细胞膜突起的表征及其在癌细胞黏附动力学中作用的研究

总体目标是确定实验性改变对细胞突起谱系的影响，以及其与癌症中细胞黏附功能的关系。该方法有助于识别细胞膜突起谱系在调控细胞行为（如细胞黏附、运动性和侵袭性）中的关键作用。该技术的主要优势在于操作相对简便，且可轻松适应多种实验条件。

该技术的意义延伸至局部晚期或转移性癌症的治疗与诊断，因为它有助于精确量化与肿瘤细胞黏附和侵袭能力改变相关的细胞突起谱型变化。该方法也可应用于其他系统，例如离子通道调控，其在细胞突起形成及正常生理过程中发挥重要作用。对该方法进行可视化演示和记录至关重要，因为细胞突起步骤的计数由于其形态在某些时刻较为细微而难以掌握。

成像前一天，使用血细胞计数板对在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养的SW 13、SW Neo和SW DKK3细胞进行计数。将无菌玻璃盖玻片放入3个六孔板的各个孔中。每种细胞系使用单独的六孔板，并以每孔5,000个细胞的密度将这三种细胞系分别接种至六孔板中。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中过夜。次日，从每个孔中吸除生长培养基。随后，用1毫升预热的PBS洗涤细胞。

随后，向每个孔中加入1毫升3.7%的甲醛以固定细胞。将细胞置于固定液中10分钟。固定完成后，吸除甲醛溶液。

每孔加入一毫升0.05%结晶紫溶液，染色30分钟。随后，用去离子水每孔一毫升洗涤细胞三次，以去除多余的染料。接着，在已标记的玻璃载片上滴加一滴透明封片剂。

然后，使用尖头镊子轻轻取出盖玻片，将盖玻片有样品的一面朝下覆盖在封片剂上。将所有染色后的盖玻片封片后，在光学显微镜下从每张盖玻片中随机选择20个无重叠的细胞视野。对每个视野拍摄400倍放大倍数的显微照片。

然后，观察并统计20个代表性细胞中每种突起类型的数量。根据定义和文本方案，将细胞膜突起分类为丝状伪足、泡状伪足或片状伪足。初次计数细胞突起类型时，建议准备参考图像以便随时查阅。

如果可能，应对实验样本进行盲法计数，以提供额外的客观性。确定所检测的三种细胞系中每种细胞膜突起类型的平均每细胞数量。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验不同细胞类型间细胞膜突起平均百分比的差异是否具有统计学显著性。

实验前一天，使用血细胞计数板对 SW 13、SW Neo 和 SW DKK3 细胞进行计数。将这些细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种至 6 孔板中，每个指定的时间点各使用一块 6 孔板，共需六块板。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中过夜培养。

第二天，从培养箱中取出培养板，用预热的 PBS 洗涤细胞一次。然后，向每孔加入 0.5 毫升单倍浓度的非酶细胞解离溶液。轻轻摇动培养板，使加入的溶液均匀分布。

将培养板与溶液在规定时间内孵育。在每个时间点结束时，吸除指定培养板中的溶液。每次吸液后尽快用一毫升温热的PBS洗涤细胞。

轻轻敲击培养板以去除松散附着的细胞。重复洗涤并间歇轻敲，共进行三次。最后，吸去残留的 PBS，并用 1 毫升 3.7% 多聚甲醛固定仍附着在培养板上的细胞。

固定完成后，吸除甲醛。然后，向每个孔中加入1毫升0.05%的结晶紫溶液以染色细胞。染色完成后，用去离子水每孔1毫升洗涤细胞三次，每次洗涤以去除多余的染料。

使用光学显微镜在100倍放大倍数下，对每块培养板的每个孔中剩余的贴壁细胞进行计数。然后确定在不同时间点，三种经测试细胞系中保持悬浮（未贴壁）的细胞百分比。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）检验三种细胞系间细胞脱落差异及脱落速率的统计学显著性。

经结晶紫染色的对照组SW 13和SW Neo细胞主要形成丝状伪足和片状伪足。相比之下，表达DKK3的细胞则更多形成叶状伪足，几乎完全缺乏片状伪足，且丝状伪足极少。此外，请注意表达DKK3的细胞与对照细胞系在极性方面的差异。

该图显示了在三种受试细胞系中不同细胞突起的比例。注意，DKK3 表达细胞中叶状伪足的比例显著更高。折线图显示了在用解离液处理后，在 X 轴所示时间点仍附着在培养板上的细胞百分比。

在长达10分钟的所有时间点上，表达DKK3的细胞均表现出显著高于对照细胞的细胞黏附强度。一旦掌握，只要操作得当，根据实验设置的不同，该技术可在一至两天内完成。在执行该操作过程中，重要的是要记住评估细胞伸展形态的变化如何影响其黏附能力。

观看本视频后，您应能够充分理解如何根据癌细胞黏附特性的变化，准确量化细胞突起。祝您实验顺利，感谢观看。