Name: 细胞膜延伸特性及其在癌细胞黏附动力学中的作用研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 了解定量测量细胞膜延伸的方法，用于研究肾上腺皮质癌细胞中DKK3促进伪足形成与细胞黏附的机制。该技术简单且易于适应多种实验条件，有助于深入理解肿瘤细胞行为。

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Ohse 基金会资助了本项工作。

1. 细胞延伸特性
<ol>
	<li>在37.0 °C、5% CO₂的恒温湿化培养箱中培养SW-13、SW-Neo和SW-DKK3细胞2 在添加了10%胎牛血清和10,000 U/mL青霉素与链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中（称为“生长培养基”）。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，将SW-13、SW-Neo和SW-DKK3细胞系分别以每孔5,000个细胞接种于不同的6孔板中，并在无菌玻璃盖玻片上用生长培养基培养过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过夜培养后，对于每个孔，吸除培养基，用1 mL温热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入1 mL 3.7%甲醛固定细胞10分钟。</li>
	<li>吸弃甲醛，每孔加入1 mL 0.05% 结晶紫染色30分钟。用1 mL去离子水洗涤3次，洗去多余染料。 
	注意：根据染料摄取程度的不同，可能需要进行多次额外洗涤，以去除背景染色，促进细胞观察。
	<ol>
		<li>用尖头镊子取出盖玻片，将其有样品的一面朝下，置于已标记的载玻片上，载玻片上预先滴加一滴透明封片剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在光学显微镜下，从每张盖玻片中随机选取20个无重叠的细胞视野进行细胞伸展实验。
	<ol>
		<li>在400倍放大倍数下拍摄每个视野的显微照片。直接计数20个代表性细胞中每种突起类型的数量。 
		注意：每种测试条件下应检测20个分离的细胞，以确保结果可靠。丝状伪足定义为基部宽度不超过5微米且具有单一顶端的细胞突起。叶状伪足定义为基部宽度在5至20微米之间、包含多个顶端的细胞突起。片状伪足定义为长度大于20微米、可具有或不具有顶端的细胞突起。根据所测试的细胞类型不同，细胞突起的尺寸可能有所差异，可能需要调整识别参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定每种细胞类型中每种细胞突起的平均数量即，SW-13、SW-Neo、SW-DDK）在所检测的6个孔中。</li>
	<li>采用单因素方差分析（ANOVA）统计检验方法，比较不同测试细胞类型之间细胞膜突起平均百分比的差异。</li>
</ol>
2. 黏附实验
<ol>
	<li>在标准的加湿培养箱中，于37.0 °C和5% CO₂条件下培养SW-13、SW-Neo和SW-DKK3细胞2 在生长培养基中。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板对SW-13、SW-Neo和SW-DKK3细胞进行计数，分别将100,000个细胞接种至6孔板的不同孔中，每种细胞一孔，加入生长培养基过夜培养。</li>
		<li>为每种待测细胞类型接种6孔板，每块板用于下方指定的6个时间点之一。 
		注意：不同细胞类型的时间点可能有所不同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过夜孵育后，用预热的PBS洗涤细胞一次，然后向每孔加入0.5 mL 1×非酶细胞解离液。
	<ol>
		<li>轻轻晃动培养板以均匀分布细胞解离液。在指定时间点吸取相应培养板中的液体。即， 1、2、3、5、10 和 15 分钟），然后用 1 mL 温热的 PBS 溶液洗涤三次。</li>
		<li>洗涤间隙，轻轻敲击培养板以去除松散附着的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸去残留的 PBS，加入 1 mL 3.7% 多聚甲醛固定仍贴壁于培养板上的细胞，孵育 10 分钟。</li>
	<li>用1 mL 0.05% 结晶紫染色细胞30分钟，然后用1 mL去离子水洗去多余染料。滴加洗涤液以促进细胞观察。 
	注意：根据染料摄取程度的不同，可能需要进行多次额外洗涤以促进细胞观察。</li>
	<li>在100倍放大倍数的光学显微镜下，对每块培养板的每个孔中剩余贴壁的细胞进行计数。 
	注意：在培养板底部使用透明直尺或细线笔标记指引线，有助于避免对同一细胞重复计数。</li>
	<li>测定每块培养板每个孔中贴壁细胞的平均数量。</li>
	<li>使用双因素方差分析（two-way ANOVA）统计检验方法，比较SW-13、SW-Neo和SW-DDK3细胞在给定时间内的细胞脱落速率。</li>
</ol>

<ol><li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+cancer%3A+pathophysiology+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li>
<li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer%3A+the+emerging+role+of+Dickkopf-3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297(2016).</li>
<li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin%3A+Invasive+filopodia+promoting+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li>
<li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87(2013).</li>
<li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164(2017).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此我们描述一种 体外 一种可轻松、可靠且重复性好地表征细胞突起的定量方法，适用于多种实验条件。此外，还可同时进行简单且可量化的黏附和/或运动能力检测，以关联分析细胞膜突起形态改变的潜在功能意义。
然而，这些方法可能存在一些潜在的局限性。首先，本文中用于识别不同类型细胞突起的标准基于肾上腺皮质 SW-13 细胞的形态，因此在应用于其他细胞类型和/或实验条件时，可能需要对分类参数进行进一步优化。此外，在长时间进程实验中，还需考虑细胞膜突起变化对细胞周期和细胞死亡的潜在影响。
其次，该实验方案可能依赖于检测人员的主观判断，由于不同观察者之间的差异，这可能会限制实验的可重复性。通过增加每组检测的细胞数量，可在一定程度上克服此类偏差；具体而言，当每次实验检测20个细胞时。建议由多名人员以盲法进行端粒长度判断，以减轻潜在的主观判断偏差。
最后，在将细胞突起类型转换与黏附特性改变相关联时应谨慎，因为黏附特性的简化表现可能是由于对黏附底物的偏好性发生改变，而非对所测试...

WNT 信号通路的异常调控在肾上腺皮质恶性肿瘤中发挥关键作用1。本研究采用的方法旨在探讨 DKK3（WNT 信号通路的负向调控因子）的沉默是否代表肾上腺皮质中的一种去分化事件，并在细胞延伸能力谱改变的背景下促进肿瘤形成。DKK3 是一种分子量为 38 kDa 的分泌型糖蛋白，具有 N 端信号肽；既往研究表明，其强制表达可导致细胞周期阻滞，抑制侵袭性恶性行为，并逆转上皮-间质转化2。
肾上腺皮质癌（ACC）及其他癌症的恶性行为在一定程度上受到肿瘤细胞与周围表面（包括细胞外基质）相互作用能力的影响，这种相互作用进而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移3。特定细胞膜突起在癌症进展中的作用已在多种背景下得到 increasingly 的证实，主要通过丝状伪足（filopodia）的形成实现。例如，L型钙通道的过表达已被发现可诱导丝状伪足形成并促进肿瘤细胞侵袭4。类似地，在正常组织中表达水平较低的肌动蛋白结合蛋白Fascin，在癌细胞中也呈过表达，并与丝状伪足的形成相关5。小叶状伪足（lobopodia）的形成使非恶性成纤维细胞能够有效穿过细胞外基质，然而研究发现，纤维肉瘤细胞则依赖金属蛋白酶活性而非小叶状伪足来促进细胞迁移和侵袭6。我们已证实，包括Ras结合结构域家族1A亚型（RASSF1A）和DKK3在内的肿瘤抑制因子，可通过改变细胞骨架成分促进片状伪足（lamellipodia）的形成，并抑制细胞的侵袭特性7,8。
因此，表征参与致癌过程的基因效应及其与细胞膜突起结构改变之间的关系至关重要，特别是在实验条件下对丝状伪足、块状伪足和片状伪足的形成进行具体评估。目前最先进的技术包括使用日益复杂的显微成像方法、荧光标记和/或复杂的数据采集与解释用计算机算法。尽管这些方法提供了新颖且强大的分析工具，但其复杂性限制了其在细胞生物学实验中的广泛应用与适应性。此外，对细胞突起形态变化的精确定量与观察通常并未被常规测量9,10。相比之下，本文介绍一种利用常规显微镜技术和易于推广的体外（in vitro）方法，准确量化细胞突起变化的技术。该方法可对每个被分析细胞的各种细胞突起类型同时进行定量，并确定细胞膜突起谱系的整体变化。我们还展示了这些变化如何与细胞黏附特性相关联。
作为实验示例，我们将使用先前构建的SW-13细胞系，命名为SW-DDK3，该细胞系通过pCMV6-Entry/DKK3质粒载体稳定转染，能够持续过表达DKK3，即肾上腺中的一种分化因子。未转染的SW-13细胞以及稳定转染空载体（pCMV6-Entry）的SW-13细胞（命名为SW-Neo）将作为实验对照。

<table><tbody><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>ThermoFisher</td><td>11965-092</td><td>添加胎牛血清、青霉素和链霉素</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>1X 溶液，直接使用</td></tr><tr><td>3.7% 甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>稀释储备液</td></tr><tr><td>0.05% 结晶紫&amp;nbsp;</td><td>Harleco</td><td>192-12</td><td>稀释储备液</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>具有 400X 放大倍数的显微镜&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>NA</td></tr><tr><td>非酶细胞解离液 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5914&amp;nbsp;</td><td>1X 溶液，直接使用</td></tr></tbody></table>

细胞膜突起的表征及其在癌细胞黏附动力学中作用的研究

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

细胞膜的突起类型调控着癌细胞的多种恶性行为，包括其黏附和迁移能力。准确分类并量化细胞突起，以及测量其对细胞黏附能力影响的方法，对于确定细胞信号传导事件如何影响癌细胞行为和侵袭性至关重要。本文描述了 体外 设计并使用一种细胞延伸量化方法，结合已建立的黏附能力检测方法 体外 肾上腺皮质癌（ACC）的细胞模型。具体而言，我们检测了DKK3（一种假定的肿瘤抑制因子和促分化因子）对ACC细胞系SW-13膜突起表型的影响。我们建议采用这些检测方法，以在不同实验条件下提供相对简单、可靠且易于解释的指标来评估这些特征。

利用上述检测方法，在已建立的ACC细胞系SW-13中检测了DKK3过表达对细胞突起形态及细胞黏附特性的影响， 体外通过将Myc-DDK标记的pCMV6-Entry/DKK3质粒载体稳定转染SW-13细胞，构建过表达DKK3的细胞系，并命名为SW-DKK3。同样，将空载体pCMV6-Entry稳定转染SW-13细胞，作为转染与传代对照，定义为SW-Neo。SW-13细胞则作为额外的亲本细胞对照。采用定量实时PCR和蛋白质印迹技术验证SW-DKK3细胞中DKK3的过表达情况8.
简言之，将待测细胞 SW-13、SW-Neo 和 SW-DKK3 在6孔板中的盖玻片上培养过夜。随后用甲醛固定细胞，并用结晶紫染色。根据上述参数，在显微镜下对细胞突起特征进行定量分析。分析结果显示，SW-DKK3 细胞表现出更分化的表型，表现为叶状伪足增多及多向细胞极性增强（p=0.01，单因素方差分析，<stron...

本研究展示了定量测量细胞膜延伸的实用性和简便性，及其与细胞黏附能力的相关性。作为代表性示例，我们在此表明，Dickkopf 相关蛋白 3（DKK3）可促进肾上腺皮质癌细胞中 Lobopodia 的形成增加以及细胞黏附性的增强 体外.

细胞膜突起的多样性调控着癌细胞的多种恶性行为，包括其黏附和迁移能力。

总体目标是确定实验性改变对细胞突起谱系的影响，以及其与癌症中细胞黏附功能的关系。该方法有助于识别细胞膜突起谱系在调控细胞行为（如细胞黏附、运动性和侵袭性）中的关键作用。该技术的主要优势在于操作相对简便，且可轻松适应多种实验条件。该技术的意义延伸至局部晚期或转移性癌症的治疗与诊断，因为它有助于精确量化与肿瘤细胞黏附和侵袭能力改变相关的细胞突起谱型变化。该方法也可应用于其他系统，例如离子通道调控，其在细胞突起形成及正常生理过程中发挥重要作用。对该方法进行可视化演示和记录至关重要，因为细胞突起步骤的计数由于其形态在某些时刻较为细微而难以掌握。成像前一天，使用血细胞计数板对在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养的SW 13、SW Neo和SW DKK3细胞进行计数。将无菌玻璃盖玻片放入3个六孔板的各个孔中。每种细胞系使用单独的六孔板，并以每孔5,000个细胞的密度将这三种细胞系分别接种至六孔板中。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中过夜。次日，从每个孔中吸除生长培养基。随后，用1毫升预热的PBS洗涤细胞。随后，向每个孔中加入1毫升3.7%的甲醛以固定细胞。将细胞置于固定液中10分钟。固定完成后，吸除甲醛溶液。每孔加入一毫升0.05%结晶紫溶液，染色30分钟。随后，用去离子水每孔一毫升洗涤细胞三次，以去除多余的染料。接着，在已标记的玻璃载片上滴加一滴透明封片剂。然后，使用尖头镊子轻轻取出盖玻片，将盖玻片有样品的一面朝下覆盖在封片剂上。将所有染色后的盖玻片封片后，在光学显微镜下从每张盖玻片中随机选择20个无重叠的细胞视野。对每个视野拍摄400倍放大倍数的显微照片。然后，观察并统计20个代表性细胞中每种突起类型的数量。根据定义和文本方案，将细胞膜突起分类为丝状伪足、泡状伪足或片状伪足。初次计数细胞突起类型时，建议准备参考图像以便随时查阅。如果可能，应对实验样本进行盲法计数，以提供额外的客观性。确定所检测的三种细胞系中每种细胞膜突起类型的平均每细胞数量。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验不同细胞类型间细胞膜突起平均百分比的差异是否具有统计学显著性。实验前一天，使用血细胞计数板对 SW 13、SW Neo 和 SW DKK3 细胞进行计数。将这些细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种至 6 孔板中，每个指定的时间点各使用一块 6 孔板，共需六块板。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中过夜培养。第二天，从培养箱中取出培养板，用预热的 PBS 洗涤细胞一次。然后，向每孔加入 0.5 毫升单倍浓度的非酶细胞解离溶液。轻轻摇动培养板，使加入的溶液均匀分布。将培养板与溶液在规定时间内孵育。在每个时间点结束时，吸除指定培养板中的溶液。每次吸液后尽快用一毫升温热的PBS洗涤细胞。轻轻敲击培养板以去除松散附着的细胞。重复洗涤并间歇轻敲，共进行三次。最后，吸去残留的 PBS，并用 1 毫升 3.7% 多聚甲醛固定仍附着在培养板上的细胞。固定完成后，吸除甲醛。然后，向每个孔中加入1毫升0.05%的结晶紫溶液以染色细胞。染色完成后，用去离子水每孔1毫升洗涤细胞三次，每次洗涤以去除多余的染料。使用光学显微镜在100倍放大倍数下，对每块培养板的每个孔中剩余的贴壁细胞进行计数。然后确定在不同时间点，三种经测试细胞系中保持悬浮（未贴壁）的细胞百分比。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）检验三种细胞系间细胞脱落差异及脱落速率的统计学显著性。经结晶紫染色的对照组SW 13和SW Neo细胞主要形成丝状伪足和片状伪足。相比之下，表达DKK3的细胞则更多形成叶状伪足，几乎完全缺乏片状伪足，且丝状伪足极少。此外，请注意表达DKK3的细胞与对照细胞系在极性方面的差异。该图显示了在三种受试细胞系中不同细胞突起的比例。注意，DKK3 表达细胞中叶状伪足的比例显著更高。折线图显示了在用解离液处理后，在 X 轴所示时间点仍附着在培养板上的细胞百分比。在长达10分钟的所有时间点上，表达DKK3的细胞均表现出显著高于对照细胞的细胞黏附强度。一旦掌握，只要操作得当，根据实验设置的不同，该技术可在一至两天内完成。在执行该操作过程中，重要的是要记住评估细胞伸展形态的变化如何影响其黏附能力。观看本视频后，您应能够充分理解如何根据癌细胞黏附特性的变化，准确量化细胞突起。祝您实验顺利，感谢观看。

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