Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array
2017年11月15日
This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.
该程序的总体目标是制造一个小型的、即用型的盒，该盒可用于在单个、易于作的测试中对多个核酸进行视觉检测。该方法可以帮助回答多重核酸检测领域的关键问题，例如转基因生物或 GMO 检测。要清洁毛细管，请穿上实验室制服、护目镜和化学防护手套。
将毛细管放入烧杯中。用 30 毫升丙酮清洁毛细管 5 分钟，以去除有机物。然后，用去离子水清洗毛细管。
接下来，将约 10 毫升过氧化氢倒入烧杯中，制备食人鱼溶液。然后，将 30 毫升硫酸加入过氧化氢中，缓慢摇晃以防止过热。确保溶液完全覆盖毛细管至少 30 分钟。
然后，用大量水洗去食人鱼溶液。用乙醇和去离子水清洗毛细管，每个毛细管 5 分钟。在烘箱中干燥毛细管。
接下来，在 50 毫升试管中以一一的比例称量 PDMS 碱剂和齿轮试剂。通常，将 5 克弹性体基与 5 克弹性体固化剂混合。用玻璃棒将混合物充分搅拌约 5 分钟。
将装有 PDMS 的烧杯放入真空钟罩中 30 分钟进行脱气。然后，将 PDMS 缓慢倒入不锈钢模具的圆筒中。让 PDMS 在 60 摄氏度的干燥箱中固化 3 小时。
PDMS 固化后，用圆柱拉出模具，去除模具。用手术刀切开模具的边缘，从圆筒中取出 PDMS。用乙醇和去离子水洗涤 PDMS 3 次。
然后，用氮气干燥 PDMS 载体。将 PDMS 支撑物浸泡在超级疏水涂层中 1 秒钟，将 PDMS 支撑物的下表面处理为疏水物。然后，在室温下干燥 10 分钟。
接下来，将清洁后的 4 毫米毛细管插入 PDMS 支架的孔中，将毛细管的零点 5 毫米留在 PDMS 支架顶面之外。确保毛细管的末端位于同一水平面上。要将毛细管的外表面和 PDMS 支架的顶面处理成疏水涂层，请在 PDMS 支架表面的顶部添加 15 微升的超疏水涂层。
风干超疏水性改性毛细管阵列。接下来，根据预先设计的顺序，加入一组引物的 1 点 6 微升引物固定混合物，以填充毛细管阵列的一个相应毛细管。将阵列固定在标准平底 96 孔板的透明孔中，并在 60 摄氏度下干燥阵列至少两小时。
要组装盒，请将加载适配器放在锚定阵列的顶部。确保适配器的培养皿刚好覆盖所有 10 个毛细管的外露部分。要制备 LAMP 反应混合物，请根据文本方案向混合物中加入试剂，并在加入钙嘧啶后涡旋反应混合物 5 秒。
加入 Bst 聚合酶后，轻轻倒置试管 20 次。在处理 LAMP 混合物之前，用每升盐酸 1 摩尔清洁，可以消除环境中存在的痕量 DNA。用标准的 100 μL 吸头吸出 20 μL 的 LAMP 反应混合物。
将吸头插入上样适配器的入口以将其锁定。将反应混合物轻轻注入接头培养皿中。反应混合物将快速填充培养皿，然后通过毛细管力自动加载毛细管。
用锁定尖端取下接头，并用兼容 PCR 的透明密封膜密封孔。然后，将毛细管阵列在 63 摄氏度的培养箱中孵育 1 小时。要获取荧光发射的图像，请使用紫外手电筒激发解离的钙嘧啶以发射荧光。
通过数码相机或智能手机从毛细管阵列顶部捕获图像。拍摄图像时，请确保相机尽可能放大毛细管区域，以获得高质量、清晰的图像。接下来，通过图像分析软件打开图像。
然后选择图像、模具、灰度、yes 和图像、模具、16 位、yes。选择文件、另存为、格式、TIFF，以将图像转换为 16 位 TIFF 格式。要提取荧光强度的值，请打开微阵列分析软件。
将 16 位 TIFF 格式的图像拖到软件的界面中，然后选择 532 纳米的波长和绿色的颜色来显示图像。然后，创建一个新块以定位来自毛细管的荧光信号。选择 tools、new blocks，然后将列数和行数分别放在 blocks 和 features 界面中 1 对 1 和 2 到 5。
右键单击并选择特征模型。然后，调整位置和直径以适合毛细管的荧光区域。选择 analyze 以提取荧光强度的值。
最后，选择 file ， save settings as，以保存块的文档。然后，选择、归档、保存结果以保存荧光强度结果。此处显示的是毛细管阵列的布局。
毛细管 1 到 8，前缀为 LAMP 引物组。毛细管 9 和 10 代表 2，无引物对照。此处显示的是用于检测转基因玉米 MON863 的荧光照片，其中绿色表示 LAMP 阳性扩增。
扩增成功，仅存在于预期的毛细管 1、6、7 和 8 中，在空白毛细管中没有污染。这张荧光照片用于检测 GMO 混合物。绿色表示 LAMP 扩增阳性。
仅在预期的毛细管 1、4、5、6、7 和 8 中成功扩增，在空白毛细管中没有污染。此处显示的荧光照片用于检测非转基因玉米，绿色表示 LAMP 扩增阳性。成功的扩增仅出现在预期的毛细管 8 中，并且在空白毛细管中没有污染。
一旦掌握，如果执行得当，这个检测程序可以在一个 5 小时内完成。看完这个视频，您应该对如何制作基于毛细管的盒进行多核酸检测有了很好的了解。
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概述
本方案描述了一种小型、即用型卡盒的制备方法，可用于在单个操作简便的检测中对多种核酸进行可视化检测。该方法特别适用于利用毛细管阵列进行多重检测以鉴定转基因生物（GMOs）。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 分子生物学
- 基因工程
背景
- 多种核酸的检测在各个领域中至关重要。
- 转基因生物（GMOs）对食品安全构成了重大挑战。
- 需要高效的检测方法以实现快速分析。
- 毛细管阵列可增强多重检测能力。
研究目的
- 开发一种用于核酸检测的用户友好型卡盒。
- 提高转基因生物（GMO）检测的效率。
- 促进多重核酸检测技术的研究。
使用的方法
- 用于核酸检测的小型卡盒的制备。
- 使用毛细管阵列进行多重检测。
- 用丙酮和去离子水清洗毛细管。
- 便于使用的可视化检测方法。
主要结果
- 该试剂盒可同时检测多种核酸。
- 毛细管阵列可提高检测过程的效率。
- 该方法操作简便，易于使用。
- 在转基因生物检测及其他领域具有潜在应用价值。
结论
- 本方案为核酸检测提供了一种新颖的方法。
- 所开发的检测盒在多重检测中具有高效性。
- 未来的研究可进一步拓展其在生物技术中的应用。
常见问题
执行层面的行业相关性
该平台可在单个卡盒中实现多重核酸检测，满足转基因检测和微生物监测中的高通量筛查需求。通过将毛细管阵列技术与LAMP扩增相结合，该方法在保持特异性和灵敏度的同时，降低了检测的复杂性和资源消耗。通过紫外光照进行可视化读取，可实现快速、无需仪器的检测结果判读，符合生物制药和农业生物技术工作流程中对去中心化检测的需求。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够同时检测多个基因靶标，用于通路分析中的假设检验。
- 操作价值：通过毛细力驱动的样本加载方式，减少试剂消耗和人工操作时间。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为不同靶标提供标准化的独立反应腔室，实现可重复的扩增。
- 操作价值：支持最多八个检测的并行处理，并包含用于检测验证的内参。
转化与临床前研究
- 科学价值：有助于在复杂基质中检测转基因成分，支持转基因生物的安全性评估。
- 操作价值：仅需最少设备即可实现现场检测，适用于生物制造过程中的工艺监控。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期发现到临床前研究的工作流程，可利用快速核酸分析来指导靶点筛选和检测准备。
- Discovery Biology： 可对基因变异体或构建体进行并行测试，以阐明其在生物通路中的功能作用。
- Screening： 生成定量荧光强度数据，用于确认阳性结果及进行毛细管间的比较分析。
- Analytics： 通过空白毛细管对照，输出数据可用于设定信号阈值并评估污染情况。
- Translational Research： 借助一致的核酸读数，支持从靶点识别到临床前验证的连续性研究。
- Enterprise Reuse： 卡盒设计允许通过更换引物组，在多个核酸检测面板中重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少多重检测中的串扰和假阳性，提高检测结果的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化毛细管制备和独立的反应体积，增强实验的可重复性。
- 战略价值：缩短在转基因生物检测和微生物监测中关键决策点的结果出具时间。
- 组合影响：基于多参数同步读数，实现按风险调整的目标优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备表面处理和毛细管阵列组装方面的专业知识，以实现疏水/亲水性图案化。
- 依赖于真空脱气和热固化设备的可用性，用于PDMS微流控芯片的制备。
- 为获得可重复的结果，需在毛细管阵列间标准化引物固定方案。
- 由于毛细管阵列的限制，在扩展至超过八个目标时需考虑适应性调整。
- 依赖于用户培训，以确保紫外激发和图像采集的一致性，从而保证荧光定量的准确性。
