渗透胁迫对分泌性囊泡和胞吐作用的监测作用

渗透胁迫影响胞吐作用和在这个过程中释放的神经递质的数量。我们演示了如何结合电化学方法和透射电子显微术来研究细胞外渗透压对胞吐作用活性、囊泡量子大小和释放神经递质的影响。在胞吐作用期间。

这种组合分析方法的总体目标是提供有关细胞中的分泌囊泡如何响应物理力（例如细胞外渗透压）的信息，以及这些细胞器的调整如何进一步影响胞吐作用过程。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如，分泌囊泡如何直接响应细胞外环境的变化或药物治疗？这种方法的主要优点是监测对活细胞囊泡含量的直接影响，并知道区分胞吐作用处理前后其 reh 化学释放的变化。

为了获得平坦的圆盘电极表面，请将电极放在微型研磨机的支架中，并以 45 度角将每个碳纤维电极斜切。之后，标记毛细管以备将来参考，当将电极放置在细胞附近进行胞吐作用测量时，如何以 45 度角定位圆盘电极表面。要在单个电池上进行安培记录，请将新斜面和测试的碳纤维盘微电极安装在与恒电位仪一起使用的头部级的电极支架中。

使用前，将每个碳纤维微电极置于测试溶液中，以使用循环伏安法监测研究状态电流。对于循环伏安法扫描，以每秒 100 毫伏的电压对银-氯化银参比电极施加从负 0.2 伏到正 0.8 伏的三角电位波形，以确保良好的反应动力学。对于胞吐作用的安培法记录，将培养的嗜铬细胞置于法拉第笼中的等渗缓冲液中的培养

在细胞实验期间，使用显微镜加热台将温度保持在 37 摄氏度。接下来，使用低噪声膜片钳仪器在工作电极上施加 700 毫伏的正恒定电位。为了记录嗜铬细胞的胞吐作用，将 10 kHz 的信号数字化，并应用 2 kHz 的内部低通贝塞尔滤波器来过滤记录的信号。

请注意，椭圆形圆盘电极需要平放在细胞顶部并平行于培养皿的表面。此外，电极在实验当天进行斜面处理，以确保电极表面清洁。为了刺激细胞胞吐作用，将装有 5 毫摩尔氯化钡溶液的玻璃微量移液器放置在距离细胞至少 20 微米的距离处。

然后，在细胞表面施加 5 秒的 5 毫摩尔氯化钡溶液注射脉冲，以刺激细胞胞吐作用。将移液管放入溶液中，通过施加钡注射脉冲刺激细胞胞吐作用，同时记录安培电流瞬变约三分钟。为了比较等渗条件与高渗条件下的胞吐反应，将细胞在高渗缓冲溶液中孵育 10 分钟。

此后，应用钡注射脉冲以刺激胞吐作用，并进行 3 分钟的安培记录。对于细胞的可逆反应，将细胞在等渗缓冲溶液中再次孵育 10 分钟。通过施加钡注射脉冲刺激细胞，并记录胞吐反应三分钟。

为了制造用于囊泡量子尺寸测量的电极，请准备直径为 5 微米的碳纤维电极。在显微镜下，用手术刀切下从玻璃尖端伸出的碳纤维，只剩下 30 到 100 微米。使用丁烷火焰制备碳纤维电极的火焰蚀刻尖端。

要获得均匀蚀刻的圆柱形电极尖端，请在旋转圆柱形碳纤维电极的同时握住它。并将从玻璃伸出的碳纤维放入丁烷火焰的蓝色边缘，直到碳的尖端变成红色。火焰蚀刻后，将电极置于显微镜下以评估电极尖端。

蚀刻电极尖端的直径应约为 50 至 100 纳米。接下来，将圆柱形 Nanotip 微电极插入环氧树脂溶液中 3 分钟，然后将电极尖端浸入丙酮溶液中 15 秒。这使得环氧树脂能够密封碳纤维和绝缘气体毛细管壁之间的潜在间隙空间。

而丙酮清除蚀刻碳纤维电极表面的环氧树脂。要固化环氧树脂，请将电极在 100 摄氏度的烤箱中烘烤过夜。使用前，使用循环伏安法测试每个碳纤维微电极的稳态电流。

对于实验，仅使用显示约 1.5 至 2.5 纳安培的平台电流的电极。对于细胞内安培法测量，将细胞置于显微镜下并使用与电化学工作站相同的实验设置。防止对细胞造成重大物理损伤。

通过施加温和的机械力，将 nanotip 圆柱形微电极插入电池中。刚好足以使用显微作器将电极推过细胞质膜并进入细胞质。插入后，将细胞膜密封在圆柱形电极周围，在活细胞处开始原位安培记录。

在施加到电极的氧化电位下，囊泡吸附到电极表面并随机破裂。因此，不需要任何类型的刺激来启动这个过程。为了确定渗透对囊泡量子大小的影响，使用实验条件从一组在等渗和高渗缓冲液中孵育的细胞中收集细胞内细胞术测量值。

细胞外渗透压对胞吐活性的影响表示为当嗜铬细胞在等渗、高渗和最后等渗条件下用钡溶液刺激嗜血细胞时胞吐作用事件的频率。该数据显示，经历渗透应激的细胞的胞吐活性受到抑制，并且在细胞返回等渗环境后可以实现部分恢复。对照实验显示了在等渗条件下嗜铬细胞连续三次钡刺激后胞吐作用事件的频率。

这表明在这些实验中使用的时间范围内多次钡刺激导致连续细胞刺激导致胞吐活性降低。观看此视频后，您应该对如何执行这些互补的分析方法有很好的了解，这些方法允许您比较分泌囊泡和胞吐过程如何受到细胞外环境变化的影响。