Name: 痰液诱导和实验室处理方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 了解痰液诱导技术用于呼吸系统疾病研究，该方法通过高渗盐水雾化获取样本，结合肺功能检测和细胞分类计数，为哮喘、COPD及肺纤维化等疾病提供非侵入性诊断工具。

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本工作由列日大学医院（CHU Liege）资助。我们感谢“Instants productions”团队完成视频制作。同时感谢在影片中出镜的患者 Cedric François。

本节所述所有方法均经列日大学医院伦理委员会批准，所有健康受试者均已签署书面知情同意书，同意参与研究。
1. 痰液诱导
<ol>
	<li>支气管扩张剂使用前后的肺量测定
	<ol>
		<li>进行肺量测定（1秒用力呼气量 [FEV1] 以及根据美国胸科学会（ATS）/欧洲呼吸学会（ERS）标准准则进行的用力肺活量（FVC）操作12.</li>
		<li>通过定量吸入器（MDI）和储雾罐装置给予400 µg吸入型沙丁胺醇。 
		注意：在成人中，吸入型沙丁胺醇的不良事件包括震颤和心动过速13.</li>
		<li>重复肺量测定（FEV1 以及15分钟后进行FVC操作，依据ATS/ERS标准标准12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声雾化器的制备 
	注意：每次使用前，必须根据制造商的说明对雾化器进行彻底清洁和消毒。
	<ol>
		<li>将蒸馏水加入雾化器室，直至达到推荐水位。</li>
		<li>将一个洁净的杯子放入雾化室中。</li>
		<li>用合适的盖子盖住杯子。</li>
		<li>使用50 mL高渗盐水（5%）填充杯子，适用于支气管扩张剂使用后FEV的患者1 &#62;65% 预计值或 50 mL 等渗盐水（0.9%），适用于支气管扩张剂使用后 FEV 的患者1≤65% 预测值。</li>
		<li>加入1.75 mL硫酸沙丁胺醇溶液（5 mg/mL）至杯中。</li>
		<li>根据制造商的说明连接管路和阀门。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>雾化与痰液采集 
	注意：该技术操作须在医疗监护下进行。
	<ol>
		<li>向患者解释操作步骤。</li>
		<li>请患者使用鼻夹。</li>
		<li>打开雾化器，并选择最低的气溶胶和风扇档位。</li>
		<li>让患者通过咬嘴以平静呼吸方式吸入气溶胶，持续5分钟。 
		注意：可根据患者的耐受程度适当增加气溶胶和风扇的设置。
		<ol>
			<li>若出现难以忍受的咳嗽或恶心，应立即停止操作并进入步骤 1.3.5。</li>
			<li>若出现胸闷或呼吸不适，请前往步骤 1.3.8。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>关闭雾化器。</li>
		<li>让患者取下鼻夹，用水漱口并漱喉两次，然后将水吐入水槽中。 
		注意：唾液细胞可能污染痰液样本，导致样本无法使用。</li>
		<li>让患者将痰咳入一个塑料容器中。</li>
		<li>进行肺量测定（用力呼气动作）以测量FEV1.</li>
		<li>评估 FEV1 下降如下：（FEV1 在步骤 3.8 测得的值 [mL] - 支气管扩张剂后 FEV1 测得的第1.3步数值 [mL] / 支气管扩张后FEV1 在步骤1.3中测得的数值 [mL]）*100
		<ol>
			<li>如果 FEV1 若较支气管扩张剂使用后的值下降20%或以上，则终止操作。测量FEV1 10 分钟后再次进行。如果 FEV1 若下降20%或以上，请医师给予雾化吸入异丙托溴铵（0.25 mg/2 mL），并继续对患者进行医学观察。进入步骤1.3.10。</li>
			<li>如果 FEV1 若较支气管扩张剂使用后的数值下降不足20%或以上，则重复步骤3.2至3.9，共进行一至三次，使雾化总时间达到10至20分钟。 
			注意：总雾化时间取决于痰液样本的质量（是否存在凝块或黏稠部分）和样本量。若雾化10分钟后样本质量和/或样本量仍不理想，应延长雾化时间，使总雾化时间达到15至20分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将痰液样本冷藏保存直至处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 痰液处理
注意：为了获得最佳的细胞活性，应在采样后3小时内处理痰液样本。
注意：请穿戴实验服、防护手套和护目镜。
<ol>
	<li>初步准备
	<ol>
		<li>根据制造商说明，用无菌蒸馏水将浓缩的二硫苏糖醇溶液（黏液溶解剂）稀释10倍，制备10 mL的6.5 mM溶液。 
		注意：为防止浓缩的二硫苏糖醇溶液与空气接触，应使用无菌注射器和针头从安瓿中抽取溶液。一旦开启，浓缩溶液必须在室温下保存，并在5天内使用完毕。稀释液需每日新鲜配制。 
		注意：由于可能引起眼睛和皮肤刺激，需佩戴防护装备（防护服、手套和护目镜）。</li>
		<li>用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将台盼蓝溶液（0.4%）稀释5倍，得到0.08%的溶液。将稀释后的溶液在室温下保存，并在2周内使用。 
		注意：由于存在致癌风险，需佩戴防护装备（防护服、手套和护目镜）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>痰液上清液的收集
	<ol>
		<li>将全部痰液转移至50 mL锥底塑料管中，并称量样品重量。</li>
		<li>加入相当于痰液重量3倍的DPBS溶液。</li>
		<li>缓慢涡旋混合样品30秒。</li>
		<li>在800 × g、4 °C条件下离心10分钟。</li>
		<li>用两层无菌纱布过滤样品，并将滤液收集至50 mL锥底塑料管中。</li>
		<li>将上清液分装至2 mL塑料管中，并在-80 °C保存。 
		注意：上清液样品可用于检测痰液液体相成分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>痰液黏液溶解处理
	<ol>
		<li>如有必要，加入DPBS至细胞沉淀中，使细胞悬液总体积达到5 mL。</li>
		<li>用1体积的6.5 mM二硫苏糖醇稀释细胞悬液。使用摇床在室温下振荡细胞悬液20分钟。
		<ol>
			<li>用DPBS重复此步骤至少3次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将稀释后的细胞悬液在550 × g、4 °C条件下离心10分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用约1 mL的DPBS重悬细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过血细胞计数板计数评估痰液样本的定性特性（细胞浓度、鳞状细胞污染程度及台盼蓝排斥法测定的细胞活力）
	<ol>
		<li>测定并记录细胞悬液的准确体积。</li>
		<li>将50 µL细胞悬液与50 µL的0.08%台盼蓝溶液混合，并混匀。</li>
		<li>将样品置于血细胞计数板（Thoma计数室）盖玻片下，并置于光学显微镜（400X）下观察。</li>
		<li>计数鳞状细胞、活的非鳞状细胞（未着色细胞）和死亡的非鳞状细胞（蓝色着色细胞）。 
		注意：若细胞密度过低或过高，应浓缩或稀释细胞悬液，并重复步骤2.4.1–2.4.3。</li>
		<li>评估细胞悬液的细胞浓度、鳞状细胞百分比以及非鳞状细胞的活力百分比。 
		注意：计算每克痰液中非鳞状细胞总数：细胞悬液浓度（步骤5.4）× 细胞悬液体积（步骤4.8）× 非鳞状细胞百分比 / 痰液样品重量（步骤2.2.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用细胞悬液制备染色的细胞涂片，并在需要时保存剩余细胞 
	注意：若细胞悬液中鳞状细胞比例超过80%，则认为样本质量差，不适合制备细胞涂片14。此时应停止处理，并视为该样本失败。
	<ol>
		<li>用DPBS稀释一份细胞悬液，使其最终体积至少为350 µL，细胞浓度达到500,000个细胞/mL。</li>
		<li>按照制造商说明组装细胞浓缩装置。</li>
		<li>将上述细胞悬液各100 µL分别加入细胞浓缩装置的3个腔室中。</li>
		<li>在细胞离心机中以150 × g、室温离心2分钟，弃去上清液。</li>
		<li>按照制造商说明拆卸细胞浓缩装置。</li>
		<li>让载玻片自然风干。 
		注意：在此阶段，如有需要，可将剩余细胞保存在适当的缓冲液中用于后续实验。</li>
		<li>按照制造商说明，使用商用染色试剂盒对载玻片进行染色（参见材料表）。</li>
		<li>使用合适的封片介质和盖玻片封固载玻片。</li>
		<li>将载玻片置于光学显微镜（600X）下，使用油镜观察。</li>
		<li>至少计数500个非鳞状细胞：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和上皮细胞。 
		注意：分类细胞计数通常由一名或两名经过专门培训的观察者完成，以减少观察者间差异。</li>
		<li>记录每种细胞类型的绝对值和百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts%3A+their+usefulness+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li>
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<li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum%3A+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

诱导痰法是一种研究气道区室的有用工具。该技术具有多种可能的应用。首先，它可增进对参与各种呼吸系统疾病免疫细胞及机制的认识。例如，该技术已用于对大量患者进行气道炎症的研究，并已表明约一半的哮喘患者具有异常的气道嗜酸性粒细胞炎症15,16,17，而慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者通常表现为痰液中中性粒细胞计数升高18。该技术还促进了对特发性肺纤维化患者气道炎症的更准确表征，并揭示了可能参与该疾病的介质19。其次，诱导痰技术可能有助于预测治疗反应。例如，痰液中嗜酸性粒细胞比例异常已被证明是糖皮质激素治疗反应的预测标志物11,18。在哮喘和COPD中，根据痰液嗜酸性粒细胞比例调整糖皮质激素剂量以使其恢复正常，已被证明在减少急性加重次数方面比依据现行临床指南调整治疗更为有效11,20,21。第三，痰液分析可能有助于开发靶向治疗。例如，COPD及部分哮喘患者痰液中中性粒细胞数量异常，已推动了抗中性粒细胞性治疗的发展11。第四，该技术可能在诊断中发挥作用。例如，痰液嗜酸性粒细胞增多是诊断非哮喘性嗜酸性粒细胞性支气管炎的必要条件11。
除了获取差异细胞计数外，诱导痰技术还可通过对痰上清液或痰细胞进行研究，开展多种其他分析。利用痰上清液的分析示例包括对介质分子的检测8,19,22 以及样本对嗜酸性粒细胞趋化活性的评估22从痰液细胞中可提取RNA，并用于microRNA或基因表达分析19,23 也可通过流式细胞术分析痰液细胞9,23 可用于免疫表型分析和细胞分选。此外，痰液细胞还可进行培养10，可测量其介导物质的产生 体外24值得注意的是，在这种情况下，中介物的成分与痰液上清液中的成分不同。实际上，痰液上清液中的中介物可能受到气道定居细胞分泌物及血浆渗出的影响，而痰液细胞培养模型则不受这些因素干扰。24最后，免疫细胞化学和 原位 也可使用痰液细胞进行杂交7.
诱导痰技术存在一些局限性。该操作必须在医疗监护下进行，操作者向患者提供详尽的指导也至关重要。其他局限性还包括患者的配合程度和健康状况，因为该过程需要患者进行呼吸努力。关于该技术在儿童中的可行性，已有若干研究报道，在6岁以上儿童中该技术是成功且安全的25。目前缺乏针对&#60;6岁儿童的数据25，但诱导痰在这些儿童中可能较难实施14。由于该技术操作要求高、耗时较长且需要经过培训的专业人员，目前仅限于研究机构和专业中心使用1。另一项局限性在于，痰液诱导和分析技术并非总能成功，即并非每次都能获得可读的细胞涂片26。然而，在不同患者队列中，成功率通常约为80%4,26,27,28,29。最后，在比较不同患者队列时，应注意年龄匹配问题，因为年龄已被证明会影响痰液细胞计数30,31。同样，性别和吸烟习惯等其他参数也需匹配，因为它们也可能干扰痰液细胞计数29,32。当无法实现患者匹配时，另一种考虑年龄、性别或吸烟状况的方法是在统计分析中对这些特征进行校正。
与其他可从气道收集细胞的技术（如活检和支气管肺泡灌洗）相比，诱导痰法具有操作简便、耐受性好、安全性高、可重复性强、成本效益好以及无创等优势。这些优势使得诱导痰技术能够大规模实施，并可长期重复进行，因而成为气道采样的首选替代方法。支气管吸液法是另一种可用于采集黏膜衬液以评估气道介质的技术33。尽管该技术（需支气管镜检查）比诱导痰更具侵入性，但其优势在于可避免唾液污染，并能获得比支气管肺泡灌洗更高的介质浓度33。
在实验方案中，有几个关键步骤需要特别注意。首先，必须谨慎控制盐水浓度和诱导时间，因为这两个参数可能影响实验结果，因此需要进行标准化34,35。其次，使用二硫苏糖醇（DTT）进行黏液溶解是样本处理中的重要步骤。与磷酸盐缓冲液（PBS）相比，DTT能更有效地分散痰液中的细胞7，从而提高细胞涂片质量，并对获得可重复的细胞计数至关重要2。然而，黏液溶解剂可能干扰生化成分的测定，因此在检测新的生化物质时应进行加标实验36。最后，另一个关键步骤是细胞计数，该步骤必须由经过培训的技术人员操作，以确保结果的可靠性和可解释性。
文献中还描述了一种使用痰栓（黏稠或较致密的部分）而非全痰样本的替代方法7。这两种技术各有优缺点。全痰法处理速度较快7，但常被唾液污染，从而稀释样本并可能降低细胞涂片的质量2,7。而痰栓筛选法可减少唾液污染，因此样本通常更适合用于液相介质因子的定量分析以及制备细胞涂片7。然而，该方法处理时间较长7，且所选痰栓可能无法代表整个样本37。此外，并非所有样本都含有痰栓，这在实际应用中可能具有局限性。目前两种方法均已得到验证且可重复，尚无证据表明这两种方法所得的白细胞分类计数存在差异14,38。
未来，诱导痰可作为一种临床工具，为各类炎症性呼吸系统疾病的调查、诊断和管理提供生物标志物。

有多种方法可用于研究气道炎症：直接测量法（如支气管活检或支气管肺泡灌洗）和间接方法（如症状评估、血液样本分析和肺功能测试）1。直接技术的优势在于能够可靠地评估气道炎症，但因其具有侵入性，且会给患者带来不适和风险，难以大规模应用1。至于间接方法，其与气道炎症的直接评估相关性较差1。
痰液采集是获取气道细胞的另一种方法，可直接评估气道炎症。然而，自发咳痰可能导致样本质量较差，并非所有患者都能完成。2该问题已通过使用超声雾化高渗盐水诱导痰液产生而得以解决2该方法最初用于人类免疫缺陷病毒（HIV）感染患者的诊断 Pneumocystis carinii 肺炎3 并于1992年针对健康受试者和哮喘患者进行了调整4痰液诱导在较严重的患者中也可行，可使用等渗盐水进行5尽管通常耐受性良好，但吸入盐水可能在气道高反应性患者中引发支气管痉挛5因此，建议在操作前给予短效β受体激动剂1此外，我们先前已证实，在超声波雾化器的生理盐水中加入沙丁胺醇可进一步降低该风险6痰液诱导的优点在于其为非侵入性方法2 在采取适当预防措施的情况下是安全的5. 
痰液样本处理目前在文献中采用两种方法：全痰法和痰栓筛选法7在本实验室，采用全痰法进行处理。痰液处理的主要目的是获得差异细胞计数，以研究存在于气道管腔内的炎症类型。此外，还可通过分析痰液上清中的炎性介质，进一步开展多种其他检测，以深入探究炎症过程及免疫机制8 或通过对痰液细胞进行详细检查（例如，流式细胞术9细胞培养10，基因组学10，蛋白质组学10免疫细胞化学7, 原位 杂交7, 等等。)
痰液诱导与分析技术目前仅限于临床实践中的研究机构和专业中心使用，因为该技术操作复杂、耗时较长，且需要经过专门培训的人员1。该方法可用于研究哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、慢性咳嗽或特发性肺纤维化等多种呼吸系统疾病中的气道炎症11。

<table><tbody><tr><td>肺量计 - Spirobank</td><td>MIR France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>沙丁胺醇 MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK：0135-913</td><td>参见该国可获得的药物</td></tr><tr><td>超声雾化器 UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb 一次性雾化杯 &amp;& Lids</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>DeVilbiss UltraNeb 雾化器用细菌过滤器</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>单向阀</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>单向阀</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶T型连接器&amp;nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>单分支波纹通气回路</td><td>Int'Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>5 % NaCl&amp;nbsp;</td><td>/</td><td>/</td><td>由我院药房制备</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0.9%</td><td>B.Braun Medical&amp;nbsp; 比利时迪埃日</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸沙丁胺醇 5 mg/mL - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK：0094-987</td><td>见该国可获得的药物</td></tr><tr><td>异丙托溴铵 0.25 mg/2 mL - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Germany</td><td>CNK: 1543-305</td><td>见该国可获得的药物</td></tr><tr><td>Dulbecco's 磷酸盐缓冲液</td><td>LONZA 比利时</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Sputolysin 试剂</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液 100 mL</td><td>LONZA Bio Whittaker 比利时</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板 - 托马计数室</td><td>Labor Optik Lancing 英国</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Hemacolor 染色试剂盒</td><td>默克比利时</td><td>1116610001</td><td>替代产品&amp;nbsp; Diff Quik 染色试剂盒&lt;br/&gt; &amp;nbsp;Medion Diagnostic&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>封片剂 - Entellan</td><td>默克比利时</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Belgium</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

痰液诱导及实验室处理方法

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

诱导痰液及其处理技术是一种公认的非侵入性方法，可用于采集和分析气道细胞，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、慢性咳嗽或特发性肺纤维化等多种呼吸系统疾病中具有重要意义。该技术耐受性良好、安全且无创，但由于技术要求高、耗时较长且需要经过培训的专业人员操作，目前仅限于科研机构和临床实践中的专科中心使用。痰液诱导与分析的成功率约为80%。
本文介绍了痰液样本的诱导及实验室处理方法。通过吸入高渗或等渗盐水联合沙丁胺醇来诱导痰液。在样本处理过程中，我们采用全痰法。使用二硫苏糖醇（DTT）对痰液样本进行黏液溶解。痰液处理的主要目的是获得细胞分类计数，以研究气道腔内存在的各类细胞。此外，还可对痰液上清液和痰液细胞进行其他分析，有助于进一步探讨炎症过程和免疫机制。例如，检测痰液上清液中的炎性介质，或对痰液细胞进行流式细胞术、基因组学或蛋白质组学等多种分析。
最后，展示了健康对照者、哮喘患者和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰液分析的代表性结果。

血细胞计数板 
使用血细胞计数板在显微镜下观察到的典型图像如图1所示。鳞状细胞很容易被识别，因为它们明显大于非鳞状细胞。这些鳞状细胞是来自口腔的上皮细胞。当细胞死亡时，两类细胞均会被台盼蓝染色。计数时需注意避免将酵母、细菌和碎屑计入其中。
<img alt="血细胞计数板细胞计数网格，显微镜图像，细胞分布分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：血细胞计数板图像显示（A）一个活的非鳞状细胞，（B）一个死亡的非鳞状细胞，以及（C）一个鳞状细胞。比例尺 = 50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
细胞离心涂片：图 2 显示了痰液处理后获得的代表性细胞离心涂片图像。不同类型的细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和上皮细胞）可根据其形态和染色特征进行区分。在某些情况下，可能存在鳞状细胞污染，若鳞状细胞比例超过 80%，则认为该样本不合格（图 3）。
<img alt="细胞学玻片，显微镜下的细胞；用于诊断分析的细胞结构鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2： Cytospin 玻片图像显示（A）中性粒细胞，（B）巨噬细胞，（C）嗜酸性粒细胞，（D）淋巴细胞，以及（E）上皮细胞。比例尺 = 20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="染色细胞显微镜图像；细胞核，细胞质；细胞结构分析；组织学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3: 质量较差的细胞离心涂片示例 &gt;80% 的鳞状细胞。比例尺 = 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
成功率 
在我们科室，基于1,129例受试者（包括健康人群、哮喘患者或慢性阻塞性肺疾病患者）的样本数据，该操作的成功率（以成功诱导并获得可读的细胞离心涂片为标准）为82%（924/1,129）。根据受试者类型的亚组分析显示，健康人群的成功率为75%（57/76），哮喘患者为82%（827/1,004），慢性阻塞性肺疾病患者为82%（40/49）。
健康受试者中的结果 
在我科对289名健康受试者进行的回顾性分析中，痰液重量的中位数（四分位距）为3.72 g（四分位距为2.46 g - 5.54 g），每克痰液中总的非鳞状上皮细胞计数中位数为0.59 × 106（四分位距为0.37 × 106 - 1.29 × 106）。
在这些健康受试者中，鳞状细胞的比例较低，为19%（10%-34%），而细胞活力较高，达66%（54%-78%）。关于不同类型细胞的百分比，结果总结于图4A。可以看出，巨噬细胞的比例（49% [31%-68%]）高于中性粒细胞的比例（34% [14%-60%]），而淋巴细胞（2% [1%-3%]）、嗜酸性粒细胞（0% [0%-0%]）和上皮细胞（4% [2%-11%]）的比例较低。当数据以绝对数值表示时，结果相似（图4B）。
<img alt="显示鳞状细胞、存活率和免疫细胞百分比的细胞组成条形图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：健康受试者中观察到的差异性细胞计数的代表性结果，以（A）百分比或（B）绝对值表示。结果以中位数（四分位距）显示。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
还必须考虑患者的年龄。事实上，患者年龄与痰液样本中中性粒细胞比例之间存在显著相关性（图5）。同样，当根据10岁年龄组对患者进行分类时（图6），我们观察到随着年龄组的增加，中性粒细胞百分比显著上升。因此，在比较不同队列的结果时必须考虑这一变量，并需谨慎匹配受试者。
<img alt="散点图，年龄与中性粒细胞百分比，线性回归：正相关（r=0.45，p&lt;0.0001）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5： 年龄与痰液中性粒细胞百分比的相关性。相关性采用Spearman检验进行计算。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图比较不同年龄组别中性粒细胞百分比，显示统计学显著性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6： 不同年龄组中性粒细胞百分比的演变 ANOVA 的 p 值为 &lt;年龄组间中性粒细胞百分比比较的 p 值为 0.0001。多重比较采用 Dunn 多重比较检验。p 值表示如下：* p &lt;0.05，** p &lt;0.01，以及 *** p &lt;0.001。结果以中位数（四分位距）表示。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
呼吸系统疾病患者的检测结果 
诱导痰技术常用于评估哮喘患者的炎症细胞谱型。该技术也可应用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者，这是一种同样具有炎症特征的呼吸系统疾病。在比较健康受试者、哮喘患者和COPD患者（三组在年龄、性别和吸烟习惯方面相匹配）时，我们观察到这些人群之间的炎症细胞谱型存在显著差异（图7）。事实上，哮喘患者通常表现为痰液嗜酸性粒细胞升高，而与健康对照组相比，COPD患者的痰液中性粒细胞比例通常更高，且与疾病严重程度相关。
<img alt="细胞类型分布柱状图；哮喘、COPD 和健康人群中的中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7： 健康受试者（n = 45）、哮喘患者（n = 108）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者（n = 54）的痰液炎症细胞谱。 三组在性别、年龄和吸烟习惯方面相匹配。组间中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞比较的单因素方差分析（ANOVA）p 值分别为 &lt;0.05、&lt;0.0001 和 &lt;0.0001。组间多重比较采用 Dunn 多重比较检验。p 值表示方式如下：* p &lt;0.05，*** p &lt;0.001。结果以中位数（四分位距）表示。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了痰液诱导技术。该方案还详细说明了痰液处理方法，以进行细胞分类计数，并收集痰液上清液和细胞用于后续分析。

痰液诱导与处理技术是一种公认的无创方法，可采集并分析来自气道的细胞，从而……

诱导痰技术于20世纪90年代初期发展起来，最初提出用于研究哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等阻塞性气道疾病的新信息，而近年来人们也开始关注其在肺纤维化研究中的应用价值。该技术的主要优势在于相较于支气管镜检查，其具有相对无创的特点。该处理过程需要进行实验室内操作，耗时较长，因此对实验人员的技术要求较高，且耗时耗力，需要具备一定的实验室操作经验，因此显然是一种难以在所有中心普遍开展的技术。诱导痰技术包括两个部分：第一部分是痰的诱导，第二部分是痰的处理。在进行痰诱导之前，我们需要先进行肺量测定（spirometry），以评估患者能够产生的气体容积和气流速率。我们需要这样做，是因为痰液诱导本身可能引起支气管痉挛，因此我们必须了解患者肺功能测定的基线值。首先，我们进行一次肺功能测定，然后给予患者支气管扩张剂，通常给予400 µg的沙丁胺醇，以最大程度地打开患者的气道，并预防诱导过程中可能出现的支气管痉挛。15分钟后，我们再次测量肺功能，以获得所谓的肺功能基线值，特别是关注FEV1，即患者在一秒钟内能够呼出的气体体积。将蒸馏水倒入雾化室，直至达到推荐液位。在雾化室内放置一个洁净的杯子。用合适的盖子盖好已装满的瓶盖。如果支气管扩张剂后FEV1大于预测值的65%，则在杯中加入50 mL 5%高渗盐水；如果支气管扩张剂后FEV1小于预测值的65%，则加入50 mL 0.9%等渗盐水。向杯中加入1.75 mL浓度为5 mg/mL的硫酸沙丁胺醇溶液。按照制造商的说明连接管路和阀门。该技术必须在医疗监督下进行。向患者解释测试的原理。要求患者使用鼻夹。启动雾化器，并选择最低的气溶胶和风扇档位。请患者通过咬嘴以潮气呼吸方式吸入气溶胶。根据患者的耐受程度，可逐步增加气溶胶和风扇的档位。若出现胸闷或呼吸不适，应立即停止操作，并进行肺量测定以测量患者的 FEV1 值。吸入 5 分钟后，或若出现咳嗽、恶心症状，应停止使用雾化器。请患者取下鼻夹，用自来水漱口并漱喉两次，然后将水吐入水槽中丢弃。然后，让患者咳出痰液，并将从喉咙咳出的物质吐入塑料容器中。进行第一次呼吸动作以测定FEV1。每次尝试咳痰后，均测量FEV1值。如果FEV1值下降超过20%，则停止操作，并给予患者异丙托溴铵雾化治疗，这是一种抗胆碱能药物，可与操作过程中已给予的β2受体激动剂协同作用。如果FEV1值未下降超过20%，则继续操作，总时长根据患者咳出痰液的质量和量决定，通常为10至20分钟。一旦获得痰液样本，应将其保存在冰箱中，直至进行处理。第二部分包括痰液处理，为此首先需要配制两种用于该处理过程的溶液。首先是二硫苏糖醇（Dithiothreitol），也称为 DTT。该溶液需通过将 DTT 用无菌水稀释，配制成 6.5 毫摩尔的溶液。因此，必须避免将DTT暴露于空气中，为此我们使用注射器和针头。其次，需要配制台盼蓝溶液，需用DPBS对台盼蓝进行稀释，以获得0.08%的溶液。关于痰液样本，需将全部痰液转移至一个50 mL锥底塑料离心管中，并称量样本重量，然后加入三倍重量的DPBS溶液。将样品缓慢涡旋振荡30秒，在4°C条件下以800 ×g离心10分钟。经两层无菌纱布过滤后，收集上清液至50 mL锥底塑料管中。将上清液分装至2 mL塑料管中，于-80°C保存。请注意，上清液样本对我们而言是痰液三相成分的一部分。如果细胞沉淀体积小于 5 mL，加入 DPBS 使细胞悬液总体积达到 5 mL。用终浓度为 6.5 毫摩尔的 DTT 溶液等体积稀释细胞悬液。将细胞悬液在室温下用摇床孵育 20 分钟。用 DPBS 将细胞悬液至少稀释三倍。在 4 摄氏度下，以 550 ×g 离心稀释后的细胞悬液 10 分钟。弃去上清液。用约1 ml DPBS重悬细胞沉淀。测定并记录细胞悬液的准确体积。取50微升细胞悬液加入50微升稀释后的台盼蓝溶液中，混匀。将样品置于血细胞计数板的盖玻片下，放入光学显微镜下观察。评估细胞悬液的细胞浓度、鳞状细胞百分比以及非鳞状细胞的存活率。用DPBS稀释一部分悬浮液，以获得至少350 µL、浓度为500,000个细胞/mL的细胞悬液。按照制造商说明书组装细胞浓缩装置。将100 µL细胞悬液分别加入细胞浓缩装置的三个腔室中。在室温下，以150 g离心2分钟。弃去上清液。让载玻片自然晾干。根据制造商说明书，使用 div quick 染色液或镍价染色试剂盒对玻片进行染色。用封片剂和盖玻片封片。将玻片置于光学显微镜下，使用油浸镜头观察。至少计数500个非鳞状细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和上皮细胞，并记录各类细胞的绝对值、百分比及细胞类型。关于结果，使用血细胞计数板时，需计数未被染色的活体非鳞状细胞，同时计数被染成蓝色的死亡非鳞状细胞。以及鳞状细胞。这些细胞是来自口腔的上皮细胞。它们体积较大，因此与微小的人类细胞相比更容易识别。因此，必须避免将细菌、酵母或碎屑计入其中。如果细胞悬液中鳞状细胞比例超过80%，则该样本被视为质量较差，不适合制备细胞离心涂片。该样本因此被视为不合格。根据细胞的颜色和形态对染色后的细胞离心涂片进行计数。中性粒细胞的主要特征是其多叶核，这使得细胞易于识别。这些细胞呈圆形、体积较小，染成中性粉红色。嗜酸性粒细胞含有易于识别的红色颗粒。这些细胞的大小与中性粒细胞相近。巨噬细胞的体积是中性粒细胞的两到五倍，染成蓝色。细胞质可能含有碎片和空泡。淋巴细胞呈圆形且体积较小，染成蓝色，具有一个大而致密的细胞核。上皮细胞呈柱状，染成粉红色，顶部常带有纤毛。以下是一些不可读的细胞涂片样本示例，其中鳞状细胞比例超过80%。我认为这是一种非常有用的技术，但我们必须非常谨慎，因为痰液诱导必须在医疗监督下进行。然而，痰液诱导技术能够提供大量关于患者气道炎症状态的信息。您可以在上清液中检测不同的生物化学标志物，也可以对细胞成分进行多种检测。因此，诱导痰样本可用于流式细胞术、蛋白质组学、转录组学，甚至基因组学分析。

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医学

痰液诱导和实验室处理方法

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本方案描述了一种将痰液高效解离为单细胞悬液的方法，以及在标准流式细胞术平台上对细胞亚群进行后续表征的技术。...

通过流式细胞术进行质量控制的痰液分析

多种细菌性病原体可引起呼吸道感染，若未能准确检测并及时治疗，可能导致严重的健康问题。通过环介导等温扩增技术 对这些病原体进行快速且准确的检测，有助于在临床环境中有效管理和控制呼吸道感染。...

基于微流控芯片的环介导等温扩增技术快速检测引起下呼吸道感染的细菌性病原体

本文介绍了一种用于测量气道巨噬细胞碳含量的详细实验方案，旨在评估个体暴露于颗粒物水平下的内部暴露剂量。...

测量暴露于含碳颗粒物的气道巨噬细胞中的碳含量

我们提出了一种优化的DNA提取方法，该方法采用基于基质的提取法结合磁珠纯化技术，从去污染的痰液样本中提取DNA，用于后续对结核分枝杆菌（Mycobacterium...

基于基质的DNA提取用于污染清除痰液样本的靶向下一代测序

与检测系统性淀粉样变性的其他方法相比，脂肪垫抽吸是一种更优选的、微创且低成本的方法。本视频文章展示了进行脂肪垫抽吸的操作流程，并介绍了标本的适当处理方法，以获得最佳的诊断效果。...

对前脂肪垫进行细针穿刺以检测淀粉样物质的操作与处理

在任何年龄段测量脑回化（皮层折叠）均能为早期脑发育提供重要窗口。因此，我们先前开发了一种算法，用于在半球上的数千个点位上测量局部脑回化1。本文详细阐述该局部脑回化指数的计算方法。...

如何从磁共振图像测量大脑皮层折叠：计算局部脑回化指数的逐步指南

了解痰液诱导技术用于呼吸系统疾病研究，该方法通过高渗盐水雾化获取样本，结合肺功能检测和细胞分类计数，为哮喘、COPD及肺纤维化等疾病提供非侵入性诊断工具。

痰液诱导及实验室处理方法

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