痰液诱导和实验室处理方法
December 17th, 2017
在这里, 我们描述的痰诱导技术。该协议还解释了痰液的处理, 以执行一个差异细胞计数和收集痰清液和细胞进一步分析。
诱导痰的技术是在 90 年代初开发的。该技术被提出用于研究哮喘、慢性阻塞性肺病等阻塞性气道疾病的新信息，最近人们也对研究肺纤维化的新信息感兴趣。这种技术的主要优点是与支气管镜检查相比，它相对无创。
处理需要实验室工作，而且需要时间，所以要求很高，很耗时，而且需要有一些实验室专业知识，所以这显然是一项在每个中心都很难获得的技术。诱导痰的技术由两部分组成，第一部分是诱导，第二部分是处理。在诱导痰之前，我们需要进行肺活量测定，这是对患者能够产生的体积和流速的评估。
我们需要这样做，因为痰液诱导本身可能会导致细支气管痉挛，因此我们绝对需要知道患者肺活量测定的基线值。因此，我们首先进行肺活量测定，然后给患者服用支气管扩张剂，我们通常给予 400 微克沙丁胺醇，以最大限度地打开患者的气道，并防止在诱导期可能发生的支气管痉挛。15 分钟后，我们再次测量肺活量测定法，以获得我们所谓的肺活量测定法的基线值，特别是我们查看 FEV1，即患者能够在一秒钟内呼出的体积。
将蒸馏水倒入雾化器室中，直至达到推荐水平。将干净的杯子放入雾化器室中。用合适的盖子盖住装满的盖子。
如果支气管扩张剂后 FEV1 大于 65% 预测值，则用 50 mL 高渗盐水 5% 装满杯子，如果支气管扩张剂后 FEV1 低于 65% 预测值，则加入 50 mL 等渗盐水 9%。向杯中加入 1.75 硫酸沙丁胺醇溶液，浓度为 5 毫克/毫升。按照制造商的说明连接管子和阀门。
该技术必须在医疗监督下进行。向患者解释测试的原理。要求患者使用鼻夹。
启动雾化器并选择最低级别的气溶胶和风扇设置。让患者通过吸嘴以潮汐呼吸吸入气雾剂。气溶胶水平和风扇设置可能会根据患者的耐受性而增加。
如果出现胸闷或呼吸不适，请停止手术并进行肺活量测定以测量患者的 FEV1 值。吸入 5 分钟后，或出现咳嗽或恶心时，请停止雾化器。让患者取下鼻夹，漱口，用自来水漱口两次，然后将这些水倒入水槽中。
然后，作为患者咳出痰液，并将从喉咙流出的东西吐在塑料容器中。进行第一次呼吸作以测量 FEV1。在每次试探性咳痰后，我们测量 FEV1 值。
如果 FEV1 值下降超过 20%，我们会停止手术，并为患者雾化异丙托溴铵，这是一种抗胆碱能药物，将与我们在手术过程中已经给予的 β-2 激动剂联合作用。如果 FEV1 值下降不超过 20%，我们会根据患者痰液的质量和痰液量进行 10 至 20 分钟的手术。获得痰液样本后，请将其保存在冰箱中等待处理。
所以第二部分包括痰液处理，为此，我们首先要准备我们将用于此处理的两种解决方案。所以我们必须准备二硫苏糖醇，也称为 DTT。溶液必须通过用无菌水稀释 DTT 来制备，以获得 6.5 毫摩尔的溶液。
因此，您必须避免将 DTT 暴露在环境空气中，为此我们使用注射器和针头。其次，您必须准备台盼蓝溶液，为此您必须用台盼蓝稀释 DPBS，以获得 0.08% 的溶液。因此，关于痰液，您必须将整个痰液转移到 50mL 锥形底塑料管中，并称量样品。加入三倍重量的 DPBS 溶液。
缓慢涡旋样品 30 秒，在 4 摄氏度下以 800 g 离心 10 分钟。将上清液收集在 50 mL 锥形底塑料管中，通过两层单层无菌纱布过滤后。将上清液分配到 2 mL 塑料管中，并在零下 80 摄氏度下储存。
请注意，上清液样品作为痰液的三相成分对我们有用。如果细胞托盘体积小于 5 mL，则添加 DPBS 以达到 5 mL 细胞悬液体积。用一体积的 6.5 毫摩尔 DTT 稀释细胞悬液。
在室温下用工作台工人摇动细胞悬液 20 分钟。用 DPBS 将细胞悬液稀释至少三倍。将稀释的细胞悬液在 4 摄氏度下以 550 g 离心 10 分钟。
丢弃上清液。将细胞调色板悬浮在约 1 ml DPBS 中。评估并记录细胞悬液的确切体积。
将 50 μL 细胞悬液添加到 50 μL 稀释的台盼蓝溶液中并匀浆。将样品放在 hemocil 细胞仪的盖玻片下，并将其置于光学显微镜下。评估细胞悬液的细胞浓度、鳞状细胞的百分比和非鳞状细胞的活力百分比。
用 DPBS 稀释悬浮液，以每 mL 500， 000 个细胞获得至少 350 微升的细胞悬液。根据制造商的说明组装细胞浓缩器。在细胞浓缩器的三个隔室中分别加入 100 μL 细胞悬液。
在室温下在细胞离心机中以 150 g 离心 2 分钟。丢弃上清液。让玻片风干。
根据制造商的说明，用 div quick 或镍价染色试剂盒对载玻片进行染色。使用封固剂和盖玻片进行封片。将载玻片置于光学显微镜下，浸油。
计数至少 500 个非鳞状细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和上皮细胞，并记录绝对值、百分比和细胞类型。关于结果，使用血细胞计数器，我们必须计算未着色的活的非鳞状细胞。此外，死亡的非鳞状细胞呈蓝色。
还有鳞状细胞。这些细胞是来自口腔的上皮细胞。它们很大，因此与较小的人体细胞相比，它们很容易识别。
因此，您还必须避免计算细菌、酵母菌或废料的数量。如果细胞悬液含有超过 80% 的鳞状细胞，则该样品被认为质量差，不适合用于细胞离心涂片。因此，此示例被视为不成功。
根据细胞的颜色及其形态对染色的细胞离心涂片进行计数。中性粒细胞的主要特征是多分叶核，使细胞易于识别。这些细胞是圆形的、小的，颜色为中性粉红色。
嗜酸性粒细胞，这些细胞由红色颗粒组成，易于识别。这些细胞的大小接近中性粒细胞。巨噬细胞比嗜中性粒细胞大 2 到 5 倍，呈蓝色。
细胞质可能包含碎片和液泡。淋巴细胞，这些细胞是圆形的和小的，呈蓝色，并有一个大而致密的细胞核。上皮细胞呈柱状，呈粉红色，通常在顶部有纤毛。
以下是一些无法读取的细胞离心涂片样品的示例，其中超过 80% 的鳞状细胞。我认为这是一种非常有用的技术，但是我们必须非常小心，因为痰液诱导必须在医疗监督下进行，但痰液诱导技术可以为您提供有关患者气道炎症状态的大量信息。它可以让你测量上清液中不同的生化标志物，你也可以测量细胞部分的不同东西，所以诱导痰可以让你进行流式细胞术、蛋白质组学、转录组学，甚至基因组学。
概述
本文描述了痰液诱导技术，这是一种用于采集用于呼吸道疾病分析的痰液样本的非侵入性方法。该协议包括详细的痰液处理步骤，用于进行细胞差异计数和收集上清液以供进一步研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 呼吸内科医学
- 临床技术
- 细胞分析
背景
- 诱导痰液技术发展于90年代初。
- 用于调查阻塞性气道疾病，如哮喘和COPD。
- 最近对肺纤维化的兴趣。
- 支气管镜检查的非侵入性替代方案。
研究目的
- 提供详细的痰液诱导和处理协议。
- 便于收集痰液样本进行细胞分析。
- 通过痰液分析增进对呼吸道疾病的理解。
使用的方法
- 进行肺功能测试以评估基线肺功能。
- 给予支气管扩张药以防止诱导过程中支气管痉挛。
- 使用高渗盐水和雾化诱导痰液。
- 处理痰液样本以进行细胞差异计数和上清液收集。
主要结果
- 成功收集痰液样本用于分析。
- 详细说明了痰液处理方法。
- 实现了细胞活力和浓度评估。
结论
- 痰液诱导技术是一种有效的非侵入性样本收集方法。
- 痰液的正确处理对于准确分析至关重要。
- 该协议可帮助呼吸道疾病的研究和临床诊断。
常见问题
Executive Industry Relevance
Sputum induction and processing provide a non-invasive method for collecting airway cells and supernatant, enabling mechanistic studies of inflammatory pathways in respiratory diseases. This approach supports target validation by delivering quantitative cellular and biochemical data from the lung microenvironment, which is critical for de-risking hypotheses in asthma, COPD, and fibrosis research. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by bridging clinical sample analysis with functional target interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell populations (neutrophils, eosinophils, macrophages, lymphocytes, epithelial cells) in airway lumen.
- Operational Value: Provides reproducible differential cell counts and viability assessments using standardized hemocytometer and trypan blue exclusion methods.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through analysis of sputum supernatant for mediators and cellular components for flow cytometry, genomics, or proteomics.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (cell suspension and supernatant) for downstream assays with defined processing steps including DTT mucolysis and centrifugation.
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs such as cell concentration (target: 500,000 cells/mL) and viability percentage, enabling assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Facilitates screening readiness through supernatant storage at -80°C for biomarker analysis and cell concentrator use for slide preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery to preclinical continuity by analyzing inflammatory cell profiles in disease-relevant systems (asthma, COPD, pulmonary fibrosis).
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions via quality control thresholds (e.g., <80% squamous cells) to ensure sample suitability for cytospin and downstream analysis.
- Scientific Value: Highlights translational biomarker alignment by enabling measurement of biochemical markers in supernatant and cellular phenotypes linked to disease mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting airway inflammation analysis and biomarker-enabled target prioritization in respiratory disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cell types and mediators in induced sputum, reflecting airway inflammatory status.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized processing: DTT dilution (6.5 mM), trypan blue staining (0.08%), centrifugation (800 g and 550 g), and cell concentration adjustment to 500,000 cells/mL.
- Analytics: Enables comparative analysis via differential cell counting (neutrophils, eosinophils, etc.), viability assessment, and supernatant collection for biochemical marker measurement.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cell profiling in asthma, COPD, and fibrosis, supporting biomarker alignment and mechanism validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal inflammatory monitoring and target validation across respiratory indications via standardized sputum induction and processing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through quantitative inflammatory profiling and reduction of mechanistic ambiguity in airway disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via defined reagent concentrations (DTT 6.5 mM, trypan blue 0.08%), centrifugation parameters, and cell concentration targets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by providing early human-relevant inflammatory data from non-invasive sampling.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reproducible cell differentials and supernatant biomarker levels indicating target engagement or pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology, cell handling, and microscopic analysis for accurate spirometry, induction monitoring, and cell counting.
- Needs nebulization equipment, centrifuge (800 g and 550 g), hemocytometer, cytocentrifuge, and -80°C storage for supernatant preservation.
- Demands cross-team standardization of processing steps: DTT preparation avoiding air exposure, trypan blue dilution, saline selection based on post-bronchodilator FEV1, and timed mucolysis (20 min rocking).
- Involves adaptation considerations: saline tonicity (5% hypertonic or 9% isotonic) adjusted to patient FEV1, and processing modifications if cell pellet volume <5 mL (DPBS supplementation).
- Includes practical limitations: technical demand, time consumption, need for medical supervision, and sample exclusion if squamous cells >80% indicating oral contamination.
