活体细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的基本过程
November 24th, 2017
了解细菌中基本过程的功能是很有挑战性的。荧光显微镜与靶向特定染料可以提供关键的洞察力的微生物细胞生长和细胞周期进展。在这里,农杆菌介导被用作一种模型细菌, 用来强调活细胞成像的方法, 用于描述基本过程。
这种基于显微镜的方法的总体目标是观察细菌细胞生长过程中的中心过程。这种方法使我们能够解决细菌学中的重要问题，例如在细菌细胞生长和分裂过程中如何协调基本过程。这项技术的主要优点是我们能够使用荧光试剂来观察活细胞中的细菌细胞表面和结构。
在这里，我们使用这种方法来深入了解根癌农杆菌的基本过程。然而，这个过程也可以用于其他细菌来研究它们的生长。首先，使用无菌木棒或移液器吸头接种 3 毫升 ATGN 生长培养基，其中有一个野生型或突变型 A.Tumifaciens 菌株的菌落。
在 28 摄氏度和 225 RPM 下培养培养物过夜。第二天，使用分光光度计测量 OD 600。然后，将细胞培养物稀释至约 0.2 的 OD 600 并继续将细胞生长至约 0.6 的 OD 600。
将 1 mL 指数培养物分配到三个微量离心管中。并在台式离心机中以 7， 000 x g 的离心速度沉淀细胞 5 分钟。将每个细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，然后加入 1 μL DMSO Orange 储备液或 DAPI 储备液。
通过移液轻轻混匀，并将重新悬浮的细胞在黑暗中孵育 5 分钟。以 7， 000 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀，然后将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，以去除多余的试剂。然后，再洗涤细胞两次，并将沉淀重悬于 50 μL PBS 或培养基中。
对于同步延时成像，将来自每次处理的 10 微升细胞混合在一个新的微量离心管中。要制备用于细胞成像的琼脂糖垫，请使用盖玻片作为指导，然后用手术刀在边缘周围切割 22 x 22 毫米见方的实验室胶片。从实验室胶片的中心切出一个正方形，留下大约 2 到 5 毫米的边界作为琼脂糖垫的垫圈。
然后，丢弃中间的切口。将薄膜垫圈放在载玻片上，用不含氨水和酒精的清洁剂清洁。并使用设置为 70 摄氏度的加热块或火焰加热载玻片，直到薄膜略微融化到玻璃上。
接下来，通过在小烧瓶中混合大约 0.075 克琼脂糖和 5 毫升培养基来制备琼脂糖溶液。在微波炉中加热溶液，定期旋转混合，直到琼脂糖溶解且溶液澄清。将琼脂糖溶液保持在 55-70 摄氏度，并在 48 小时内将其用于构建多个琼脂糖垫。
将温热的琼脂糖培养基移液到垫圈的中心。然后，将盖玻片放在垫圈上以均匀分布琼脂糖。将玻片放在凉爽的水平表面上凝固约两分钟。
现在，小心地将盖玻片从琼脂糖垫上滑下，然后让琼脂糖垫在室温下风干 1 到 2 分钟，直到琼脂糖垫表面干燥。琼脂糖垫的正确结构对于获得高质量图像至关重要。不要尝试在坏的垫子上成像。
如果琼脂糖垫变干、出现波纹或撕裂，最好不要偷懒，而是制作一个新的垫子。然后，使用手术刀去除一小条琼脂糖，形成一个大约 2 x 7 到 10 毫米的气穴。A.Tumefacien 细胞往往在气穴附近生长得最好。
在琼脂糖垫上点 0.8 至 1 μL 细胞。然后轻轻地将盖玻片放在琼脂糖垫的顶部，以将细胞分布在琼脂糖垫的表面上。对于长期延时成像，使用熔化的 Valap 密封盖玻片的边缘。
请务必使用 Valap 密封盖玻片的所有边缘和角落。否则，可能会导致琼脂糖垫延时成像期间漂移。要进行落射荧光显微镜检查，请将浸油放在所需的物镜上，然后将倒置的载玻片放入载物台上的载玻片支架中。
使用聚焦旋钮使单元格聚焦。使用所需的荧光滤光片采集相位或 DIC 和荧光图像。或者，通过随机选择靠近琼脂糖垫气穴的十个细胞区域来获取多个 x、y 位置。
设置时间序列采集以在所需的时间间隔进行同相或 DIC 成像。如图所示，通过离心洗涤后直接从培养物中对细胞进行成像，并在细胞与 0.1% DMSO 一起孵育后，结果表明单独的 DMSO 不会影响细胞形态。活的 A.Tumefaciens 细胞中的 Orange 和 DAPI 标记的 DNA。
在晚期分裂前细胞中，用 Orange 染色观察到两个不同的类核细胞，而 DNA 标记在 DAPI 染色下显得更弥漫。在这个延时实验中，相同比例的未标记、DAPI 标记和橙色标记的野生型 A.Tumefaciens，当用相差显微镜成像时，所有细胞都生长，表明两种染色都不会影响细胞生长。细胞也在使用 TRITC 滤光片的落射荧光显微镜下在相差下生长。
然而，当使用 DAPI 过滤器成像时，细胞在一小时内停止生长。遵循类似的方法，其他荧光试剂也可用于可视化细菌细胞壁或膜。此外，许多这些荧光染料可以组合以提供细菌细胞表面的全面图像。
活细菌中基本过程的可视化令人兴奋，因为它为研究条件突变体或非模型细菌中的这些过程提供了可能性。这使我们能够加强对不同细菌种类的研究。
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概述
本文讨论了一种基于显微镜的方法来观察细菌细胞生长过程中的重要过程，特别是使用农杆菌作为模型生物。该方法能够在活细胞中可视化细菌细胞表面和结构，为细胞生长和分裂提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
背景
- 理解细菌过程对于微生物学至关重要。
- 荧光染料可以增强活细菌细胞的观察。
- 农杆菌是研究细菌生长的模型。
- 该技术可以适用于各种细菌物种。
研究目的
- 观察并表征细菌细胞生长中的重要过程。
- 解决细菌分裂过程中的协调问题。
- 展示荧光显微镜在活细胞成像中的应用。
使用的方法
- 用细菌菌株接种ATGN培养基。
- 使用荧光试剂进行可视化。
- 活细胞成像技术。
- 观察细菌生长和分裂过程。
主要结果
- 成功可视化细菌细胞表面和结构。
- 获得生长过程中重要过程协调的见解。
- 证明该方法适用于其他细菌物种。
- 加深对农杆菌生物学的理解。
结论
- 基于显微镜的方法对于研究细菌生长是有效的。
- 荧光成像为微生物过程提供了宝贵的见解。
- 该方法可以广泛应用于各种细菌的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Live cell fluorescence microscopy enables direct visualization of essential microbial processes, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. By revealing real-time effects of protein depletion or chemical perturbation on cell growth, division, and morphology, this approach enhances predictive confidence for antibacterial target selection. The method's adaptability across bacterial species positions it as a reusable platform for portfolio-wide functional interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein function and essentiality in live bacteria.
- Supports identification of phenotypic consequences from genetic or chemical perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular targets to cellular outcomes.
- Improves predictive confidence for advancing antibacterial targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated live-cell systems for quantitative imaging-based assays.
- Enables standardization of phenotypic readouts for compound or genetic screens.
- Supports reproducible detection of cell wall, membrane, and nucleoid defects.
- Allows multiplexed dye usage for comprehensive cellular profiling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic outputs with disease-relevant bacterial processes.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of antibacterial mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing off-target or pleiotropic effects.
- Facilitates adaptation to diverse bacterial pathogens for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This microscopy-based workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical model development for antibacterial R&D.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing essential process disruption in real time.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible phenotypic outputs for assay development.
- Analytics: Enables measurement of morphological and structural changes linked to target perturbation.
- Translational Research: Provides a platform for aligning in vitro findings with in vivo bacterial behavior.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocols allow broad application across bacterial species and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antibacterial discovery.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibacterial targets and mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and bacterial genetics.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and quantitative analysis tools.
- Demands cross-team standardization of staining and imaging protocols.
- Protocols must be adapted for different bacterial species or mutant backgrounds.
- Phototoxicity and dye compatibility must be evaluated for each experimental setup.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Culturing, Growth, and Target-specific Staining of A. tumefaciens Strains
2:21
Imaging of A. tumefaciens Cells
4:54
Epifluorescence and Time-lapse Microscopy
5:41
Results: Cells Growth of Live Labeled Microbial Cells Imaged with Fluorescence Microscopy
6:47
Conclusion
