洗涤步骤并确保DMSO处理不影响细菌生长或形态，进而适用于其他细菌。关键注意事项包括选择合适的洗涤缓冲液、标记物孵育时间，以及选择适当的荧光团以避免自发荧光或实现多重标记研究。例如，脂溶性红色荧光膜染料（4-64）的替代品为绿色荧光膜染料（1-43）。类似地，已有蓝色、绿色和红色荧光D-氨基酸可供使用6,38，且带有生物正交反应基团的D-氨基酸可通过点击化学与常用荧光团偶联6...

细菌细胞周期的进程需要协调多种过程，包括膜和细胞壁的生物合成、DNA复制与分离以及细胞分裂。要充分理解细菌细胞生物学的复杂性，必须研究这些基本事件；然而，由于这些通路中的关键组分在发生突变时会损害细胞活力，因此这一研究任务具有相当难度。利用表位荧光显微镜结合靶标特异性染料，是研究野生型和突变型细菌菌株中这些基本生命过程的一种强有力的方法。
特异性结合肽聚糖的染料包括荧光抗生素（如万古霉素-FL、博西林-FL）和荧光-D-氨基酸（例如，7-羟基香豆素-3-羧酸-3-氨基-D-丙氨酸，HADA；4-氯-7-硝基苯并呋咱-3-氨基-D-丙氨酸，NADA；四甲基罗丹明-3-氨基-D-丙氨酸，TADA）。在革兰氏阳性菌中，使用亚致死浓度的荧光抗生素类似物来探测肽聚糖生物合成位点，已被证明是揭示肽聚糖插入模式的有效策略1,2,3,4。尽管荧光万古霉素标记已被用于研究固定后的革兰氏阴性菌中的肽聚糖插入模式5，但由于外膜通常构成通透性屏障，荧光抗生素一般无法用于活细胞中肽聚糖生物合成的检测。相比之下，短时间脉冲标记荧光-D-氨基酸或带有生物正交功能基团的D-氨基酸，可在多种活细菌细胞中共价标记近期发生肽聚糖插入的区域6,7。利用合成D-氨基酸观察到的肽聚糖插入模式包括点状和隔膜型（Escherichia coli 和 Bacillus subtilis）、极性与隔膜型（Agrobacterium tumefaciens 和 Listeria monocytogenes）、仅隔膜型（Staphylococcus aureus）以及顶端型（Streptomyces venezuelae）6,7。这些结果表明，细菌在细胞壁生物发生过程中表现出多样的模式，而使用合成D-氨基酸作为探针来研究生长模式是一种在多种细菌中均具有价值的策略。
用于标记细菌染色体的染料包括特异性结合DNA小沟的脱氧核糖核酸（DNA）染料（4,6-二脒基-2-苯基吲哚；DAPI）以及高亲和力的氰基染料（Green和Orange；参见材料列表）。对固定细胞进行DAPI染色有助于对环境样品中的细菌进行计数8，而对活细胞进行DAPI染色则可用于指示细菌的活性9。相比之下，氰基染料如Orange和Green通常被描述为膜不通透的&#34;死细胞&#34;染料，用于计数非活性细胞9。然而，当这些试剂被用于研究细菌细胞生长过程中拟核形态时，研究发现DAPI、Orange和Green均具有膜通透性，能够标记活细胞10。在活的E. coli细胞中，由于细胞质的自发荧光以及DAPI染色细胞反复暴露于紫外光（UV）下会干扰拟核结构，DAPI对DNA的染色呈现弥散状10。使用Orange对E. coli或B. subtilis进行染色表明，该染料具有膜通透性，且在与活细胞DNA结合后可产生持久荧光，同时不影响细胞生长、DNA复制或染色体分离10。这些结果表明，氰基DNA染料可用于监测多种细菌在细胞生长过程中拟核形态的变化。
磷脂特异性斯蒂尔染料，例如N-(3-三乙基铵丙基)-4-(6-(4-(二乙氨基)苯基)六烯基)吡啶二溴化物（4-64；参见材料列表），是一类阳离子化合物，优先与带负电荷的磷脂（如心磷脂和磷脂酰甘油）结合11。当使用4-64标记不同细菌的膜时，可观察到不同的分布模式。在Escherichia coli中，4-64富集于细胞极区、沿侧壁的条带以及晚期分裂前细胞的分裂位点12。在Bacillus subtilis中，4-64标记可显示出脂质螺旋结构13。在Agrobacterium tumefaciens中，4-64标记外膜，并呈现特征性的&#34;马蹄形&#34;模式，其中生长极无染料标记14,15。这些观察结果表明，由于存在脂质结构域，这些细菌表现出不均一的脂质分布，从而促成细胞的不对称性。4-64标记模式的变化（例如弥散性标记、出芽、囊泡、内陷或膜收缩）对于表征影响脂质分布或生物合成的突变体具有重要提示意义。
除了对细胞进行染色外，确定参与基本生命过程的蛋白质功能也十分必要。由于无法通过删除必需基因来研究其表型后果，因此对必需蛋白的表征在技术上具有挑战性。为此，研究人员发展出多种可耗竭目标蛋白的替代方法。例如，可将必需基因置于可诱导启动子的控制之下，而非其天然启动子。可诱导启动子可响应某些小分子，如锌16、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）17,18,19,20,21、阿拉伯糖22、香草酸17,23和木糖23。当去除诱导剂时，目标基因的转录停止，从而使目标蛋白被耗竭。其他耗竭必需蛋白的方法还包括合成型核糖开关24（利用小分子与RNA的相互作用阻碍目标基因的转录）、CRISPR干扰技术25,26（阻断目标基因的转录）以及可诱导的蛋白降解系统27,28（利用肽标签将目标蛋白导向ClpXP蛋白酶进行降解）。然而，蛋白耗竭菌株在细胞失去活力前仅能提供较短的时间窗口用于表征，因此，在蛋白耗竭过程中对细胞进行时间序列的显微成像，是一种强有力的表征手段。事实上，对活体细菌细胞的显微观察已帮助研究人员深入理解了多种基本生物学过程，包括细胞形态维持、分泌机制以及区室化结构的形成机制29。
A. tumefaciens 是一种细菌性植物病原菌30，也是一种天然的遗传工程载体31,32。因此，与致病性相关的机制，包括宿主-病原体相互作用33,34,35、分泌系统36以及宿主转化过程30,31,37，已被广泛研究。为了设计出能够预防A. tumefaciens介导的病害或增强植物转化效率的策略，需要更深入地理解A. tumefaciens存活所必需的生物学过程。利用靶标特异性染料以及近年来建立的A. tumefaciens蛋白耗竭策略18，为研究这些必需过程提供了有效手段。
本文提供了对根癌农杆菌（A. tumefaciens）野生型、突变株及蛋白耗竭菌株进行显微分析的详细实验方案。前两个方案描述了如何制备细胞并使用靶标特异性染料进行标记。第三个方案逐步说明了琼脂糖垫的制备方法（图1）以及细菌细胞的成像过程（图2、图3、图4）。这些方案经过适当调整后，也可能适用于其他细菌，调整内容可包括不同的培养基条件、生长速率、氧气需求以及细胞结构等。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. J Bacteriol 123:255-264.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58&amp;Delta;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-&lt;em&gt;ctrA &amp;Delta;ctrA&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depletion of the essential master regulator CtrA in the phytopathogen &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. 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活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

DNA复制与分离、蛋白质合成、细胞壁生物合成以及细胞分裂等核心细胞过程依赖于对细菌存活至关重要的蛋白质功能。一系列靶向特异性染料可作为探针，用于深入理解这些过程。利用亲脂性染料染色可观察膜结构、可视化脂质微区以及检测膜泡形成。使用荧光标记的D-氨基酸（FDAAs）可标记肽聚糖生物合成位点，从而揭示细胞壁生物发生或细胞生长模式中的潜在缺陷。最后，核酸染料可指示DNA复制或染色体分离过程中可能存在的异常。氰基类DNA染料可标记活细胞，适用于延时显微镜观察，能够在细胞生长过程中实时监测拟核形态的变化。细胞标记方案可用于蛋白质耗竭突变体，以鉴定膜结构、细胞壁生物合成或染色体分离方面的缺陷。此外，延时显微镜可用于监测随着必需蛋白质的去除所引发的形态学变化，从而进一步揭示蛋白质功能。例如，耗竭必需的细胞分裂蛋白会导致细胞丝状化或分支化，而耗竭细胞生长相关蛋白则可能导致细胞变短或更趋圆形。本文提供了针对植物病原细菌Agrobacterium tumefaciens的细胞生长、靶向特异性标记及延时显微镜观察的实验方案。结合靶向特异性染料与延时显微镜技术，可实现对A. tumefaciens中必需生命过程的系统表征。最后，所提供的实验方案可便捷地调整应用于其他细菌中必需生命过程的研究。

对野生型 A. tumefaciens 细胞的靶向特异性标记 
为说明细胞形态不受洗涤步骤或1% DMSO处理（用于稀释荧光染料）的影响，实验中直接从培养物中取样成像（图2A，最左图），或在按照1.2步骤通过离心洗涤细胞后成像（图2A，左图），或在用1% DMSO孵育细胞10分钟后洗涤并成像（图2A，右图）。这些图像表明，洗涤或DMSO的存在不会影响细胞形态。此外，根据生长曲线分析，细胞生长也不受洗涤或DMSO处理的影响（数据未显示）。此外，用冰乙醇固定 A. tumefaciens 不会引起明显的形态学变化（图2A，最右图）。
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了解细菌中必需过程的功能具有挑战性。利用靶向特异性染料进行荧光显微镜观察，可为微生物细胞生长和细胞周期进程提供关键见解。本文以Agrobacterium tumefaciens作为模式细菌，重点介绍用于活细胞成像以表征必需过程的方法。

核心细胞过程，如DNA复制与分离、蛋白质合成、细胞壁生物合成以及细胞分裂，依赖于……的功能。

本显微镜技术的总体目标是观察细菌细胞生长过程中的核心过程。该方法使我们能够探究细菌学中的重要问题，例如细菌细胞生长与分裂过程中关键生命活动是如何协调进行的。该技术的主要优势在于，我们能够利用荧光试剂在活细胞中直接观察细菌细胞表面及其内部结构。此处，我们采用该方法来深入探究根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中的关键生物学过程。然而，该方法也可推广至其他细菌，用于研究其生长特性。实验开始时，使用无菌的木签或移液器吸头，从根癌农杆菌（A. tumefaciens）的野生型或突变株中挑取单菌落，接种至 3 毫升 ATGN 生长培养基中。在28摄氏度、225转/分钟条件下过夜培养。次日，使用分光光度计测定OD600。随后将细胞培养液稀释至OD600约为0.2，并继续培养细胞至OD600达到0.6。将一毫升对数期培养物分装到三个微量离心管中，在台式离心机中以 7,000 × g 离心五分钟，沉淀细胞。用一毫升 PBS 重悬每个细胞沉淀，然后分别加入一微升 DMSO Orange 储存液或 DAPI 储存液。用移液器轻轻混匀，将重悬的细胞在避光条件下孵育5分钟。在7,000 × g离心5分钟，使细胞成团，然后将沉淀重悬于1毫升PBS中以去除过量试剂。随后再洗涤细胞两次，最后将沉淀重悬于50微升PBS或培养基中。为了进行同步延时成像，将每种处理组的十微升细胞混合至新的微量离心管中。为制备用于细胞成像的琼脂糖垫，使用盖玻片作为参照，用手术刀沿其边缘切割出一块22毫米×22毫米的实验室用膜。在实验室用膜的中央切去一个方形区域，保留约2至5毫米的边缘，作为琼脂糖垫的垫圈。然后，弃去中间的切下部分。将薄膜垫圈放置在已用不含氨和酒精的清洁剂清洗过的载玻片上，并使用设定为 70 摄氏度的加热块或火焰加热载玻片，直至薄膜略微熔化并粘附在玻璃上。接下来，通过将约 0.075 克琼脂糖与 5 毫升培养基混合于一个小烧瓶中来制备琼脂糖溶液。将溶液放入微波炉中加热，并定期摇动以混匀，直至琼脂糖完全溶解且溶液变得澄清。将琼脂糖溶液保持在 55–70 摄氏度，并在 48 小时内用于制备多个琼脂糖垫。将温热的琼脂糖培养基滴加到垫圈中央，然后在垫圈上放置盖玻片，以均匀分布琼脂糖。将载玻片置于凉爽且水平的表面上，静置约两分钟使其凝固。现在，小心地将盖玻片从琼脂糖垫上移开，然后在室温下让琼脂糖垫自然干燥一到两分钟，直至垫片表面看起来干燥。正确制备琼脂糖垫对于获得高质量图像至关重要。切勿在质量不佳的垫片上进行成像。如果琼脂糖垫干燥、起皱或撕裂，最好不要再偷懒，而应重新制作一个新的垫片。然后，使用解剖刀切去一小条琼脂糖，以形成一个大小约为2×7至10毫米的气室。根癌农杆菌（A. tumefaciens）细胞通常在气室附近生长最佳。在琼脂糖垫上点样 0.8 至 1 微升的细胞。然后轻轻将盖玻片覆盖在琼脂糖垫上，使细胞均匀分布在垫的表面。对于长期延时成像，使用融化的 Valap 封闭盖玻片的边缘。务必使用瓦氏封片剂（Valap）密封盖玻片的所有边缘和角落。若未做到这一点，可能导致在琼脂糖凝胶垫时间序列成像过程中出现样本漂移。进行落射荧光显微镜观察时，将浸油涂抹于所需物镜上，并将倒置的载玻片放入显微镜载物台的玻片夹中。使用调焦旋钮将细胞调至清晰对焦。根据需要选择荧光滤光片，采集相差或微分干涉差（DIC）及荧光图像。可选地，通过在琼脂糖垫气泡附近随机选取十个相邻的细胞视野，采集多个x、y位置的图像。设置时间序列采集程序，以在设定的时间间隔内成像同相位图像或微分干涉差（DIC）图像。如图所示，细胞在经离心洗涤并用0.1% DMSO孵育后直接从培养物中成像，结果显示单独使用DMSO对细胞形态无影响。在活体A. tumefaciens细胞中，橙色和DAPI均标记了DNA。在即将分裂的细胞晚期，使用橙色染色可观察到两个不同的类核仁结构，而使用DAPI染色时DNA标记则呈现更弥散的分布。在此项时间推移实验中，等比例的未标记、DAPI标记和橙色标记的野生型A.Tumefaciens细胞在相差显微镜下均能正常生长，表明两种染料均未影响细胞生长。在使用TRITC滤光片的落射荧光显微镜下，细胞在相差模式下同样能够正常生长。然而，使用 DAPI 滤光片成像时，细胞在 1 小时内停止生长。采用类似方法，也可使用其他荧光试剂来观察细菌的细胞壁或膜结构。此外，许多此类荧光染料可联合使用，以获得细菌细胞表面的全面图像。对活体细菌中的关键过程进行可视化是令人兴奋的，因为它为我们研究条件突变体或非模式细菌中的这些过程提供了可能。这使我们能够加强对多种细菌物种的研究。

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