Name: 点化学法现场定向固定骨形态发生蛋白2到固体表面 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学习使用点击化学法将BMP2变体共价偶联到支架材料，实现骨形态发生蛋白的定向固定。该方法可降低BMP2用量并减少副作用，为骨缺损修复提供新型生物材料策略。

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作者感谢德国康斯坦茨的 M. Rubini 博士提供了编码吡咯赖氨酰-tRNA 的质粒，以及编码相应氨酰-tRNA 合成酶的 pRSFduet-pyrtRNAsynth 质粒。

1. BMP2 变体 BMP2-K3Plk 的制备
<ol>
	<li>通过PCR介导的定点突变克隆BMP2-K3Plk12
	<ol>
		<li>从 p25N-hmBMP2 载体中扩增人成熟 BMP2（hmBMP2）（参见 材料表）使用上游引物（5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3'）和下游引物（5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3'）进行扩增，该引物在BMP2成熟区第一个赖氨酸位置引入琥珀终止密码子（TAG）。使用33.5 µL的H2O，10 µL PCR 反应混合液，1.5 µL 10 µM dNTP 储存液，1.5 µL 正向引物（10 pmol/µL），1.5 µL 反向引物（10 pmol/µL），1 µL p25N-hmBMP2（10 ng/µL），以及 1 µL DNA 聚合酶（参见 材料表在PCR仪中进行（95 °C 变性5分钟，30个循环：95 °C 变性1分钟，60 °C 退火1分钟，72 °C 延伸1分钟，最后72 °C 延伸10分钟）。</li>
		<li>使用市售试剂盒纯化PCR产物，具体操作遵循生产商说明书（参见 材料表).</li>
		<li>在37 °C下使用16 µL H，用限制性内切酶NdeI消化PCR产物45分钟2O，3 µL 消化缓冲液，10 µL DNA（20 ng/µL），以及 1 µL 限制性内切酶。在 65 °C 下加热 5 分钟以灭活酶活性。使用 16 µL H 的 BamHI 限制性内切酶在 37 °C 下消化 PCR 产物 1 小时。2O、3 µL 消化缓冲液、10 µL DNA（20 ng/µL）和 1 µL 限制性内切酶。在 80 °C 加热 5 分钟以灭活酶。</li>
		<li>用 16 µL H 在 37 °C 下用 NdeI 消化 pET11a-pyrtRNA 载体 2 小时 45 分钟2O，3 µL 消化缓冲液，10 µL DNA（20 ng/µL），以及 1 µL 限制性内切酶。在 65 °C 下加热失活 5 分钟。使用 16 µL 的 H 在 37 °C 下用 BamHI 消化 pET11a-pyrtRNA 载体 1 小时。2O、3 µL 消化缓冲液、10 µL DNA（20 ng/µL）和 1 µL 限制性内切酶。80 °C 加热失活 5 分钟。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳（0.8% 琼脂糖，100 V 恒压电泳 60 分钟）将已消化的载体与未消化的载体及消化残留物分离。在室温下将 100 ng 已消化的 pET11a-pyrtRNA 载体骨架与 34.5 ng 已消化的 BMP2-K3TAG 插入片段（摩尔比 1:3）连接 2 小时。反应体系包含 DNA 载体骨架和插入片段、2 µL 连接酶缓冲液、1 µL DNA 连接酶以及 H2加水至终体积为 20 µL。</li>
		<li>共转化 pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk 和 pSRF-duet-pyrtRNAsynth 质粒至 BL21(DE3) 细菌中：
		<ol>
			<li>向细菌中加入每种质粒50 ng，冰上放置30 min，42 °C热激50 s，再置于冰上5 min，向混合物中加入500 µL Lysogeny Broth（LB）培养基，300 rpm振荡培养60 min。</li>
			<li>将100 µL细菌混合物涂布于预热的含卡那霉素（50 µg/mL）/氨苄青霉素（100 µg/mL）平板上，37 °C过夜培养。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BMP2-K3Plk 的表达与纯化13,14
	<ol>
		<li>在含有50 µg/mL卡那霉素和100 µg/mL氨苄青霉素的50 mL LB培养基中，于37 °C过夜培养单个菌落。</li>
		<li>将过夜培养物按1:20比例稀释至800 mL添加有50 µg/mL卡那霉素和100 µg/mL氨苄青霉素的TB（Terrific Broth）培养基中，于37 °C培养至OD600 当达到0.7时，加入丙炔基-L-赖氨酸至终浓度为10 mM。在加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导前，从培养物中收集100 µL样品。</li>
		<li>通过加入IPTG至终浓度1 mM诱导基因表达。在37 °C、180 rpm的摇床中培养培养物16 h。从培养物中取100 µL样品。</li>
		<li>在9000 × g下离心整个培养物30分钟。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于30 mL TBSE缓冲液（10 mM Tris，150 mM NaCl，1 mM乙二胺四乙酸（EDTA））中，并加入1:1000（v/v）的2-巯基乙醇（新鲜添加）。 
		注意：在通风橱内操作2-巯基乙醇。避免接触皮肤和眼睛。避免吸入蒸气或雾滴。所有含2-巯基乙醇的缓冲液重悬步骤均应在通风橱内进行。</li>
		<li>称量一个空的离心杯，将重悬的沉淀转移至该空杯中。在6,360 x g下离心20分钟。弃去上清液，称量含有沉淀的离心杯。减去空杯的重量，计算沉淀的重量。 
		注意：此处可暂停实验流程。短期内将沉淀于 -20 °C 冻存，长期则于 -80 °C 冻存。恢复实验时，将沉淀在室温下解冻。</li>
		<li>将沉淀重悬于STE缓冲液（10 mM Tris pH 8.0；150 mM NaCl；1 mM EDTA，375 mM 蔗糖；1:1000 (v/v) 2-巯基乙醇（新鲜添加））中。每10 g沉淀使用200 mL STE缓冲液。</li>
		<li>将悬浮液在冰上进行超声处理（10分钟，脉冲40秒，间歇20秒，振幅30%）。在6,360 x g下离心20分钟。弃去上清液并称量沉淀。重复超声和离心步骤4次。</li>
		<li>将沉淀重悬于100 mL TBS缓冲液（10 mM Tris，150 mM NaCl）中。在6,360 × g下离心20分钟。弃去上清液，称量沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于核酸酶缓冲液（100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl₂）中2) 加入新鲜配制的 80 U/mL 核酸酶（例如，Benzonase），用量为每克菌体沉淀使用10 mL。将悬浮液在搅拌板上（30 rpm）室温过夜孵育。</li>
		<li>加入Triton缓冲液（60 mM EDTA，1.5 M NaCl，6% (v/v) 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇）至悬浮液中。所加Triton缓冲液的体积为悬浮液体积的0.5倍。室温孵育10分钟（不搅拌）。在6,360 × g离心20分钟。弃去上清液，称量沉淀物。</li>
		<li>将沉淀物用 TE 缓冲液（100 mM Tris，20 mM EDTA）重悬，每克沉淀物使用 8 mL 缓冲液。在 6,360 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，称量沉淀物重量。</li>
		<li>将沉淀重悬于每克组织加入4 mL的25 mM NaAc（pH 5.0）和5 mL的6 M GuCl（含1 mM二硫苏糖醇（DTT），现配）中。在4 °C下于摇床（30 rpm）中孵育过夜。</li>
		<li>在75,500 × g条件下离心20分钟。上清液中 now 含有去折叠的单体BMP2蛋白。收集上清液，并使用装有3 kDa截留分子量（MWCO）超滤膜的浓缩装置将该提取液浓缩至20 OD/mL（见 材料表).</li>
		<li>将浓缩的单体逐滴加入复性缓冲液（2 M LiCl，50 mM Tris，25 mM CHAPS，5 mM EDTA，1 mM 氧化型谷胱甘肽（GSSG），2 mM 还原型谷胱甘肽（GSH））中，同时搅拌（30 rpm）。避光，室温孵育120小时。 
		注意：在此孵育期间会发生复性。从本步骤开始，溶液中含有正确折叠的二聚体BMP2-K3Plk。</li>
		<li>使用浓盐酸将溶液的 pH 调至 3.0。用 1 mM 盐酸对溶液进行透析。使用截留分子量为 10 kDa 的超滤膜在浓缩装置中浓缩透析后的溶液。</li>
		<li>通过加入缓冲液A（20 mM NaAc，30%异丙醇）平衡溶液。加入相当于溶液体积30%的缓冲液A。在4700 × g下离心15分钟。</li>
		<li>在快速蛋白液相色谱（FPLC）系统上对离子交换柱进行平衡15 用150 mL缓冲液A平衡。将蛋白质溶液上样至平衡好的层析柱。使用缓冲液B（20 mM NaAc，30%异丙醇，2 M NaCl）进行线性梯度洗脱，共使用100 mL缓冲液B。收集每管2 mL的洗脱组分。 
		注意：根据层析柱的总体积，在上样前浓缩蛋白质。最终的蛋白质体积应 &#60;总体积的5%。</li>
		<li>通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，12%）分析各组分20 µL 16 以及考马斯亮蓝染色17 （参见 材料表). 
		注意：考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示含有二聚体（26 kDa）的组分和含有单体（13 kDa）的组分。</li>
		<li>合并含有二聚体的组分。将含有二聚体的组分混合液在4 °C下用5升1 mM HCl溶液透析过夜。使用10 kDa超滤离心浓缩管对最终产物进行浓缩（参见 材料表通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（12%）凝胶电泳（SDS-PAGE）及考马斯亮蓝染色分析最终产物。 
		注意：考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上的条带应仅在26 kDa处显示一条带，此即最终的BMP2-K3Plk产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 铜(I)催化炔烃-叠氮环加成反应（CuAAC）条件的优化
<ol>
	<li>抗坏血酸钠（NaAsc）与硫酸铜（II）（CuSO₄）的作用效应 4 ) 野生型BMP2（BMP2-WT）
	<ol>
		<li>将20 µM BMP2-WT与不同比例的NaAsc和CuSO孵育4使用 0.5 mM NaAsc 和 0.5 mM CuSO₄4 （起始浓度）于 50 µL 体积中。按照以下 NaAsc 与 CuSO 的比例进行操作4：(1:1)、(1.7:1)、(10:1)、(20:1)，保持 CuSO₄ 不变4 浓度保持在0.5 mM，并相应调整NaAsc的浓度。在H中进行反应2在室温下于旋转混合器（20 rpm）中过夜混合。</li>
		<li>加入含5% 2-巯基乙醇的上样缓冲液制备还原样品，并在95 °C孵育6 min。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶（12%）电泳（SDS-PAGE）及考马斯亮蓝染色分析还原与非还原样品。考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示条带分子量范围为13 kDa（还原条件）以及26 kDa及以上分子量（非还原条件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tris(3-羟丙基三唑基甲基)胺（THPTA）对铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）的影响
	<ol>
		<li>将20 µM BMP2-K3Plk与不同比例的THPTA和CuSO₄孵育4使用5 mM NaAsc和200 µM 3-叠氮-7-羟基香豆素（保持NaAsc和3-叠氮-7-羟基香豆素浓度恒定）。使用50 µM THPTA和0.5 mM CuSO₄4 起始浓度。使用不同比例的 THPTA 与 CuSO₄4：（7:1）；（10:1）；（12:1）；（15:1）；（20:1）。在H中进行反应2O（总体积50 µL）在室温下于旋转混合仪（20 rpm）中孵育24小时。</li>
		<li>偶联后，3-叠氮-7-羟基香豆素成为一种荧光染料。在还原和非还原条件下制备样品，并通过SDS-PAGE进行分析。在激发通道中使用针对3-叠氮-7-羟基香豆素的特定波长（λ绝对值 = 404 nm；λem = 477 nm</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. BMP2-K3Plk 与叠氮基功能化琼脂糖珠的共价偶联技术
<ol>
	<li>在总反应体积为 500 µL 的反应缓冲液（0.1 M HEPES，pH 7.0，3.9 M 尿素，50 µM CuSO4，250 µM THPTA，5 mM 抗坏血酸钠）中，将 20 µM BMP2-K3Plk 或 BMP2-WT（作为阴性对照）与 20 µL 叠氮活化的琼脂糖珠在室温下于旋转混合仪（20 rpm）中孵育 2 小时。加入 5 mM EDTA（终浓度）以终止反应。</li>
	<li>在室温下于旋转混合仪（20 rpm）中继续孵育 15 分钟。在室温下以 20,000 × g 离心 1 分钟，收集上清液。</li>
	<li>用 1,000 µL HBS500 缓冲液（50 mM HEPES，500 mM NaCl）洗涤含有珠子的沉淀物 3 次，再用 1,000 µL 4 M MgCl2 洗涤 3 次，最后用 1,000 µL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤 2 次。每次洗涤均需在室温下以 20,000 × g 离心 1 分钟，并收集上清液。将偶联后的珠子储存于 1,000 µL PBS 中，置于 4 °C 保存。 
	注意：去除上清液时切勿扰动珠子沉淀。</li>
</ol>
4. 使用德克萨斯红标记的骨形态发生蛋白受体IA胞外域（BMPR-IA EC）验证固定化BMP2-K3Plk的存在及其生物学活性
<ol>
	<li>在室温下，将50 µL BMP2-K3Plk功能化磁珠与1 µM Texas Red标记的BMPR-IAEC及150 µL HBS500缓冲液（50 mM HEPES，500 mM NaCl）在旋转混合仪（20 rpm）中孵育1小时。</li>
	<li>在室温下以20,000 × g离心1分钟，弃去上清液。用1000 µL HBS500缓冲液洗涤磁珠，重复洗涤步骤共4次。每次洗涤后均在室温下以20,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>将磁珠重悬于500 µL PBS中，取50 µL滴加至玻璃盖玻片上。将显微镜滤光片设置在561或594 nm之间，通过荧光显微镜检测Texas Red–BMPR-IAEC–BMP2-K3Plk功能化磁珠并拍照。</li>
</ol>
5. 检测碱性磷酸酶（ALP）表达以验证耦合反应前后产生的BMP2-K3Plk的体外生物活性。
<ol>
	<li>碱性磷酸酶（ALP）检测
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2的湿润环境中，将成肌前体细胞C2C12（ATCC CRL-172）培养于含10%胎牛血清（FCS）、100 U/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。</li>
		<li>以每孔3 × 104个细胞的密度将C2C12细胞接种至96孔微孔板中，过夜贴壁。弃去培养基，加入含0.5–200 nM BMP2-WT或BMP2-K3Plk的DMEM（每孔100 µL，含2% FCS、100 U/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素），在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育72小时。</li>
		<li>弃去培养基，每孔用100 µL PBS洗涤一次。在摇床上（220 rpm）于室温下用100 µL/孔裂解缓冲液（1% NP-40、0.1 M甘氨酸，pH 9.6、1 mM MgCl2、1 mM ZnCl2）裂解细胞1小时。</li>
		<li>向细胞裂解物中每孔加入100 µL ALP缓冲液（0.1 M甘氨酸，pH 9.6、1 mM MgCl2、1 mM ZnCl2），并加入终浓度为1 mg/mL的新鲜配制对硝基苯磷酸（p-nitrophenylphosphate）。</li>
		<li>加入ALP缓冲液后，立即在酶标仪中于405 nm波长处测定吸光度，之后每5分钟测定一次，直至显色完全。使用逻辑模型 y = A2 + (A1-A2)/(1 + (x/x0)p) 生成剂量-反应曲线并计算EC50值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碱性磷酸酶（ALP）染色
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2的湿润环境中，将成肌前体细胞C2C12（ATCC CRL-172）培养于含10%胎牛血清（FCS）、100 U/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。</li>
		<li>以每孔3 × 104个细胞的密度将C2C12细胞接种至96孔微孔板中，过夜贴壁。弃去培养基，每孔加入20 µL与微珠偶联的BMP2-K3Plk。BMP2-K3Plk偶联微珠悬浮于1000 µL PBS中。</li>
		<li>配制0.4%低熔点琼脂糖的DMEM溶液。在微波炉中加热溶解（600 W，3分钟），随后置于37 °C水浴中冷却备用。</li>
		<li>每孔加入20 µL 0.4%低熔点琼脂糖溶液（覆盖微珠和细胞），在20 °C下以2000 × g离心5分钟。每孔加入80 µL DMEM（含2% FCS、100 U/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素），在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育72小时。</li>
		<li>小心弃去培养基，避免破坏已凝固的0.4%琼脂糖层。每孔加入100 µL 1-Step NBT/BCIP（氯化硝基蓝四氮唑，5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸对甲苯胺盐）底物溶液。</li>
		<li>当紫色染色明显出现后，立即在光学显微镜下观察碱性磷酸酶染色结果。使用明场显微镜观察并拍照记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-2+antagonists+emerge+from+alterations+in+the+low-affinity+binding+epitope+for+receptor+BMPR-II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II.</a> EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).</li>
<li>Hein, J. E., Fokin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28CuAAC%29+and+beyond%3A+new+reactivity+of+copper%28I%29+acetylides%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides.</a> Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).</li>
<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetics+analysis+of+BMP2+uptake+into+cells+and+its+modulation+by+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).</li>
<li>Paarmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+endocytosis+of+Bone+Morphogenetic+Protein2+%28BMP2%29+and+its+receptors+is+dispensable+for+the+initiation+of+Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling.</a> Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).</li>
<li>Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

通过遗传密码子扩展技术生成带标签的蛋白质变体，可将多种非天然氨基酸类似物引入蛋白质一级序列中的几乎任意位置。对于BMP2等骨形态发生蛋白（BMP），常见的标签（如6-组氨酸（His）标签）只能引入到N端，因为该蛋白的C端埋藏于三级结构内部，无法从外部接触。在其他位置引入标签时，标签的尺寸很可能引起结构改变，从而破坏BMP的生物活性。此外，在BMP2序列中引入突变可能影响其复性效率，并可能改变其他蛋白质参数，例如修饰后蛋白质的等电点。因此，既定蛋白质生产流程中的每一步都可能需要根据所获得的蛋白质变体特性进行调整。BMP2-K3Plk的制备确实需要对野生型BMP2的既定表达方法进行修改。我们测试了不同的培养时间或丙氨酰-L-赖氨酸（Plk）浓度（数据未显示），以获得最高的表达产量。幸运的是，复性、分离和纯化步骤无需进一步调整。我们此前已报道，在本实验室制备的其他BMP2变体中，某些蛋白质特性发生了显著变化，因而需要对BMP生产方法的多个步骤进行修改18。所获得的BMP2-K3Plk表现出与野生型蛋白相当的生物学活性。但在高浓度BMP2条件下出现差异，这可能是由于BMP2-K3Plk变体在培养基...

骨组织工程与骨再生的最终目标是克服在治疗骨不连骨折时常见治疗方法所存在的缺陷与局限性。目前主要采用自体或异体移植作为治疗策略，尽管二者均存在若干缺点。理想的骨移植材料应具备诱导成骨的能力，即同时具有骨诱导和骨传导作用，从而实现移植物与宿主骨之间的骨整合。目前，仅有自体移植被视为 &#34;金标准&#34; 因为它具备理想骨移植材料的全部特性。然而，它也存在一些重要的缺点，例如手术时间较长，以及需要额外的创伤部位，通常会带来更多的并发症（例如慢性疼痛、血肿形成、感染、美容缺陷 等等。。而异体移植材料在所有常规方面的特性均不理想1近年来，替代性骨移植技术不断改进，旨在制备具有骨诱导性、骨传导性、生物相容性和可生物降解性的支架材料。由于许多生物材料本身并不具备所有这些成骨特性，因此通常将不同的生长因子（主要是BMP2和BMP7）引入支架中，以增强其成骨潜能。2.
作为一项关键标准，此类生长因子递送系统应能够随时间推移实现可控剂量的释放，以促进细胞募集与黏附、细胞长入及血管生成等关键生物学事件。然而，骨形态发生蛋白（BMPs）以及其他成骨生长因子通常以非共价方式固定化3包埋和吸附技术由于存在初始突释现象，需要使用超生理剂量的蛋白质，从而导致严重的缺点 体内 通常通过诱导骨质增生、骨溶解、肿胀和炎症来影响周围组织4因此，通过共价固定化方法可实现生长因子在递送部位更长时间的保留。化学修饰的BMP2（琥珀酰化）5，乙酰化的6 或生物素标记的7），工程化异源二聚体8或 BMP2 衍生寡肽9 已设计并使用这些构建体以克服与吸收相关的局限性。然而，由于其结构可能阻碍固定化配体与细胞受体的结合，这些构建体的生物活性难以预测。如先前研究所示，为了充分激活所有下游信号通路，参与形成活化配体-受体复合物的全部四个受体链必须与固定的BMP2发生相互作用。10.
为克服固定化因子产物不均一，以及其在生物活性、稳定性和生物利用度方面的局限性，我们设计了一种能够以位点特异性共价结合支架材料的BMP变体。该变体称为BMP2-K3Plk，包含通过遗传密码子扩展技术引入的人工氨基酸11。该变体已成功通过共价偶联策略与支架材料连接，同时保持了其生物学活性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-步法 NBT/BCIP</td><td>Thermo Fisher</td><td>34042</td><td>将溶液加入细胞中</td></tr><tr><td>3-叠氮-7-羟基香豆素</td><td>BaseClick</td><td>BCFA-047-1</td><td>用于点击反应的化学物质</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Biozym</td><td>840101</td><td>ALP 检测用琼脂糖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>叠氮琼脂糖珠</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1038-2</td><td>用于反应的微珠</td></tr><tr><td>BamHI（快速消化酶）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0054</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>BMP受体IA（BMPR-IA）&lt;sub&gt;EC&lt;/sub&gt;</td><td>--</td><td>--</td><td>在本实验室制备</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G-250 染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td>SDS-PAGE考马斯亮蓝染色所用化学试剂</td></tr><tr><td>硫酸铜无水物（CuSO₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13986</td><td>点击反应所用化学物质</td></tr><tr><td>DNA聚合酶和反应缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Kapabiosystems</td><td>KK2102</td><td>KAPA HiFi PCR 试剂盒</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>E5134-1kg</td><td>用于终止点击化学反应的试剂</td></tr><tr><td>异丙基 &amp;szlig;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>卡尔罗特有限公司</td><td>2316.5</td><td>细菌诱导（终浓度 1 mM）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NdeI（Fast Digest 酶）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0581</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>NHS活化的德克萨斯红</td><td>生命技术公司</td><td>T6134</td><td>与受体结合</td></tr><tr><td>对硝基苯基磷酸盐</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>N4645-1G</td><td>碱性磷酸酶</td></tr><tr><td>p25N-hmBMP2&amp;nbsp;</td><td>--</td><td>--</td><td>质粒由 Walter Sebald 惠赠予 J. Nickel</td></tr><tr><td>pET11a-pyrtRNA</td><td>--</td><td>--</td><td>由维尔茨堡大学药剂学与生物药剂学教席提供</td></tr><tr><td>丙炔基-L-赖氨酸（Plk）</td><td>--</td><td>--</td><td>由维尔茨堡大学药剂学与生物药剂学教席提供</td></tr><tr><td>pSRFduet-pyrtRNAsynth</td><td>--</td><td>--</td><td>由维尔茨堡大学制药与生物药剂学教席提供</td></tr><tr><td>Qiagen 胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>凝胶纯化</td></tr><tr><td>Qiagen PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR 纯化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸钠</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>A7631-100G</td><td>用于点击反应的化学物质</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EL0011</td><td>连接反应&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三(3-羟丙基三唑基甲基)胺（THPTA）</td><td>BaseClick</td><td>BCMI-006-100</td><td>用于点击反应的化学物质</td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>X100-1L</td><td>Triton X 100&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon 浓缩细胞 400 ml&amp;nbsp;</td><td>默克股份公司</td><td>UFSC40001</td><td>浓缩单元</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置</td><td>默克股份公司</td><td>UFC901024</td><td>离心浓缩装置</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA avant FPLC</td><td>&amp;Auml;KTA</td><td>--</td><td>FPLC 机器</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP</td><td>贝克曼库尔特&amp;nbsp;</td><td>393124</td><td>细菌培养用离心机</td></tr><tr><td>细菌摇床培养箱</td><td>Infors HT</td><td></td><td>用于细菌培养的摇床培养箱</td></tr><tr><td>FluorChem Q 系统</td><td>蛋白质分析</td><td>--</td><td>SDS-PAGE 成像与分析系统</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Keyence</td><td>BZ-9000（BIOREVO）</td><td></td></tr><tr><td>Fractogel&amp;reg; EMD SO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt; （M）</td><td>默克股份公司</td><td>116882</td><td>离子交换层析柱材料</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&amp;reg;&amp;nbsp;96孔板</td><td>Sigma</td><td>M5811-40EA</td><td>用于细胞培养的96孔板（ALP检测）</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td>ThermoScientific</td><td>--</td><td>离心</td></tr><tr><td>M-20 微孔板摆动桶转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75003624</td><td>用于ALP染色过程中微孔板的微量离心机转子</td></tr><tr><td>微型离心机 - 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>离心</td></tr><tr><td>OriginPro 9.1 G&amp;nbsp;</td><td>OriginLab</td><td>--</td><td>ALP 检测数据分析用软件</td></tr><tr><td>多聚赖氨酸载玻片</td><td>ThermoScientific</td><td>10143265</td><td>显微镜载玻片</td></tr><tr><td>Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>--</td><td>Avanti J-26XP 离心机转子</td></tr><tr><td>Rotor JLA 8.1</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>--</td><td>Avanti J-26XP 离心机转子</td></tr><tr><td>转子 JA 25.50</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>--</td><td>Avanti J-26XP 离心机转子</td></tr><tr><td>Tecan infinite M200 多功能酶标仪</td><td>Tecan Deutschland GmbH</td><td>--</td><td>用于ALP检测的多孔板读板仪</td></tr><tr><td>热循环仪 - Labcycler Gradient</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>--</td><td>PCR</td></tr><tr><td>TxRed - 显微镜滤光片</td><td>Keyence</td><td></td><td>荧光显微镜滤光片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超滤再生纤维素圆盘 3 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLBC04310</td><td>使用 Amicon 浓缩细胞 400 ml</td></tr><tr><td>超滤再生纤维素圆盘，10 kDa</td><td>默克股份公司</td><td>PLGC04310</td><td>使用 Amicon 浓缩细胞器 400 ml</td></tr></tbody></table>

通过点击化学实现骨形态发生蛋白2在固体表面的定点固定

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

用于治疗难愈性长骨缺损的多种治疗策略已得到广泛研究。目前的治疗方法存在若干局限性，因而促使人们将生物材料与成骨生长因子（如骨形态发生蛋白，BMPs）联合使用。常用的吸附或包封方法需要超生理剂量的BMP2，通常导致所谓的初始突释效应，从而引发多种严重不良副作用。克服这些问题的一种可能策略是将蛋白共价连接至支架材料上。此外，为确保产品结果的可重复性，偶联应以位点特异性方式进行。因此，我们构建了一种BMP2变异体，通过密码子扩展技术在BMP2蛋白成熟区引入一种非天然氨基酸（丙炔基-L-赖氨酸），获得BMP2-K3Plk。利用铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC），将BMP2-K3Plk偶联至功能化微珠上。实验证实了偶联后的BMP2-K3Plk仍具有生物学活性

关键词：难愈性骨缺损，骨形态发生蛋白2，BMP2-K3Plk，非天然氨基酸，密码子扩展，位点特异性偶联，铜催化叠氮-炔环加成，生物材料，生长因子递送，组织工程 体外 BMP2-K3Plk功能化微珠的成骨活性已在基于细胞的实验中得到证实。当功能化微珠与C2C12细胞接触时，能够在微珠局部限定的邻近区域诱导碱性磷酸酶（ALP）的表达。因此，通过该技术可制备出能够触发细胞向成骨谱系分化的功能化支架。此外，由于BMP2通过位点特异性偶联实现了定向控制，所需BMP2剂量更低。该方法确保BMP始终以其适宜的空间取向暴露于细胞表面受体，而这一点在采用非位点特异性偶联技术连接因子时无法实现。该工艺产物具有高度可控性，因而可获得性质均一的材料，提升其在修复临界尺寸骨缺损中的应用潜力。

本文介绍了一种将新型BMP2变体BMP2-K3Plk共价偶联至市售叠氮功能化琼脂糖微珠的方法（图1）。通过检测C2C12细胞中碱性磷酸酶（ALP）基因的表达，验证了所制备的BMP2-K3Plk变体的生物活性。体外实验结果显示，野生型BMP2（BMP2-WT）与BMP2-K3Plk诱导的ALP表达水平相似（图2）。
硫酸铜（CuSO4）与抗坏血酸钠（NaAsc）之间的氧化还原反应会产生可能影响BMP2-K3Plk结构完整性从而影响其生物活性的活性氧物种。为验证该蛋白的结构完整性，我们进行了过夜孵育实验，使用CuSO4和NaAsc处理，结果显示BMP2-WT以浓度依赖的方式发生降解（通过还原条件下的SDS-PAGE检测，图3A</str...

掺杂骨形态发生蛋白2（BMP2）的生物材料已被用作治疗骨不连骨折的一种新治疗策略。为了克服因该因子不可控释放所导致的副作用，我们提出一种新的策略，可将该因子定点固定，从而制备出具有增强成骨能力的材料。

针对难愈性长骨缺损的多种治疗策略已得到深入研究。目前采用的治疗方法存在……

本研究的总体目标是通过点击化学方法，将新设计的BMP2变体进行位点特异性共价偶联，从而稳健且可重复地制备一种成骨支架。该方法有助于克服目前常用技术在治疗长骨缺损不愈合时所面临的问题。传统的吸收或包封方法需要超生理剂量的BMP2，从而引发多种严重副作用。该技术的主要优势在于使用较低剂量的新设计BMP2变体，并以侧向定向的方式共价连接到支架上。在37摄氏度条件下，将单个菌落于50毫升含有50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养。将过夜培养物按1:20比例稀释至800毫升 terrific broth 培养基中，该培养基中添加有50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升氨苄青霉素。在37摄氏度下培养菌液，直至600纳米处的光密度达到0.7。然后加入丙泊酚L-赖氨酸，使其终浓度为10毫摩尔。通过加入IPTG诱导基因表达，使其终浓度为1毫摩尔。在37摄氏度下，于180 RPM的摇床中培养菌液16小时。孵育结束后，以9,000 ×g离心整个培养物30分钟。弃去上清液，并将细菌沉淀重悬于30毫升TBSE缓冲液中。称量一个空的离心杯，将重悬的沉淀转移至该空杯中。然后在6,360 ×g条件下离心20分钟。弃去上清液，称量含有沉淀的离心杯。减去空烧杯的重量，以计算沉淀物的重量。然后将沉淀物重新悬浮于 STE 缓冲液中。每 10 克沉淀物使用 200 毫升 STE 缓冲液。将悬浮液在冰上进行超声处理，然后在 6,360 ×g 条件下离心 20 分钟。弃去上清液，称量沉淀物。重复超声和离心步骤四次后，将沉淀物重新悬浮于 100 毫升 TBS 缓冲液中。在 6,360 ×g 条件下离心 20 分钟。弃去上清液并称量沉淀。将沉淀重悬于核酸酶缓冲液中，每克沉淀加入 10 毫升缓冲液，并加入新鲜配制的核酸酶。将悬浮液置于搅拌板上，30 RPM转速下室温孵育过夜。次日向悬浮液中加入Triton缓冲液，所加Triton缓冲液的体积为悬浮液体积的0.5倍。室温孵育10分钟后，以6,360 ×g离心20分钟。弃去上清液，称量沉淀。随后按每克沉淀加入8毫升TE缓冲液的比例重新悬浮沉淀。离心后，弃去上清液并称量沉淀。然后，每克沉淀加入4毫升25毫摩尔的醋酸钠（pH 5）和5毫升6摩尔的盐酸胍（含1毫摩尔DTT），重新悬浮沉淀。将悬浮液置于4°C的搅拌板上，孵育过夜。在75,500 × g 条件下离心20分钟后，上清液中含有未折叠的单体BMP2蛋白。收集上清液，并使用截留分子量为3 kDa的超滤装置将其浓缩至每毫升光密度为20。在搅拌条件下，将浓缩后的单体逐滴加入复性缓冲液中。然后将溶液在避光条件下室温孵育120小时。透析前，使用浓盐酸将溶液的pH值调节至3.0。使用浓缩装置中的10千道尔顿分子量截留膜对透析后的溶液进行浓缩。接下来，将蛋白质溶液上样至已平衡的层析柱，使用缓冲液B进行线性梯度洗脱，收集每管2毫升的洗脱组分。取每管20微升通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，随后用考马斯亮蓝染色，以确定含有单体和二聚体的组分。接着收集含有二聚体的组分。将含有二聚体的组分混合物在4摄氏度条件下，用5升1毫摩尔盐酸缓冲液透析过夜。使用10千道尔顿的浓缩型离心滤膜单元浓缩产物，随后通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析最终产物。将20微摩尔的BMP2-K3Plk或作为阴性对照使用的BMP2-野生型与500微升反应缓冲液中的20微升叠氮活化琼脂糖珠混合。在室温下，以20 RPM的转速旋转孵育两小时。加入终浓度为5毫摩尔的EDTA以终止反应。在室温下，以20 RPM的转速旋转孵育溶液15分钟。然后在室温下以20,000 × g离心样品1分钟，并收集上清液。接着用1,000 µL HBS 500缓冲液洗涤含有珠粒的沉淀。在室温下以20,000 × g再次离心样品1分钟，并收集上清液。用 HBS 500 缓冲液重复此洗涤步骤两次，再用四摩尔氯化镁洗涤三次，最后用 PBS 洗涤两次，每次均收集上清液。将偶联的磁珠储存于 1,000 微升 PBS 中，置于 4 摄氏度保存。按照文本方案中所述进行碱性磷酸酶（ALP）检测。进行碱性磷酸酶（ALP）染色时，将成肌细胞前体C2C12细胞在DMEM培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清以及每毫升100单位的青霉素G和链霉素，于37°C、5%二氧化碳的湿润环境中孵育。以每孔30,000个细胞的密度将C2C12细胞接种至96孔微孔板中。待细胞贴壁过夜后，移除培养基，并向每孔加入20 µL PMB2-K3PLK偶联微珠。然后向每个孔中加入 20 µL 的 0.4% 低熔点琼脂糖。在 20 °C 条件下，以 2,000 ×g 离心 96 孔微孔板 5 分钟。随后加入 80 µL 相同的培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中孵育72小时。孵育结束后，小心移除培养基，避免使凝固的0.4%琼脂糖脱落。每孔加入100微升一步法MBT-BCIP底物溶液。在紫色染色显现后，立即使用光学显微镜分析碱性磷酸酶染色结果。采用明场显微镜观察并拍照。通过检测新产生的BMP2-K3Plk变体在C2C12细胞中诱导碱性磷酸酶基因表达的能力，验证其生物学活性。体外实验显示，全型BMP2或BMP2-K3Plk均可诱导相似水平的碱性磷酸酶基因表达。通过叠氮-炔环加成反应将BMP2-K3Plk固定于微珠表面后，与双标记的BMP受体1A胞外域共孵育时产生荧光信号。BMP受体1A与BMP2-K3Plk的结合证实，偶联后其生物活性得以保留。通过碱性磷酸酶（ALP）介导的染色证实了BMP2-K3Plk功能化微珠的生物活性。染色仅出现在与BMP2-K3Plk功能化微珠直接接触的细胞中，表明该蛋白确实共价连接在微珠上，而不仅仅是被吸附。如果蛋白在吸附状态下被释放，则应在更远距离观察到更广泛的染色分布，正如本实验中经可溶性BMP2-K2Plk处理后所观察到的碱性磷酸酶染色结果所示。观看本视频后，您应能充分理解如何通过基因密码子扩展技术表达并制备具有生物活性的蛋白质，以及如何通过点击化学反应将修饰后的蛋白质共价偶联至微球。原则上，利用基因密码子扩展技术产生蛋白质变异，可实现将非天然氨基酸引入蛋白质一级序列的任意位置。在BMP2序列中引入突变可能影响其复性效率，同时也可能改变蛋白质的相关参数。BMP2-K3Plk 的制备需要对已建立的野生型 BMP2 表达方法进行修改。所制备的 BMP2-K3Plk 表现出与野生型蛋白相当的生物学活性。我们通过点击化学将 BMP2 变体共价偶联至叠氮修饰的琼脂糖微珠的方法能够高效实现，从而获得修饰后的微珠，并在体外呈现出成骨分化效果。必须按照良好实验室规范确保标准防护。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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由肝素和鱼精蛋白制备的自组装聚电解质复合物（PEC）被沉积在海藻酸盐微珠上，用于包埋并调控成骨生长因子的释放。该递送策略可在脊柱融合应用中使BMP-2的剂量减少20倍。本文阐述了PECs的制备方法及其优势。...

用于递送肝素结合域成骨生长因子的聚电解质复合物

本方法中，我们采用光聚合与点击化学技术，在聚乙二醇（PEG）水凝胶表面构建蛋白质或多肽图案，以提供固定的生物活性信号，用于研究细胞响应 体外.

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在含细胞悬浮液中进行陶瓷全向生物打印以生成骨类似物

学习使用点击化学法将BMP2变体共价偶联到支架材料，实现骨形态发生蛋白的定向固定。该方法可降低BMP2用量并减少副作用，为骨缺损修复提供新型生物材料策略。

通过点击化学实现骨形态发生蛋白2在固体表面的定点固定

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