毛细管阵列中多核酸的视觉检测
November 15th, 2017
该协议描述了一个小的, 现成的卡带的制作, 可用于视觉检测的多个核酸在一个单一的测试, 这是易于操作。在这种方法中, 用毛细管阵列对转基因生物的目标进行多重和高效的检测。
该程序的总体目标是制造一个小型的、即用型的盒，该盒可用于在单个、易于作的测试中对多个核酸进行视觉检测。该方法可以帮助回答多重核酸检测领域的关键问题，例如转基因生物或 GMO 检测。要清洁毛细管，请穿上实验室制服、护目镜和化学防护手套。
将毛细管放入烧杯中。用 30 毫升丙酮清洁毛细管 5 分钟，以去除有机物。然后，用去离子水清洗毛细管。
接下来，将约 10 毫升过氧化氢倒入烧杯中，制备食人鱼溶液。然后，将 30 毫升硫酸加入过氧化氢中，缓慢摇晃以防止过热。确保溶液完全覆盖毛细管至少 30 分钟。
然后，用大量水洗去食人鱼溶液。用乙醇和去离子水清洗毛细管，每个毛细管 5 分钟。在烘箱中干燥毛细管。
接下来，在 50 毫升试管中以一一的比例称量 PDMS 碱剂和齿轮试剂。通常，将 5 克弹性体基与 5 克弹性体固化剂混合。用玻璃棒将混合物充分搅拌约 5 分钟。
将装有 PDMS 的烧杯放入真空钟罩中 30 分钟进行脱气。然后，将 PDMS 缓慢倒入不锈钢模具的圆筒中。让 PDMS 在 60 摄氏度的干燥箱中固化 3 小时。
PDMS 固化后，用圆柱拉出模具，去除模具。用手术刀切开模具的边缘，从圆筒中取出 PDMS。用乙醇和去离子水洗涤 PDMS 3 次。
然后，用氮气干燥 PDMS 载体。将 PDMS 支撑物浸泡在超级疏水涂层中 1 秒钟，将 PDMS 支撑物的下表面处理为疏水物。然后，在室温下干燥 10 分钟。
接下来，将清洁后的 4 毫米毛细管插入 PDMS 支架的孔中，将毛细管的零点 5 毫米留在 PDMS 支架顶面之外。确保毛细管的末端位于同一水平面上。要将毛细管的外表面和 PDMS 支架的顶面处理成疏水涂层，请在 PDMS 支架表面的顶部添加 15 微升的超疏水涂层。
风干超疏水性改性毛细管阵列。接下来，根据预先设计的顺序，加入一组引物的 1 点 6 微升引物固定混合物，以填充毛细管阵列的一个相应毛细管。将阵列固定在标准平底 96 孔板的透明孔中，并在 60 摄氏度下干燥阵列至少两小时。
要组装盒，请将加载适配器放在锚定阵列的顶部。确保适配器的培养皿刚好覆盖所有 10 个毛细管的外露部分。要制备 LAMP 反应混合物，请根据文本方案向混合物中加入试剂，并在加入钙嘧啶后涡旋反应混合物 5 秒。
加入 Bst 聚合酶后，轻轻倒置试管 20 次。在处理 LAMP 混合物之前，用每升盐酸 1 摩尔清洁，可以消除环境中存在的痕量 DNA。用标准的 100 μL 吸头吸出 20 μL 的 LAMP 反应混合物。
将吸头插入上样适配器的入口以将其锁定。将反应混合物轻轻注入接头培养皿中。反应混合物将快速填充培养皿，然后通过毛细管力自动加载毛细管。
用锁定尖端取下接头，并用兼容 PCR 的透明密封膜密封孔。然后，将毛细管阵列在 63 摄氏度的培养箱中孵育 1 小时。要获取荧光发射的图像，请使用紫外手电筒激发解离的钙嘧啶以发射荧光。
通过数码相机或智能手机从毛细管阵列顶部捕获图像。拍摄图像时，请确保相机尽可能放大毛细管区域，以获得高质量、清晰的图像。接下来，通过图像分析软件打开图像。
然后选择图像、模具、灰度、yes 和图像、模具、16 位、yes。选择文件、另存为、格式、TIFF，以将图像转换为 16 位 TIFF 格式。要提取荧光强度的值，请打开微阵列分析软件。
将 16 位 TIFF 格式的图像拖到软件的界面中，然后选择 532 纳米的波长和绿色的颜色来显示图像。然后，创建一个新块以定位来自毛细管的荧光信号。选择 tools、new blocks，然后将列数和行数分别放在 blocks 和 features 界面中 1 对 1 和 2 到 5。
右键单击并选择特征模型。然后，调整位置和直径以适合毛细管的荧光区域。选择 analyze 以提取荧光强度的值。
最后，选择 file ， save settings as，以保存块的文档。然后，选择、归档、保存结果以保存荧光强度结果。此处显示的是毛细管阵列的布局。
毛细管 1 到 8，前缀为 LAMP 引物组。毛细管 9 和 10 代表 2，无引物对照。此处显示的是用于检测转基因玉米 MON863 的荧光照片，其中绿色表示 LAMP 阳性扩增。
扩增成功，仅存在于预期的毛细管 1、6、7 和 8 中，在空白毛细管中没有污染。这张荧光照片用于检测 GMO 混合物。绿色表示 LAMP 扩增阳性。
仅在预期的毛细管 1、4、5、6、7 和 8 中成功扩增，在空白毛细管中没有污染。此处显示的荧光照片用于检测非转基因玉米，绿色表示 LAMP 扩增阳性。成功的扩增仅出现在预期的毛细管 8 中，并且在空白毛细管中没有污染。
一旦掌握，如果执行得当，这个检测程序可以在一个 5 小时内完成。看完这个视频，您应该对如何制作基于毛细管的盒进行多核酸检测有了很好的了解。
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概述
本协议描述了用于在单一、易于操作的测试中进行多核酸视觉检测的小型、即用型盒子的制作。该方法特别适用于使用毛细管阵列进行多重检测的转基因生物（GMO）的检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 分子生物学
- 基因工程
背景
- 多核酸的检测在各个领域中至关重要。
- 转基因生物（GMO）对食品安全提出了重大挑战。
- 需要高效的检测方法以进行快速分析。
- 毛细管阵列可以增强多重检测能力。
研究目的
- 开发一种用于核酸检测的用户友好盒子。
- 提高转基因生物检测的效率。
- 促进多重核酸检测的研究。
所用方法
- 制作小型核酸检测盒。
- 使用毛细管阵列进行多重检测。
- 用丙酮和去离子水清洁毛细管。
- 视觉检测方法以便于使用。
主要结果
- 盒子可以同时检测多种核酸。
- 毛细管阵列提高了检测过程的效率。
- 该方法简单直接且用户友好。
- 在转基因生物检测和其他领域的潜在应用。
结论
- 本协议提供了一种新颖的核酸检测方法。
- 开发的盒子适用于多重测试。
- 未来的研究可以扩展其在生物技术领域的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This platform enables multiplex nucleic acid detection in a single cassette, supporting high-throughput screening needs in GMO testing and microbial monitoring. By combining capillary array technology with LAMP amplification, it reduces assay complexity and resource requirements while maintaining specificity and sensitivity. The visual readout via UV illumination allows rapid, instrument-free results, aligning with decentralized testing demands in biopharma and agricultural biotechnology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables simultaneous interrogation of multiple genetic targets for hypothesis testing in pathway analysis.
- Operational Value: Reduces reagent consumption and hands-on time through capillary-force-driven sample loading.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, isolated reaction chambers for reproducible amplification across targets.
- Operational Value: Supports parallel processing of up to eight assays with internal controls for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of genetically modified elements in complex matrices, supporting GMO safety assessment.
- Operational Value: Enables field-deployable testing with minimal equipment, suitable for process monitoring in biomanufacturing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where rapid nucleic acid profiling informs target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Allows parallel testing of gene variants or constructs to clarify functional roles in biological pathways.
- Screening: Generates quantitative fluorescence intensity data for hit confirmation and cross-capillary comparison.
- Analytics: Outputs enable signal threshold setting and contamination assessment via blank capillary controls.
- Translational Research: Supports continuity from target identification to preclinical validation through consistent nucleic acid readouts.
- Enterprise Reuse: Cassette design allows reuse across multiple nucleic acid panels with reconfiguration of primer sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in multiplex assays by minimizing cross-talk and false positives.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized capillary preparation and isolated reaction volumes.
- Strategic Value: Reduces time-to-result for critical decision points in GMO detection and microbial monitoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on simultaneous multi-parameter readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface treatment and capillary array assembly for hydrophobic/hydrophilic patterning.
- Depends on access to vacuum degassing and thermal curing equipment for PDMS microfluidic fabrication.
- Necessitates standardization of primer fixation protocols across capillary arrays for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending beyond eight targets due to capillary array limitations.
- Relies on user training for consistent UV excitation and image capture to ensure fluorescence quantification accuracy.
