监测渗透压胁迫对分泌囊泡及胞吐作用的影响

本综合分析方法的总体目标是提供有关细胞内分泌囊泡如何响应物理力（如细胞外渗透压）的信息，以及这些细胞器的调整如何进一步影响胞吐过程。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如：分泌囊泡如何直接响应细胞外环境的变化或药物处理？该方法的主要优势在于能够在活细胞中实时监测对囊泡内容物的直接影响，并能够区分在胞吐作用处理前后其理化释放特性的改变。

为了获得平整的圆盘电极表面，将电极放入微型研磨仪的电极夹持器中，并将每根碳纤维电极以45度角进行斜面打磨。随后，在毛细管上做标记，以便后续参考，从而在将电极置于细胞附近进行胞吐测量时，能够准确定位呈45度角的圆盘电极表面。为了对单个细胞进行安培记录，需将新打磨并测试过的碳纤维圆盘微电极安装在与恒电位仪配套使用的探头阶段（head stage）的电极夹持器中。

使用前，将每根碳纤维微电极置于测试溶液中，采用循环伏安法监测其研究状态电流。进行循环伏安扫描时，相对于银-氯化银参比电极施加从负0.2伏至正0.8伏的三角波电位，扫描速率为100毫伏每秒，以确保良好的反应动力学。进行胞吐作用的安培法记录时，将含有培养的嗜铬细胞的培养皿置于等渗缓冲液中，并放置于法拉第笼内的倒置显微镜下。

在细胞实验过程中，使用显微镜加热台维持 37 摄氏度的温度。接下来，使用低噪声膜片钳仪器，在工作电极上施加 +700 毫伏的恒定电位。记录嗜铬细胞的胞吐作用时，以 10 千赫兹对信号进行数字化，并应用截止频率为 2 千赫兹的内部低通贝塞尔滤波器对记录信号进行滤波。

请注意，椭圆形盘状电极必须平整地放置在细胞上方，并与培养皿表面平行。此外，电极需在实验当天进行斜面打磨，以确保电极表面清洁。为刺激细胞胞吐作用，将一支充满5毫摩尔氯化钡溶液的玻璃微电极置于距离细胞至少20微米的位置。

然后，在细胞表面施加持续五秒的5毫摩尔氯化钡溶液注射脉冲，以刺激细胞胞吐作用。将干细胞移液管置于溶液中，在施加钡离子注射脉冲的同时记录约三分钟的安培电流瞬变信号，以刺激细胞胞吐作用。为了比较等渗条件下与高渗条件下的胞吐反应，将细胞在高渗缓冲溶液中孵育10分钟。

随后，施加一次钡离子注射脉冲以刺激胞吐作用，并进行三分钟的安培法记录。对于细胞的可逆反应，将细胞再次置于等渗缓冲液中孵育10分钟。通过施加钡离子注射脉冲刺激细胞，并记录三分钟的胞吐反应。

为进行囊泡量子大小测量的电极制备，准备一根直径为五微米的碳纤维电极。在显微镜下，使用解剖刀切割从玻璃尖端伸出的碳纤维，使其仅保留30至100微米。使用丁烷火焰制备经火焰蚀刻的碳纤维电极尖端。

为了获得均匀蚀刻且呈圆柱形的电极尖端，应手持圆柱形碳纤维电极并同时进行旋转。将从玻璃管中伸出的碳纤维置于丁烷火焰的蓝色边缘，直至碳纤维尖端呈现红色。火焰蚀刻后，将电极置于显微镜下评估电极尖端的形态。

刻蚀后的电极尖端直径应约为50至100纳米。接下来，将圆柱形纳米尖端微电极插入环氧树脂溶液中3分钟，随后将电极尖端浸入丙酮溶液中15秒。这一步可使环氧树脂密封碳纤维与绝缘玻璃毛细管壁之间可能存在的间隙。

当丙酮清除蚀刻后的碳纤维电极表面的环氧树脂时，将电极在100摄氏度的烘箱中烘烤过夜以固化环氧树脂。使用前，采用循环伏安法测试每个碳纤维微电极的稳态电流。

进行实验时，仅使用电流在1.5至2.5纳安左右达到稳定平台期的电极。进行细胞内安培法测量时，将细胞置于显微镜下，并使用与恒电位仪相同的实验设置。避免对细胞造成明显的物理损伤。

通过施加轻微的机械力，使用显微操作器将纳米尖圆柱形微电极插入细胞，力度以刚好推动电极穿过细胞质膜并进入细胞质为宜。插入后，待细胞膜在圆柱形电极周围密封，立即在活细胞上开始原位安培记录。

在施加于电极的氧化电位下，囊泡会吸附到电极表面并发生随机破裂。因此，无需任何外界刺激即可启动该过程。为确定渗透压对囊泡量子大小的影响，需在等渗和高渗缓冲液中孵育一组细胞，并利用实验条件采集细胞内流式分析测量数据。

胞外渗透压对胞吐活性的影响以嗜铬细胞在等渗、随后高渗、最后再次等渗条件下用钡溶液刺激时的胞吐事件频率来表示。该数据表明，在经历渗透应激的细胞中，胞吐活性受到抑制，当细胞重新回到等渗环境后，可实现部分恢复。对照实验显示了在等渗条件下，嗜铬细胞连续三次经钡刺激后的胞吐事件频率。

这表明，在本实验所采用的时间范围内进行多次钡离子刺激，会因连续刺激细胞而导致胞吐活性降低。观看本视频后，您应能充分掌握如何实施这些互补的分析方法，从而能够比较细胞外环境改变对分泌囊泡及胞吐过程的影响。