体外 SUMO化检测法用于研究SUMO E3连接酶活性

本实验的总体目标是验证一种感兴趣的蛋白质是否可被SUMO化，或其本身是否为SUMO E3连接酶。该方法有助于解答SUMO化领域中的关键问题，例如SUMO E3连接酶的鉴定。该技术的主要优势在于，可用于研究SUMO E3连接酶对不同SUMO亚型的特异性。

本实验操作将由我实验室的博士生 Wan-Shan Young 演示。为纯化标签蛋白 K-bZIP，首先在 14 毫升聚丙烯管中，将 10 毫升细胞裂解液与 50 微升抗体标记的磁珠混合，充分孵育。随后，在 4 摄氏度条件下，以每分钟 50 转的速度于悬浮混合器中旋转孵育 3 小时。

蛋白捕获后，在4°C条件下以800 × g离心30秒，使磁珠沉淀。弃去上清液，仅保留1毫升，用于重悬磁珠。将重悬的磁珠转移至1.5毫升离心管中。

为洗涤捕获的蛋白质，将含有磁珠的离心管置于磁力架上。静置约三秒钟，待磁珠吸附至管壁侧面后，移除上清液。洗涤磁珠时，向1.5毫升离心管中加入一毫升裂解缓冲液。

然后将离心管颠倒十次。接着，将1.5毫升离心管置于磁力架上，待磁珠吸附至管壁后，移除上清液。为再次洗涤磁珠，向1.5毫升离心管中加入一毫升磷酸盐缓冲液，再颠倒十次。

然后将离心管转移至磁力架上，待磁珠吸附至管壁一侧后，移除上清液。为从抗体标记的磁珠中洗脱K-bZIP标记的蛋白质，向1.5毫升离心管中加入100微升磷酸盐缓冲液稀释的八肽，终浓度为每毫升150微克。随后在室温下以每分钟50转的速度在旋转混合仪上孵育10分钟。

将离心管转移至磁力架上，收集含有 K-bZIP 的上清液。接着，取一到五微升纯化的蛋白质进行 SDS-PAGE 分析，随后用考马斯亮蓝染色检测纯化的 K-bZIP 标签。

在凝胶上分别上样 0.5、1 和 2 微克的牛血清白蛋白作为标准品，用于定量 K-bZIP 的浓度。在 Image J 中处理图像后，用磷酸盐缓冲液稀释纯化的 K-bZIP，使其最终浓度达到每微升 100 纳克。

分装成小份，于 -80 摄氏度保存。在体外 SUMO 化反应主混合液中加入 3 µL 浓度为 100 ng/µL 的纯化标记 K-bZIP。然后轻轻混匀主混合液各组分，于 30 摄氏度孵育 3 小时。

接下来，加入20 µL的2X SDS上样缓冲液以终止反应。然后将样品在95 °C加热5分钟，使蛋白质变性。随后，将20 µL样品加入10% SDS-PAGE凝胶中上样。

以80伏电压电泳约120分钟，直至染料迁移至凝胶底部。电泳结束后，关闭并断开凝胶装置电源，将凝胶转移至半干转缓冲液中，孵育5分钟。

然后将PVDF膜浸入另一个装有甲醇的容器中，浸泡1分钟。从甲醇中取出PVDF膜，浸入半干转膜缓冲液中。随后轻轻振荡膜5分钟。

取下半干电泳装置的安全盖。将一张滤纸预先润湿，并在铂阳极底部制备凝胶三明治结构。

将阴极板固定在安全盖内后，在30转/分钟的摇床上以15伏恒定电流电泳90分钟。随后关闭电源，断开半干转装置，取出PVDF膜。现在将PVDF膜置于封闭缓冲液中，在室温下于摇床上以30转/分钟封闭1小时。

接下来，在4°C条件下，将PVDF膜与抗p53抗体和封闭缓冲液在悬臂式混匀仪上孵育12至16小时，转速为每分钟30转。然后取出PVDF膜，转移至盛有含吐温20的Tris缓冲盐水的容器中。接着，将PVDF膜在含吐温20的Tris缓冲盐水中于旋转摇床孵育30分钟，转速为每分钟45转。

然后将PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体在封闭缓冲液中稀释，于室温下在悬浮混合器上以每分钟30转的速度孵育1小时。接着用Tris-缓冲盐水吐温20溶液洗涤PVDF膜三次。洗涤后，将PVDF膜置于Tris-缓冲盐水吐温20溶液中，在悬浮混合器上以每分钟45转的速度浸泡30分钟。

然后用磷酸盐缓冲液替换Tris缓冲盐水Tween 20。将PVDF膜在4°C条件下保存，最长可保存12小时。接下来，按1:1的比例混合增强型化学发光底物试剂一和试剂二。

然后将PVDF膜从磷酸盐缓冲液中取出，用打孔器孔洞处轻轻吸印以去除多余水分。立即向膜表面加入400 µL化学发光试剂，静置三至五分钟。短暂吸印以去除多余的化学发光试剂，注意防止膜完全干燥。

使用Luminescent的成像系统对印迹进行曝光。此处通过免疫印迹分析展示了SUMO化p53靶蛋白所需的Ubc9酶浓度。结果表明，在体外SUMO化实验中，使用SUMO1和SUMO2多肽时，Ubc9酶浓度为常规浓度的1/2和1/5时，即可充分实现对p53蛋白的SUMO化。

为了分析发生SUMO化的p53，将膜用抗p53抗体进行杂交检测。类似的免疫印迹分析用于证明，在体外SUMO化实验中，使用SUMO1、SUMO2和SUMO3肽段对p53靶蛋白进行SUMO化时，仅需一半浓度的E1酶和十分之一浓度的Ubc9酶。此处，膜经考马斯亮蓝染色以显示纯化的K-bZIP蛋白。

采用杆状病毒表达系统表达纯化的K-bZIP，并通过SDS-PAGE分析，以牛血清白蛋白作为标准品进行比较。此外还进行了免疫印迹分析，结果显示，在E1酶用量减半、Ubc9酶用量降至十分之一的情况下，随着K-bZIP浓度的增加，其可催化p53的SUMO化修饰。若操作熟练，该技术在正确实施的情况下可在四小时内完成。

进行该实验操作时，重要的是要记住将体外SUMO化反应所需的所有试剂保持在冰上，并采用系列稀释而非一次性大幅稀释。此外，还可通过其他方法（如过表达SUMO化酶）来验证体外SUMO化反应。该技术建立后，为SUMO化领域的研究人员探索更多SUMO化酶并验证其特异性能力奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用体外模拟实验鉴定SUMO E3连接酶。