斑马鱼幼虫显微注射和成像的微装置
December 8th, 2017
斑马鱼胚胎和幼虫的显微注射是许多斑马鱼模型中的关键但具有挑战性的技术。在这里, 我们提出了一系列的微型工具, 以帮助稳定和定位斑马鱼的显微注射和成像。
该方法的总体目标是使 zerbrafish 幼虫的显微注射更容易、更准确。该方法可帮助研究人员使用斑马鱼模型系统在大型阵列中将斑马鱼幼虫固定在特定方向。该技术可以更轻松地进入特定组织进行显微注射和成像，并且在感染或异种移植癌症模型等应用需要大量幼虫时非常有效。
我在斑马鱼模型中的制造策略是高度互补的。一个是人造的和简单的。另一个是活生生的和复杂的。
两者具有相同的尺码比例。它们都是透明的。两者都支持以单单元分辨率进行观察。
正如您在这里展示的那样，它们可以很容易地组合在一起，并且它们几乎可以应用于任何主要疾病的研究。在覆盖有 E-3 薄膜的培养皿中制备 PDMS 块后，根据文本方案，使用转移移液管将所需数量的胚胎转移到 PDMS 块的表面上。使用发环或类似工具，将胚胎推入微结构草皮中，特别是对于背侧和腹侧方向。
将幼虫装入草皮中时，重要的是要有足够的水覆盖 PDMS 块以便于作。将它们推入草皮中也很重要，这样它们在注射过程中就会保持在原位。为了将斑马鱼定位在先前根据文本协议准备的微结构通道上，请使用移液管从图案化的 PDMS 块中吸出 E-3。
E-3 的水平应降至块状边缘以下，但仍存在于储层和通道中，并且 PDMS 上仍有一层薄层。使用移液管，将 10 个麻醉的胚胎转移到储液器中，注意不要溢出边缘。使用毛环，将每个胚胎纵到漏斗头中，首先在适当通道的入口处，确保胚胎在进入通道时具有适当的方向。
然后，使用毛环将每个胚胎沿着通道滑动，直到它到达通道壁中将其固定到位的定向微特征。在制备显微注射针和显微注射溶液后，使用细锥形移液器吸头将 5 微升溶液装入针中。将针头安装到安装在磁力架上的显微作器中，并将其连接到 PICO 泵显微注射器。
然后，用镊子捏住锥形尖端，将针尖以 45 度角折断。通过调整 PICO 泵控制器上的注射时间，将注射推注量调整为 1 纳升。在显微作控制器上调整显微注射针的角度，从 45 度开始，针头平行于胚胎的长度。
可以使用更陡的角度来最大限度地减少显微注射过程中胚胎的横向移动。用左手控制培养皿，用右手控制所需的显微作器，使针头尽可能靠近预期的显微注射部位，例如耳囊。使用显微作控制器，将针头插入目标组织，并使用 PICO 泵脚踏开关注入预设的体积。
如果组织抵抗渗透，请轻轻敲击显微作控制器旋钮。要释放胚胎，请使用移液管使 E-3 从上到过表面，或通过旋转培养皿，使胚胎释放到周围的 E-3 中。将胚胎转移到不含 MS-222 的 E-3 恢复皿中。
要使用 PDMS 设备在六孔板的孔中筛选胚胎，请使用 1， 000 微升移液管或窄头移液管通过端口 E-3 来灌注设备。使用 E-3 和 MS-222 填充孔，直到设备被覆盖。然后，使用移液管将四个先前注射的胚胎输送到每个孔中。
使用发环或类似工具，将胚胎以所需的方向定位在成像通道的入口处，然后将它们部分推入设备中。这将有助于将它们均匀地吸引到设备中。使用 1， 000 微升移液管或移液管，从端口通过设备抽取 E-3，直到胚胎以正确的方向吸入通道以进行成像。
将孔板转移到倒置荧光显微镜中。要对胚胎进行成像，请通过选择合适的镜头来调整放大倍率，例如用于对斑马鱼 neturaohil 迁移进行成像的 10 倍镜头。调整每个通道的光源强度和曝光时间，使每个信号清晰，但不饱和。
最后，捕获每个荧光通道和透射通道的图像。使用微结构通道装置在外侧方向稳定胚胎，测试了中性粒细胞对显微注射到耳囊中的标准趋化剂 fMLP 和 LTB4 的反应能力，测试了斑马鱼胚胎受精后两天的反应能力。为了可视化中性粒细胞募集，用高分子量罗丹明葡聚糖追踪注射，并在具有绿色荧光中性粒细胞的转基因胚胎中进行注射。
未注射的胚胎和单独注射罗丹明的胚胎用作阴性对照。显微注射后，将胚胎转移到成像通道装置中，并在注射后 30 分钟和 5 小时使用 EVOS 荧光显微镜成像。正如预期的那样，在早期时间点将少量荧光中性粒细胞募集到模拟注射的耳囊中，这可能是由于受损的介导募集。
有趣的是，在实验过程中观察到罗丹明葡聚糖示踪剂在耳石中积累。对于这两种趋化剂，中性粒细胞的募集数量更高，特别是对 LTB4 的反应。一旦掌握，这项技术可以大大提高斑马鱼显微注射的速度和准确性。
这项技术的开发是由我们实验室的具体挑战推动的。我们改进了这种方法，以适应我们在斑马鱼模型中的真菌感染和肿瘤异种移植物项目的需求。观看此视频后，您应该对如何使用微结构表面阵列进行斑马鱼显微注射和扩展实时成像有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种针对斑马鱼幼虫的微注射方法，旨在提高该过程的便利性和准确性。该技术使研究人员能够以特定的方向固定斑马鱼幼虫，从而便于进入目标组织进行微注射和成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 遗传学
背景
- 微注射是斑马鱼研究中的关键技术。
- 在稳定和定向斑马鱼幼虫方面存在挑战。
- 需要有效的方法用于大规模应用。
- 研究通常涉及感染或癌症模型。
研究目的
- 简化斑马鱼幼虫的微注射过程。
- 提高注射过程中组织定位的准确性。
- 促进斑马鱼在各种实验模型中的应用。
使用的方法
- 开发用于稳定的微尺度工具。
- 固定幼虫在阵列中的技术。
- 进入特定组织的策略。
- 在大规模研究中应用方法。
主要结果
- 在操作过程中增强了斑马鱼幼虫的稳定性。
- 改进了目标微注射的定向。
- 适用于高通量应用。
- 便于进入组织进行成像和注射。
结论
- 该方法显著地帮助了斑马鱼研究。
- 它为各种实验需求提供了一种可靠的方法。
- 未来的应用可能会扩展到其他模型系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
Microstructured devices for zebrafish larval microinjection address throughput and precision bottlenecks in phenotypic screening and target validation workflows. By enabling standardized embryo orientation and immobilization, the method supports reproducible compound testing in disease-relevant systems. This improves predictive confidence in early discovery for infection and oncology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise tissue targeting for microinjection of pathogens or tumor cells, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Standardizes larval positioning across large arrays, reducing variability in infection or xenograft model initiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative imaging readouts of neutrophil recruitment in response to chemoattractants like fMLP and LTB4, enabling dose-response assessment.
- Operational Value: Facilitates parallel processing of larvae in microfluidic channels, increasing throughput for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal imaging of immune cell dynamics post-injection, aligning with translational biomarker studies in inflammation and metastasis.
- Operational Value: Integrates with fluorescent microscopy platforms for standardized readout across preclinical validation stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges early discovery and preclinical evaluation by enabling standardized microinjection and live imaging in zebrafish larvae, a disease-relevant system for target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through controlled delivery of agents to specific tissues such as the otic vesicle.
- Screening: Enables assay-ready preparation of larvae in consistent orientations for reproducible compound exposure.
- Analytics: Generates fluorescent and transmitted light imaging outputs for quantifying cellular recruitment and tracer distribution.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via standardized imaging of neutrophil responses relevant to human inflammation and cancer models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform technology adaptable across multiple larval stages and experimental endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing technical variability in microinjection and imaging procedures.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of larval handling in multi-well formats.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing data quality in early-stage phenotypic screens.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on robust zebrafish model data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling and zebrafish larval manipulation.
- Depends on access to PDMS fabrication, micromanipulators, and fluorescent microscopy systems.
- Necessitates standardization of embryo staging and anesthetic protocols across teams.
- Adaptation considerations include channel dimensions for different larval sizes and orientation requirements.
- Practical limitations include device clogging risk and the need for careful fluidic priming to ensure consistent larval loading.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
Orientation of Zebrafish on Divot Arrays and Microstructured Channels
2:39
Microinjection of Zebrafish
4:20
Screening of Embryos Using the PDMS Imaging Device
5:45
Results: Microinjection and Imagingof Zebrafish Larvae Using Microstructured Devices
7:04
Conclusion
