痰液诱导及实验室处理方法

诱导痰技术于20世纪90年代初期发展起来，最初提出用于研究哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等阻塞性气道疾病的新信息，而近年来人们也开始关注其在肺纤维化研究中的应用价值。该技术的主要优势在于相较于支气管镜检查，其具有相对无创的特点。

该处理过程需要进行实验室内操作，耗时较长，因此对实验人员的技术要求较高，且耗时耗力，需要具备一定的实验室操作经验，因此显然是一种难以在所有中心普遍开展的技术。诱导痰技术包括两个部分：第一部分是痰的诱导，第二部分是痰的处理。在进行痰诱导之前，我们需要先进行肺量测定（spirometry），以评估患者能够产生的气体容积和气流速率。

我们需要这样做，是因为痰液诱导本身可能引起支气管痉挛，因此我们必须了解患者肺功能测定的基线值。首先，我们进行一次肺功能测定，然后给予患者支气管扩张剂，通常给予400 µg的沙丁胺醇，以最大程度地打开患者的气道，并预防诱导过程中可能出现的支气管痉挛。15分钟后，我们再次测量肺功能，以获得所谓的肺功能基线值，特别是关注FEV1，即患者在一秒钟内能够呼出的气体体积。

将蒸馏水倒入雾化室，直至达到推荐液位。在雾化室内放置一个洁净的杯子。用合适的盖子盖好已装满的瓶盖。

如果支气管扩张剂后FEV1大于预测值的65%，则在杯中加入50 mL 5%高渗盐水；如果支气管扩张剂后FEV1小于预测值的65%，则加入50 mL 0.9%等渗盐水。向杯中加入1.75 mL浓度为5 mg/mL的硫酸沙丁胺醇溶液。按照制造商的说明连接管路和阀门。

该技术必须在医疗监督下进行。向患者解释测试的原理。要求患者使用鼻夹。

启动雾化器，并选择最低的气溶胶和风扇档位。请患者通过咬嘴以潮气呼吸方式吸入气溶胶。根据患者的耐受程度，可逐步增加气溶胶和风扇的档位。

若出现胸闷或呼吸不适，应立即停止操作，并进行肺量测定以测量患者的 FEV1 值。吸入 5 分钟后，或若出现咳嗽、恶心症状，应停止使用雾化器。请患者取下鼻夹，用自来水漱口并漱喉两次，然后将水吐入水槽中丢弃。

然后，让患者咳出痰液，并将从喉咙咳出的物质吐入塑料容器中。进行第一次呼吸动作以测定FEV1。每次尝试咳痰后，均测量FEV1值。

如果FEV1值下降超过20%，则停止操作，并给予患者异丙托溴铵雾化治疗，这是一种抗胆碱能药物，可与操作过程中已给予的β2受体激动剂协同作用。如果FEV1值未下降超过20%，则继续操作，总时长根据患者咳出痰液的质量和量决定，通常为10至20分钟。一旦获得痰液样本，应将其保存在冰箱中，直至进行处理。

第二部分包括痰液处理，为此首先需要配制两种用于该处理过程的溶液。首先是二硫苏糖醇（Dithiothreitol），也称为 DTT。该溶液需通过将 DTT 用无菌水稀释，配制成 6.5 毫摩尔的溶液。

因此，必须避免将DTT暴露于空气中，为此我们使用注射器和针头。其次，需要配制台盼蓝溶液，需用DPBS对台盼蓝进行稀释，以获得0.08%的溶液。关于痰液样本，需将全部痰液转移至一个50 mL锥底塑料离心管中，并称量样本重量，然后加入三倍重量的DPBS溶液。

将样品缓慢涡旋振荡30秒，在4°C条件下以800 ×g离心10分钟。经两层无菌纱布过滤后，收集上清液至50 mL锥底塑料管中。将上清液分装至2 mL塑料管中，于-80°C保存。

请注意，上清液样本对我们而言是痰液三相成分的一部分。如果细胞沉淀体积小于 5 mL，加入 DPBS 使细胞悬液总体积达到 5 mL。用终浓度为 6.5 毫摩尔的 DTT 溶液等体积稀释细胞悬液。

将细胞悬液在室温下用摇床孵育 20 分钟。用 DPBS 将细胞悬液至少稀释三倍。在 4 摄氏度下，以 550 ×g 离心稀释后的细胞悬液 10 分钟。

弃去上清液。用约1 ml DPBS重悬细胞沉淀。测定并记录细胞悬液的准确体积。

取50微升细胞悬液加入50微升稀释后的台盼蓝溶液中，混匀。将样品置于血细胞计数板的盖玻片下，放入光学显微镜下观察。评估细胞悬液的细胞浓度、鳞状细胞百分比以及非鳞状细胞的存活率。

用DPBS稀释一部分悬浮液，以获得至少350 µL、浓度为500,000个细胞/mL的细胞悬液。按照制造商说明书组装细胞浓缩装置。将100 µL细胞悬液分别加入细胞浓缩装置的三个腔室中。

在室温下，以150 g离心2分钟。弃去上清液。让载玻片自然晾干。

根据制造商说明书，使用 div quick 染色液或镍价染色试剂盒对玻片进行染色。用封片剂和盖玻片封片。将玻片置于光学显微镜下，使用油浸镜头观察。

至少计数500个非鳞状细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和上皮细胞，并记录各类细胞的绝对值、百分比及细胞类型。关于结果，使用血细胞计数板时，需计数未被染色的活体非鳞状细胞，同时计数被染成蓝色的死亡非鳞状细胞。

以及鳞状细胞。这些细胞是来自口腔的上皮细胞。它们体积较大，因此与微小的人类细胞相比更容易识别。

因此，必须避免将细菌、酵母或碎屑计入其中。如果细胞悬液中鳞状细胞比例超过80%，则该样本被视为质量较差，不适合制备细胞离心涂片。该样本因此被视为不合格。

根据细胞的颜色和形态对染色后的细胞离心涂片进行计数。中性粒细胞的主要特征是其多叶核，这使得细胞易于识别。这些细胞呈圆形、体积较小，染成中性粉红色。

嗜酸性粒细胞含有易于识别的红色颗粒。这些细胞的大小与中性粒细胞相近。巨噬细胞的体积是中性粒细胞的两到五倍，染成蓝色。

细胞质可能含有碎片和空泡。淋巴细胞呈圆形且体积较小，染成蓝色，具有一个大而致密的细胞核。上皮细胞呈柱状，染成粉红色，顶部常带有纤毛。

以下是一些不可读的细胞涂片样本示例，其中鳞状细胞比例超过80%。我认为这是一种非常有用的技术，但我们必须非常谨慎，因为痰液诱导必须在医疗监督下进行。然而，痰液诱导技术能够提供大量关于患者气道炎症状态的信息。您可以在上清液中检测不同的生物化学标志物，也可以对细胞成分进行多种检测。因此，诱导痰样本可用于流式细胞术、蛋白质组学、转录组学，甚至基因组学分析。