Name: 斑马鱼幼虫显微注射和成像的微装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 了解斑马鱼幼虫微注射与成像的微装置技术，用于神经科学与发育生物学研究。该方法通过固定幼虫特定方位，实现精准组织靶向注射和高通量活体成像。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 David Langenau 慷慨提供水族箱空间；感谢 Eric Stone、John C. Moore 和 Qin Tang 在斑马鱼饲养和试剂方面的帮助；感谢 Leonard Zon 实验室的 Anne Robertson 和 Elliott Hagedorn 提供本研究所用的斑马鱼品系。作者还感谢 Octavio Hurtado 在光刻技术方面提供的建议。FE 获得儿童烧伤医院（Shriner's Hospital for Children）和美澳协会（American Australian Association）奖学金的资助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金 GM92804 资助。

幼虫显微注射实验已获得麻省总医院研究动物护理小组委员会在方案2011N000127下的批准。
1. 器件制备
注意：本文所述用于设计光刻掩模的所有计算机辅助设计（CAD）文件（图1）均可下载。相关链接见材料表。
<ol>
	<li>在1,000级洁净室中，使用标准的光刻技术制备母模晶圆7。对于微结构阵列和通道，根据制造商说明，使用三种不同的掩模分三层依次图形化环氧基负性光刻胶：浅层结构为100 µm，中层结构为200 µm，深层结构为400 µm。对于成像装置，使用两层结构，浅层为400 µm，深层为600 µm。</li>
	<li>将完成的晶圆用胶带固定在15 cm培养皿底部以进行浇铸（图2）。</li>
</ol>
2. 微结构表面阵列的制备 - PDMS
<ol>
	<li>为了制备可用的装置，使用母版晶圆作为模具浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）。将50 g PDMS单体与5 g引发剂混合，在塑料称量皿中用塑料叉充分搅拌。</li>
	<li>小心地将混合物倒入模具中。</li>
	<li>在真空干燥器中于16–25 inHg（54–85 kPa）下脱气1小时。</li>
	<li>将PDMS在65 °C下烘烤至少3小时以完成固化。PDMS应固化为坚固但柔韧的固体。</li>
	<li>使用解剖刀在母版晶圆上沿装置轮廓小心切割，确保刀尖始终与晶圆表面接触。用镊子将PDMS复制品从晶圆上剥离，并转移至洁净的10 cm培养皿中，使结构面朝上（图3）。</li>
	<li>使用等离子体清洗机对装置进行35秒的氧气等离子体处理，以降低其疏水性。</li>
	<li>用含有168 mg/L丙氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222，pH 7.5）的斑马鱼胚胎培养基（E3）覆盖装置。使用移液管将液体流过装置表面，以去除较深结构中的气泡。</li>
</ol>
3. 微结构表面阵列的制备 - 琼脂糖
<ol>
	<li>制备负性PDMS模具时，首先需对PDMS器件进行氧等离子体处理。</li>
	<li>使用1H,1H,2H,2H-三乙氧基硅烷全氟辛基（PFDTS）硅烷蒸气处理PDMS器件，以形成惰性表面8。简要步骤如下：
	<ol>
		<li>将待处理的PDMS器件特征面朝上放置于通风橱内的真空腔室中。</li>
		<li>在PDMS器件旁放置一个小型敞口玻璃或铝制培养皿，并小心地用移液器将200 µL的PFDTS（98%硅烷）加入培养皿中。 
		注意：PFDTS硅烷具有高度挥发性，遇水剧烈反应，易燃，且接触后可导致严重的皮肤和眼部损伤。使用前请详细阅读材料安全数据表（MSDS）。</li>
		<li>关闭真空腔室，抽真空15–30分钟，或直至PFDTS硅烷完全蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将处理后的器件放入培养皿中，作为新鲜PDMS的模具使用，新鲜PDMS的制备方法如步骤2.1–2.3所述。</li>
	<li>在65 °C下烘烤至少3小时，然后将整层新鲜PDMS从处理过的器件上剥离，并转移至新的培养皿中。此PDMS层可作为负模用于浇铸琼脂糖。</li>
	<li>制备琼脂糖时，将2%低凝胶温度琼脂糖溶于E3溶液中，在微波炉中加热至沸腾，直至琼脂糖完全溶解。</li>
	<li>将热琼脂糖溶液倾倒于PDMS负模上，并用移液管将热琼脂糖在器件表面流动，以去除覆盖在特征结构上的气泡。</li>
	<li>气泡去除后，于4 °C下冷藏使琼脂糖凝固。</li>
	<li>通过手动从下方变形PDMS的方式，将琼脂糖块从负性PDMS模具中取出，转移至新的培养皿中，并用含MS-222的E3溶液润湿。</li>
</ol>
4. PDMS 成像装置的制备
<ol>
	<li>为制备可用的装置，使用主模板作为模具浇铸PDMS。将50 g PDMS单体与5 g引发剂（与步骤2.1中所用相同）在塑料称量皿中用塑料叉充分混合。</li>
	<li>小心将混合物倒入模具中。</li>
	<li>在真空干燥器中于16–25 inHg（54–85 kPa）下脱气1小时。</li>
	<li>为固化PDMS，在65 °C下烘烤至少3小时。PDMS应固化为坚固但柔韧的固体。</li>
	<li>从主模板上切下装置，并使用1.5 mm打孔器打出进出口孔。</li>
	<li>按照步骤2.6所述方法，将装置和6孔玻璃底培养板用氧气等离子体处理35秒。</li>
	<li>将每个装置的特征面朝下，贴合至6孔板的每片玻璃盖玻片上，并置于85 °C加热板上加热10分钟以实现键合。 
	注意：为确认键合成功，可用镊子用力按压已键合装置的一侧。装置应牢固附着于玻璃盖玻片上，不脱落。</li>
</ol>
5. 斑马鱼培养
<ol>
	<li>采用标准技术将斑马鱼胚胎培养至2 dpf3。</li>
	<li>在装载到装置前至少30–60分钟，使用镊子或1 mg/mL蛋白酶混合液（见材料表）去除胚胎的绒毛膜，以使其伸直3。</li>
	<li>通过向培养皿的E3培养基中加入1 mL 25倍浓缩的MS-222储备液（终浓度168 mg/L，pH 7.5），对胚胎进行麻醉处理。</li>
</ol>
6. 斑马鱼在微结构表面——凹坑阵列上的定向行为
<ol>
	<li>将步骤 2.7 中制备的 PDMS 块（图 3A）置于其培养皿中，并在其表面覆盖一层薄的 E3 溶液（1–2 mm），以便于胚胎的操作。</li>
	<li>使用转移移液器将所需数量的胚胎（通常每组条件 10–20 个）转移至 PDMS 块的表面。</li>
	<li>使用显微操作工具（毛细环或类似工具）将胚胎推入微结构凹坑中（图 3A）。凹坑特别适用于胚胎的背侧和腹侧方向固定。 
	注意：对于贴合较紧的凹坑（背侧和腹侧），建议先将胚胎平行于凹坑放置在块体表面，再用毛细环将其滚动至凹坑内。将胚胎进一步推入凹坑深处有助于保持其稳定。</li>
</ol>
7. 斑马鱼在微结构化表面的定向行为——微结构化通道
<ol>
	<li>使用转移移液管从带有微结构通道的PDMS块（图3B）中吸出E3，直至E3液面低于PDMS块边缘，但储液区、通道内以及PDMS表面仍保留一层薄薄的E3液体。</li>
	<li>使用转移移液管将步骤5.3中的10个胚胎转移至储液区，注意避免液体溢出边缘。</li>
	<li>使用毛细环将每个胚胎移入相应通道入口处的漏斗结构，并调整其方向，使胚胎头部朝向通道，且进入通道时保持正确的方位。</li>
	<li>用毛细环将每个胚胎沿通道滑入，直至其到达通道壁上的定位微结构特征处，该结构有助于固定胚胎位置。建议在进行侧向定位时特别使用微结构化通道。 
	注意：为减少显微注射过程中胚胎的滑动，可尝试通过从储液区吸出部分E3来调节表面张力。</li>
</ol>
8. 斑马鱼的显微注射
<ol>
	<li>准备显微注射针。
	<ol>
		<li>使用拉针仪制备硼硅酸盐玻璃微量毛细管针，方法如前所述4。所得针尖应在一端逐渐变细至尖端，锥形部分长度约为 10 mm。</li>
		<li>配制待注射溶液，本实验中为含 100 nM 趋化因子（N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）或白三烯 B4（LTB4））和 100 nM 70 kDa 罗丹明葡聚糖示踪剂的 PBS 溶液。</li>
		<li>使用细锥形移液器吸头（见材料表）将 5 µL 溶液装入注射针中。</li>
		<li>将注射针安装至固定在磁力支架上的显微操作器，并连接至皮升注射泵（picopump）微注射装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子夹住锥形针尖，以约 45° 角折断针尖。</li>
	<li>通过调节皮升注射泵控制器上的注射时间，将注射体积调整为 1 nL。</li>
	<li>调节显微注射针的角度。通常将显微操作器上的针角度设为 45° 是一个良好的起始点，此时针头与胚胎长轴平行。若需减少显微注射过程中胚胎的侧向移动，可采用更陡的角度。</li>
	<li>左手控制培养皿，右手操控显微注射针的操作臂，将针头尽可能接近预定的注射部位，本实验中为耳泡（otic vesicle）。 
	注：耳泡位于眼后方，呈椭圆形器官，其内含有两个较小且明显的深色椭圆结构（耳石），可据此识别。</li>
	<li>使用显微操作器将针头刺入靶组织（本实验中为耳泡），使针尖进入耳泡腔内，并通过皮升注射泵脚踏开关注入预设体积的溶液。 
	注：若组织阻力较大难以刺入，可尝试轻轻敲击显微操作器旋钮。</li>
	<li>用移液器将 E3 培养基从上至下冲洗培养皿表面，或轻轻旋转培养皿，使胚胎脱离并释放到周围的 E3 培养基中。</li>
	<li>使用移液器将胚胎转移至不含 MS-222 的 E3 恢复培养皿中。</li>
</ol>
9. 使用 PDMS 成像装置筛选胚胎
<ol>
	<li>通过端口将 E3（含 MS-222）流经第 4.7 步中的装置以进行预灌注。可使用 1,000 µL 移液器或细尖转移移液器完成此操作。</li>
	<li>用 E3 + MS-222 填充孔，直至完全覆盖装置。</li>
	<li>使用转移移液器将第 8.7 步中注射的 4 个胚胎转移至每个孔中。如需要，可在加载前（第 5.3 步）将胚胎在 E3 + MS-222 中孵育 1–2 分钟以预先麻醉。</li>
	<li>使用显微操作工具（毛细环或类似工具），将胚胎按所需方向（根据所用装置选择尾部朝前或头部朝前）置于成像通道的入口处，并将其部分推入装置内（图 4A）。这有助于使胚胎均匀地进入装置。</li>
	<li>使用 1,000 µL 移液器或转移移液器从端口将 E3 通过装置抽吸，直至胚胎被吸入通道并处于正确的成像方向（图 4B）。 
	注意：注意不要将胚胎吸入超过捕获点，否则会损伤胚胎并改变其方向。</li>
	<li>将培养板转移至显微镜下进行成像（图 4C）。</li>
	<li>使用倒置荧光显微镜进行成像。
	<ol>
		<li>通过选择合适的物镜调整放大倍数。通常，10X 是成像斑马鱼中性粒细胞迁移的有用放大倍数。</li>
		<li>针对每个通道调节光源强度和曝光时间，使每个信号清晰但不饱和。</li>
		<li>采集每个通道的图像。此处我们使用了绿色荧光蛋白（GFP，Ex: 470/22，Em: 525/50）、德克萨斯红（TxRed，Ex: 585/29，Em: 628/32）和透射光通道。多通道图像可在后期处理过程中合并（图 4B-I）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon. (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li>
<li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+%28ZEBRA%29+device%3A+a+low-cost%2C+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924424712000581">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li>
<li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li>
<li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhagoSight%3A+an+open-source+MATLAB%C2%AE+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636(2013).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016943321201094X">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li>
<li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li>
<li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish-on-a-chip%3A+microfluidics+for+zebrafish+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li>
<li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li>
<li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+on+a+chip%3A+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792(2014).</li>
<li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping%2C+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630(2012).</li>
<li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400512012154">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li>
<li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了我们近期开发的用于促进2 dpf斑马鱼显微注射的装置5，并提出一种简便的无琼脂糖固定装置，便于胚胎成像。这些工具凸显了光刻技术在制备适用于斑马鱼实验操作的装置方面的实用性。
我们发现，MSA装置在注射容易在显微注射针内聚集的细胞或颗粒时尤为有用，例如真菌分生孢子或人源癌细胞，这些物质的递送需要使用孔径较大的注射针。向耳囊（图4）注射具有特殊挑战性，因为胚胎在接触注射针时常会发生滚动。我们发现，使用具有微结构的通道将斑马鱼固定并稳定于侧向位置，可显著提高该技术的操作通量和准确性。
为了在不同时间点快速成像侧向固定的斑马鱼（例如中性粒细胞募集或异种移植转移的评估），避免使用琼脂糖可提高胚胎固定的一致性，并减少成像后回收过程中的损伤风险。这些装置在长时间延时成像中也显示出良好前景，已成功用于在12小时内以极小的斑马鱼运动实现多通道、多层面的图像采集。由于不受琼脂糖的限制，幼鱼在此期间的主动伸长效应（约在54至78小时...

斑马鱼已成为许多研究领域的强大模型，从基础发育生物学研究到大规模遗传学和化学筛选均广泛应用1,2。常规的遗传操作，如基因过表达、基因敲低、CRISPR/Cas9 介导的诱变以及转基因技术，均依赖于将遗传物质显微注射至单细胞受精卵中，这推动了用于定向和固定卵子以便注射的简单、易用且可商业获取的工具的发展3。其他实验方法，如细胞移植和感染实验，通常需要使用更大口径的毛细玻璃针将物质注射至发育后期的胚胎或幼鱼中4。然而，使用更大口径的注射针会带来显著的技术挑战，因为更难在不推动或滚动胚胎的情况下穿透目标组织。在此类条件下，维持适当的水表面张力以固定胚胎并防止操作过程中胚胎干燥十分困难，且胚胎可能无法被理想地定位，从而影响对目标组织的准确注射。
显微注射后，通常需要对注射后的胚胎进行筛选，以挑选出成功注射的个体，并获取初始时间点的图像。为解决这些挑战，我们开发了一系列微结构装置，可帮助在显微注射过程中5以及注射后快速基于图像的筛选过程中，以不同方向稳定固定2 dpf胚胎。
为了在这些装置中获得足够的结构分辨率，我们采用了光刻技术。该技术在微电子工业中广泛应用，近年来也被拓展应用于微流控器件的制造，能够实现1-1,000 µm范围内的垂直结构，这一尺度非常适合斑马鱼胚胎和幼鱼的操作。所有装置均采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作，该材料成本低、物理性能稳定、生物惰性强且透明。
微结构化表面阵列（MSAs）由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，其顶部表面具有特定图案，类似于常用于卵细胞显微注射的琼脂糖块中的简单通道结构。在注射后的筛选过程中，可在标准的玻璃底六孔板中排列6个成像装置。这些装置设计便于胚胎的加载，同时其卸载过程可方便地回收特定胚胎，从而以比Beebe实验室先前开发的装置更用户友好的方式促进基于成像的筛选方法6。

<table><tbody><tr><td>道康宁 Sylgard 184 聚二甲基硅氧烷 (PDMS)</td><td>艾尔斯沃思胶粘剂</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>用于铸造装置。套件包含 PDMS 单体和引发剂</td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>A9414-10G</td><td>用于铸造琼脂糖装置</td></tr><tr><td>PFDTS 硅烷</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>448931-10G</td><td>用于铸造负性 PDMS 模具</td></tr><tr><td>三卡因 (MS-222)</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>E10521-10G</td><td>用于麻醉斑马鱼</td></tr><tr><td>罗丹明葡聚糖 70,000 Da</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D1818</td><td>用于追踪显微注射</td></tr><tr><td>白三烯 B4 (LTB4)</td><td>凯曼化学</td><td>20110</td><td>中性粒细胞趋化剂</td></tr><tr><td>N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸 (fMLP)</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>F3506-50MG</td><td>中性粒细胞趋化剂</td></tr><tr><td>15 cm 培养皿</td><td>费舍尔科学</td><td>08-757-148</td><td>用于从主模板铸造装置</td></tr><tr><td>玻璃底 6 孔板</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>用于成像装置</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃微量毛细管</td><td>世界科学仪器公司</td><td>TW-100-4</td><td>用于显微注射针头</td></tr><tr><td>移液管</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>Z350796</td><td>用于转移斑马鱼胚胎</td></tr><tr><td>Microloader 加样头</td><td>费舍尔科学</td><td>E5242956003</td><td>用于向显微注射针头中加样</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5 mm 打孔器</td><td>Ted Pella 公司</td><td>15111-15</td><td>用于在 PDMS 成像装置上打孔</td></tr><tr><td>11 号手术刀</td><td>精细科学工具</td><td>10011-00</td><td>用于切割 PDMS</td></tr><tr><td>Dumont 5 号镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11252-10</td><td>用于去除胚胎外壳及打断显微注射针尖</td></tr><tr><td>马尔佐豪泽 Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>用于操控显微注射针头</td></tr><tr><td>磁力支架</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>用于安装显微操作器</td></tr><tr><td>MPPI-3 皮升泵控制器</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>用于控制显微注射体积和时间</td></tr><tr><td>EVOS 倒置荧光显微镜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EVOS FL</td><td>用于成像已注射的胚胎</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ745</td><td>用于观察显微注射过程</td></tr><tr><td>AutoCAD 软件</td><td>欧特克</td><td></td><td>从以下网址下载 AutoCAD 文件：https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 以及 ZFIN 社区实验方案维基页面：https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

用于优化斑马鱼幼鱼显微注射与成像的微结构装置

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

斑马鱼已成为研究多种人类疾病的强大模型，并被广泛应用于越来越多的实验研究中，涵盖从基础发育生物学到大规模遗传学和化学筛选等多个领域。然而，许多实验，特别是与感染和异种移植模型相关的实验，依赖于对胚胎和幼鱼进行显微注射和成像，这些技术操作繁琐，且需要较高的技能与经验。为了提高现有显微注射技术的精确性和通量，我们开发了一系列微结构装置，可在操作前将受精后2天（dpf）的斑马鱼胚胎以腹侧、背侧或侧向方位进行定向和稳定。为辅助胚胎成像，我们还设计了一种结构简单的装置，其通道可将4条斑马鱼并排侧向固定于玻璃盖玻片上。综上所述，本文所展示的工具证明了采用光刻技术制备实用装置在优化斑马鱼实验技术方面的有效性。

本文所述方法展示了用于2天龄斑马鱼的装置设计（图1）及其制造过程，采用光刻（图2）和软光刻（图3）技术。该方法可快速测试多种设计迭代与修改方案，且通过调整和优化微结构尺寸以适用于斑马鱼其他发育阶段，可进一步拓展其应用范围。
我们展示了这些装置在具有挑战性的显微注射技术及便捷成像中的应用。耳囊（图4D，白色虚线轮廓）为在斑马鱼中检测中性粒细胞募集提供了一个有用、免疫豁免且独立的位点9。为了检测斑马鱼中性粒细胞对标准趋化因子的响应能力，将100 nM的fMLP和LTB4通过微结构化通道装置（图1G）显微注射至2天龄...

斑马鱼胚胎和幼鱼的显微注射是一种在多种斑马鱼模型中至关重要的技术，但也具有挑战性。本文介绍了一系列微尺度工具，可用于在显微注射和成像过程中辅助稳定和定向斑马鱼样本。

斑马鱼已成为研究多种人类疾病的有力模型，并被广泛应用于越来越多的实验研究中，涵盖……

本方法的总体目标是使斑马鱼幼鱼的显微注射更加简便和精确。该方法可帮助使用斑马鱼模型系统的研究人员将大量斑马鱼幼鱼以特定方向固定在阵列中。该技术便于对特定组织进行显微注射和成像操作，在需要大量幼鱼的应用中（如感染模型或异种移植肿瘤模型）具有很高的效率。我在斑马鱼模型中的两种制备策略具有高度互补性。一种是人工合成且结构简单，另一种则是活体且结构复杂。两者具有相同的尺寸刻度，均为透明材质，且均支持单细胞分辨率的观察。如您在此所示，这些方法可以轻松结合，并可应用于几乎所有重大疾病的研究。根据文本方案，在培养皿中制备一层E-3薄膜后，将PDMS块置于其上，然后使用移液管将所需数量的胚胎转移至PDMS块表面。使用毛细环或类似工具，将胚胎推入微结构凹槽中，特别是用于背侧和腹侧方向的定位。将幼虫装入凹槽时，应确保有足够的水覆盖PDMS块，以便于操作。同时，必须将幼虫推入凹槽中，以确保其在注射过程中保持固定位置。为将斑马鱼定向至微结构通道（该通道已根据文本方案预先制备），请使用移液管从图案化的PDMS块上吸除E-3培养基。E-3 液面应降至方块边缘以下，但仍需保留在储液池和通道中，并在 PDMS 表面保留一层薄液膜。使用移液管将 10 个麻醉后的胚胎转移至储液池中，注意避免液体溢出边缘。利用毛细环将每个胚胎依次移入漏斗口，首先置于相应通道的入口处，确保胚胎进入通道时具有正确的方向。然后，使用毛细环将每个胚胎沿通道滑动，直至其到达通道壁上的定向微结构，该微结构可使胚胎固定就位。在制备显微注射针和显微注射溶液后，用细锥形移液器吸头将五微升（5 µL）溶液装入注射针中。将注射针安装到固定在磁性支架上的显微操作器上，并将其连接至PICO泵显微注射仪。然后，使用镊子夹住针尖的锥形末端，以45度角折断针尖。通过调节PICO泵控制器上的注射时间，将注射剂量调整为1纳升。在显微操作控制器上调整显微注射针的角度，初始角度设为45度，使注射针与胚胎的长轴平行。可采用更陡的角度以尽量减少显微注射过程中胚胎的侧向移动。用左手控制培养皿，右手操作显微操作器，将注射针尽可能靠近预定的显微注射部位（例如耳泡）。使用显微操作控制器将注射针插入目标组织，然后踩下PICO泵的脚踏开关，注入预设体积的液体。如果组织抵抗穿刺，可轻轻敲击显微操作控制器旋钮。为释放胚胎，可用转移移液管将E-3培养液从上至下冲洗组织表面，或轻轻旋转培养皿，使胚胎释放到周围的E-3培养液中。随后将胚胎转移至不含MS-222的E-3恢复培养皿中。为了使用六孔板中各孔内的PDMS装置筛选胚胎，可采用1,000微升移液器或尖端较细的转移移液器，通过端口注入E-3培养基以预润装置。使用E-3培养基和MS-222填充孔板，直至装置完全浸没。随后，用转移移液器将四个先前已注射的胚胎分别加入每个孔中。使用毛细环或类似工具，将胚胎置于成像通道入口处，并调整至所需方向，然后部分推入装置内。这有助于使胚胎均匀地进入装置。使用1,000微升移液器或转移移液器，从端口处吸取E-3培养基通过装置，直至胚胎被吸入通道内并处于正确的成像方向。将培养板转移至倒置荧光显微镜。为成像胚胎，通过选择合适的物镜（例如，成像斑马鱼神经嵴细胞迁移时选用10倍物镜）来调节放大倍数。针对每个通道，调节光源强度和曝光时间，使各信号清晰但不饱和。最后，采集每个荧光和透射光通道的图像。利用微结构化通道装置将胚胎稳定在侧向位置，检测了受精后两天斑马鱼胚胎的中性粒细胞对标准趋化因子fMLP和LTB4的响应能力，这些趋化因子被微量注射至耳囊中。为了可视化中性粒细胞的募集过程，注射时使用了高分子量的罗丹明葡聚糖进行示踪，并在携带绿色荧光中性粒细胞的转基因胚胎中进行操作。未注射的胚胎和仅注射罗丹明的胚胎用作阴性对照。显微注射后，将胚胎转移至成像通道装置中，并在注射后30分钟和5小时，使用EVOS荧光显微镜进行成像。正如预期，在早期时间点，有少量荧光中性粒细胞被招募至模拟注射的耳囊，这可能是由于损伤介导的招募所致。有趣的是，在实验过程中观察到罗丹明葡聚糖示踪剂在耳石中积累。对于这两种趋化因子，中性粒细胞的募集数量均有所增加，尤其是对白三烯B4（LTB4）的反应更为显著。一旦掌握，该技术可显著提高斑马鱼显微注射的速度和准确性。该技术的开发源于我们实验室面临的特定挑战。我们优化了这一方法，以满足斑马鱼模型中真菌感染和肿瘤异种移植项目的需求。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用微结构化表面阵列进行斑马鱼的显微注射以及长期活体成像。

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

斑马鱼幼虫显微注射和成像的微装置

显微注射是一种成熟且有效的方法，可用于将外源物质导入受精的斑马鱼胚胎中。本文中，我们展示了一种可靠的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行mRNA过表达以及吗啉代寡核苷酸基因敲降研究。...

斑马鱼胚胎中mRNA和吗啉代反义寡核苷酸的显微注射

本视频展示了如何在单细胞阶段将吗啉代寡核苷酸（morpholino）或 mRNA...

显微注射斑马鱼胚胎以分析基因功能

一种无需麻醉的简易微流控装置已被开发出来 体内 成像 秀丽线虫完整 果蝇...

简单的微流控装置 体内 成像 秀丽隐杆线虫, 果蝇 和斑马鱼

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

本文所述方法利用能够进行光学切片的荧光解剖显微镜，以及简单的重新调整策略来校正焦平面和层面漂移，从而实现对斑马鱼胚胎器官发育过程的延时分析。...

利用配备光学切片功能的解剖显微镜通过延时成像分析斑马鱼肾脏发育

在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内...

体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响

用于改进斑马鱼幼鱼实验操作的长期活体成像装置

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

本文介绍了一种实验方案 体内...

体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

一种利用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）层压技术制备微流控器件的创新方法，显著降低了对多个活体斑马鱼胚胎进行捕获和成像的成本与复杂性。...

低成本聚对苯二甲酸乙二醇酯层压微流控设计用于多重斑马鱼成像

了解斑马鱼幼虫微注射与成像的微装置技术，用于神经科学与发育生物学研究。该方法通过固定幼虫特定方位，实现精准组织靶向注射和高通量活体成像。

用于优化斑马鱼幼鱼显微注射与成像的微结构装置

探索更多视频