通过点击化学实现骨形态发生蛋白2在固体表面的定点固定

本研究的总体目标是通过点击化学方法，将新设计的BMP2变体进行位点特异性共价偶联，从而稳健且可重复地制备一种成骨支架。该方法有助于克服目前常用技术在治疗长骨缺损不愈合时所面临的问题。传统的吸收或包封方法需要超生理剂量的BMP2，从而引发多种严重副作用。

该技术的主要优势在于使用较低剂量的新设计BMP2变体，并以侧向定向的方式共价连接到支架上。在37摄氏度条件下，将单个菌落于50毫升含有50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养。将过夜培养物按1:20比例稀释至800毫升 terrific broth 培养基中，该培养基中添加有50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升氨苄青霉素。

在37摄氏度下培养菌液，直至600纳米处的光密度达到0.7。然后加入丙泊酚L-赖氨酸，使其终浓度为10毫摩尔。通过加入IPTG诱导基因表达，使其终浓度为1毫摩尔。

在37摄氏度下，于180 RPM的摇床中培养菌液16小时。孵育结束后，以9,000 ×g离心整个培养物30分钟。弃去上清液，并将细菌沉淀重悬于30毫升TBSE缓冲液中。

称量一个空的离心杯，将重悬的沉淀转移至该空杯中。然后在6,360 ×g条件下离心20分钟。弃去上清液，称量含有沉淀的离心杯。

减去空烧杯的重量，以计算沉淀物的重量。然后将沉淀物重新悬浮于 STE 缓冲液中。每 10 克沉淀物使用 200 毫升 STE 缓冲液。

将悬浮液在冰上进行超声处理，然后在 6,360 ×g 条件下离心 20 分钟。弃去上清液，称量沉淀物。重复超声和离心步骤四次后，将沉淀物重新悬浮于 100 毫升 TBS 缓冲液中。

在 6,360 ×g 条件下离心 20 分钟。弃去上清液并称量沉淀。将沉淀重悬于核酸酶缓冲液中，每克沉淀加入 10 毫升缓冲液，并加入新鲜配制的核酸酶。

将悬浮液置于搅拌板上，30 RPM转速下室温孵育过夜。次日向悬浮液中加入Triton缓冲液，所加Triton缓冲液的体积为悬浮液体积的0.5倍。

室温孵育10分钟后，以6,360 ×g离心20分钟。弃去上清液，称量沉淀。随后按每克沉淀加入8毫升TE缓冲液的比例重新悬浮沉淀。

离心后，弃去上清液并称量沉淀。然后，每克沉淀加入4毫升25毫摩尔的醋酸钠（pH 5）和5毫升6摩尔的盐酸胍（含1毫摩尔DTT），重新悬浮沉淀。将悬浮液置于4°C的搅拌板上，孵育过夜。

在75,500 × g 条件下离心20分钟后，上清液中含有未折叠的单体BMP2蛋白。收集上清液，并使用截留分子量为3 kDa的超滤装置将其浓缩至每毫升光密度为20。在搅拌条件下，将浓缩后的单体逐滴加入复性缓冲液中。

然后将溶液在避光条件下室温孵育120小时。透析前，使用浓盐酸将溶液的pH值调节至3.0。使用浓缩装置中的10千道尔顿分子量截留膜对透析后的溶液进行浓缩。

接下来，将蛋白质溶液上样至已平衡的层析柱，使用缓冲液B进行线性梯度洗脱，收集每管2毫升的洗脱组分。取每管20微升通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，随后用考马斯亮蓝染色，以确定含有单体和二聚体的组分。接着收集含有二聚体的组分。

将含有二聚体的组分混合物在4摄氏度条件下，用5升1毫摩尔盐酸缓冲液透析过夜。使用10千道尔顿的浓缩型离心滤膜单元浓缩产物，随后通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析最终产物。将20微摩尔的BMP2-K3Plk或作为阴性对照使用的BMP2-野生型与500微升反应缓冲液中的20微升叠氮活化琼脂糖珠混合。

在室温下，以20 RPM的转速旋转孵育两小时。加入终浓度为5毫摩尔的EDTA以终止反应。在室温下，以20 RPM的转速旋转孵育溶液15分钟。

然后在室温下以20,000 × g离心样品1分钟，并收集上清液。接着用1,000 µL HBS 500缓冲液洗涤含有珠粒的沉淀。在室温下以20,000 × g再次离心样品1分钟，并收集上清液。

用 HBS 500 缓冲液重复此洗涤步骤两次，再用四摩尔氯化镁洗涤三次，最后用 PBS 洗涤两次，每次均收集上清液。将偶联的磁珠储存于 1,000 微升 PBS 中，置于 4 摄氏度保存。按照文本方案中所述进行碱性磷酸酶（ALP）检测。

进行碱性磷酸酶（ALP）染色时，将成肌细胞前体C2C12细胞在DMEM培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清以及每毫升100单位的青霉素G和链霉素，于37°C、5%二氧化碳的湿润环境中孵育。以每孔30,000个细胞的密度将C2C12细胞接种至96孔微孔板中。待细胞贴壁过夜后，移除培养基，并向每孔加入20 µL PMB2-K3PLK偶联微珠。

然后向每个孔中加入 20 µL 的 0.4% 低熔点琼脂糖。在 20 °C 条件下，以 2,000 ×g 离心 96 孔微孔板 5 分钟。随后加入 80 µL 相同的培养基。

在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中孵育72小时。孵育结束后，小心移除培养基，避免使凝固的0.4%琼脂糖脱落。每孔加入100微升一步法MBT-BCIP底物溶液。

在紫色染色显现后，立即使用光学显微镜分析碱性磷酸酶染色结果。采用明场显微镜观察并拍照。通过检测新产生的BMP2-K3Plk变体在C2C12细胞中诱导碱性磷酸酶基因表达的能力，验证其生物学活性。

体外实验显示，全型BMP2或BMP2-K3Plk均可诱导相似水平的碱性磷酸酶基因表达。通过叠氮-炔环加成反应将BMP2-K3Plk固定于微珠表面后，与双标记的BMP受体1A胞外域共孵育时产生荧光信号。BMP受体1A与BMP2-K3Plk的结合证实，偶联后其生物活性得以保留。

通过碱性磷酸酶（ALP）介导的染色证实了BMP2-K3Plk功能化微珠的生物活性。染色仅出现在与BMP2-K3Plk功能化微珠直接接触的细胞中，表明该蛋白确实共价连接在微珠上，而不仅仅是被吸附。如果蛋白在吸附状态下被释放，则应在更远距离观察到更广泛的染色分布，正如本实验中经可溶性BMP2-K2Plk处理后所观察到的碱性磷酸酶染色结果所示。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过基因密码子扩展技术表达并制备具有生物活性的蛋白质，以及如何通过点击化学反应将修饰后的蛋白质共价偶联至微球。原则上，利用基因密码子扩展技术产生蛋白质变异，可实现将非天然氨基酸引入蛋白质一级序列的任意位置。在BMP2序列中引入突变可能影响其复性效率，同时也可能改变蛋白质的相关参数。

BMP2-K3Plk 的制备需要对已建立的野生型 BMP2 表达方法进行修改。所制备的 BMP2-K3Plk 表现出与野生型蛋白相当的生物学活性。我们通过点击化学将 BMP2 变体共价偶联至叠氮修饰的琼脂糖微珠的方法能够高效实现，从而获得修饰后的微珠，并在体外呈现出成骨分化效果。

必须按照良好实验室规范确保标准防护。