改进的小鼠骨骼肌染色质沉淀的协议

该程序的总体目标是从成年小鼠骨骼肌中制备染色质。这种方法可以帮助回答基因调控和骨骼肌纤维中的关键问题。该技术的主要优点是它允许从小鼠骨骼肌制备 ChIP 级染色质。

一种具有高含量结构蛋白的物理抗性组织。当我们试图表征葡萄糖关节使用肌肉萎缩的分子机制时，我们首先想到了这种方法，这需要识别小鼠骨骼肌纤维中的葡萄糖关节受体、DNA 结合位点。演示该程序的是我们实验室的博士后 Shilpy Joshi。

要开始此程序，请恢复冷冻或新鲜解剖的后肢肌肉。随后，使用细剪刀将肌肉切碎在含有 1 毫升冰冷的低渗缓冲液的 2 毫升试管中，均匀地制备成小块。然后，将试管放在台式搅拌器上以 4 摄氏度摇动 5 到 10 分钟。

接下来，将解剖的组织转移到含有 4 毫升冷低渗缓冲液的 14 毫升圆底管中。使用机械组织匀浆器将切碎的组织匀浆 15 至 30 秒。然后，将匀浆转移到 15 毫升试管中。

加入冷的低渗缓冲液，得到 10 毫升样品，并在继续下一只小鼠之前固定匀浆。在此过程中，向样品中添加甲醛，使最终浓度为 1%。然后在室温下摇晃 10 分钟。

接下来，添加甘氨酸，使每管中的终浓度为 0.125 摩尔，以停止固定。并在室温下摇晃 5 到 10 分钟。之后，使用松散的 doounce 匀浆固定裂解物。

然后，将其转移到 15 毫升试管中，在 4 摄氏度下以 1000 g 离心 5 分钟，以获得细胞核和细胞碎片。5 分钟后，去除上清液，将沉淀重新悬浮在 5 mL 新鲜的低渗缓冲液中。通过 70 微米的细胞过滤器将裂解物过滤到 50 毫升的试管中。

使用移液器吸头，用 1 毫升冷低渗缓冲液清洗过滤器。然后，通过 40 微米的池过滤器重新过滤滤液。随后，将滤液转移到 15 毫升试管中。

并在 4 摄氏度下以 1000 g 离心 5 分钟，得到细胞核沉淀。弃去上清液后，使用 1 毫升低渗缓冲液混合三个沉淀，并转移到 1.5 至 2 毫升的试管中。以 1000 g 离心 5 分钟。

接下来，通过与含有已知体积液体的试管进行比较来评估核沉淀的体积，并将其重新悬浮在超声处理缓冲液中，最高可达填充核体积的三到四倍。随后，使用超声仪在 4 摄氏度下对悬浮液进行 10 至 15 分钟的超声处理。离心超声处理的样品，并将染色质上清液转移到新鲜的 1.5 mL 试管中。

要去交联，请在 1.5 毫升试管中取 30 微升染色质，并加入 20 微升 5 摩尔氯化钠和 450 微升水。将体积完成至 500 微升，并在 65 摄氏度下孵育过夜。第二天，在 42 摄氏度下用 1 微升蛋白酶 K、10 微升 pH 6.8 的双摩尔 tris 和 10 微升 0.5 摩尔 EDTA 进行 1 小时的处理。

然后，进行常规苯酚-氯仿提取，并用 1 体积的乙酸钠和 2 体积的 100% 乙醇沉淀 DNA，在零下 80 摄氏度下沉淀 1 小时，或在零下 20 摄氏度下过夜。接下来，以 13， 500 g 离心 15 分钟，沉淀 DNA。倒出上清液，用冷的 70% 乙醇彻底洗涤沉淀，然后再次离心 5 分钟。

然后倒出上清液并风干沉淀。之后，将沉淀重悬于原始体积的 tris HCl EDTA 缓冲液中。在分光光度计中用 260 纳米、280 纳米的吸收剂测量 DNA 浓度。

随后，将 500 至 1000 ng DNA 与 DNA 大小的分子量标准一起移液到 1.5% 琼脂糖凝胶的不同泳道上。并进行电泳以评估染色质的片段大小。为了优化，以 18， 000 和 22， 000 RPM 两种速度进行均质化 15 秒或 45 秒。

在所有条件下，细胞核都可以从组织碎片中分离出来，但使用较低的速度时产量最佳。也可以通过 3 到 5 分钟来准备 Nuclei。但机械均质是首选方法，因为可以在短短 15 秒内实现最佳细胞核产量，从而大大节省时间，尤其是在必须处理多个样品的情况下。

使用该方案，可以从 500 毫克组织中分离出高达 2.7 乘以 10 到 7 个细胞核的 10 倍，以产生 100 微克染色质。以这种方式制备的染色质可在 ChIP 测序实验中提供干净、高质量的结果。如肌肉表达的 Desmond 基因座处组蛋白 H3 和 RNA 聚合酶 2 的高水平乙酰化 K27 所示。

对肌纤维的特异性表现为在肌肉中不表达的 Pecam1 和 Vcam1 基因座信号低或缺失。在尝试此过程时，重要的是将匀浆器探针正确浸入样品中，以避免起泡，清洁样品之间的探针，并优化染色质碎裂。以这种方式制备的染色质已成功用于 ChIP 绘制全基因组转录因子占有率，也应适用于染色质确认捕获技术。

经过开发，这项技术为基因组学领域的研究铺平了道路，以探索小鼠骨骼肌中的基因调控。该程序也可应用于大鼠的肌肉和人类患者的活检。看完这个视频，你应该对如何使用机械匀浆，然后纯化甲醛固定的细胞核，从骨骼肌中制备染色质进行免疫沉淀有了很好的了解。

不要忘记，使用甲醛、苯酚、氯仿和蛋白酶 K 可能是危险的。应采取预防措施，例如佩戴手套和眼镜。涉及这些试剂的步骤应在引擎盖下进行。