Name: 体外sumo 法研究相扑 E3 连接活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 了解体外SUMO化修饰实验方法，用于鉴定新型SUMO E3连接酶并研究其对不同SUMO亚型的特异性。该技术通过抗体标记磁珠纯化目标蛋白，为蛋白质翻译后修饰研究提供可靠工具。

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本研究得到了科技部（MOST，105-2320-B-010-007-MY3，授予PCC）、国家卫生研究院（NHRI-EX105-10215BC，授予PCC）、科技部（MOST 105-2314-B-400-019，授予HJK）以及国家卫生研究院（NHRI MG-105-SP-10、NHRI MG-106-SP-10，授予HJK）的资助。本研究还部分得到了阳明大学论文发表支持项目对PCC的资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或论文撰写过程中均未参与。

1. 杆状病毒表达载体的制备
<ol>
	<li>通过将 K-bZIP 的 cDNA19 克隆到带有 N 端表位标签的双表达杆状病毒载体中（参见材料表），纯化 SUMO E3 连接酶 K-bZIP。我们已成功使用八肽标签（在本方案中始终表示为载体-标签-K-bZIP）。 
	注意：用于 K-bZIP 聚合酶链式反应（PCR）克隆的 DNA 模板，是经多西环素处理后从 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 细胞中分离的 RNA 反转录得到的 cDNA20。
	<ol>
		<li>将全长 K-bZIP cDNA19 转入含有 CpoI 克隆位点的双表达载体中。用 CpoI 在 37 °C 条件下消化 PCR 产物和 1 µg 双表达载体，反应 3 h21。</li>
		<li>在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳后分离并提取消化后的 DNA22。按照制造商说明（参见材料表），使用 T4 DNA 连接酶在 16 °C 条件下连接插入片段（K-bZIP）与载体，反应 30 min。</li>
		<li>将 5 µL 连接产物加入含 50 µL 感受态 E. coli 细胞 &#34;A&#34; 的 1.5 mL 离心管中（参见材料表），冰浴 30 min。随后将离心管置于 42 °C 水浴中孵育 45 s，立即放回冰上冷却 3 min。</li>
		<li>向管中加入 600 µL S.O.C. 培养基（含 0.5% (w/v) 酵母提取物、2% (w/v) 胰蛋白胨、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、20 mM MgSO4 和 4% (w/v) 葡萄糖），于 37 °C 培养 1 h。然后在室温下以 600 x g 离心 3 min。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀用 60 µL LB 培养基（1% (w/v) 胰蛋白胨、0.5% (w/v) 酵母提取物和 85 mM NaCl）重悬，并涂布于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。将平板在 37 °C 培养 16 h23,24。</li>
		<li>挑取单个菌落接种至含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 5 mL LB 培养基中，于 37 °C、250 rpm 振荡培养 16 h。随后根据制造商说明（参见材料表），使用质粒提取试剂盒提取质粒（载体-标签-K-bZIP）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将载体-标签-K-bZIP 转化至感受态 E. coli 细胞 &#34;B&#34;（参见材料表），构建携带标签-K-bZIP 的重组杆粒。
	<ol>
		<li>在 1.5 mL 离心管中混合 0.2 µg 载体-标签-K-bZIP 质粒和 100 µL 感受态 E. coli 细胞 &#34;B&#34;，冰浴 30 min。将离心管置于 42 °C 水浴中孵育 45 s，立即放回冰上冷却 3 min。</li>
		<li>向管中加入 900 µL S.O.C. 培养基，于 37 °C、50 rpm 振荡培养 4 h。随后取 10 µL 培养物，加入额外 50 µL S.O.C. 培养基，涂布于含 50 µg/mL 卡那霉素、7 µg/mL 庆大霉素、10 µg/mL 四环素、100 µg/mL 半乳糖苷底物和 40 µg/mL 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的 LB 琼脂平板上，于 37 °C 培养 48 h。</li>
		<li>挑取一个白色菌落接种至含 50 µg/mL 卡那霉素、7 µg/mL 庆大霉素和 10 µg/mL 四环素的 5 mL LB 培养基中，于 37 °C、250 rpm 振荡培养 16 h。</li>
		<li>提取携带标签-K-bZIP 的重组杆粒 DNA，定量后重悬至浓度为 1 µg/µL25。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将 1 µg 含标签-K-bZIP 的重组杆粒 DNA 转染至 6 孔板中的一孔 Sf9 细胞，生成表达标签-K-bZIP 的重组杆状病毒。
	<ol>
		<li>在 6 孔板每孔中接种 2 x 106 个 Sf9 细胞（参见材料表），加入含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 庆大霉素的 2 mL Grace 昆虫培养基，于 27 °C 培养 1 h。</li>
		<li>将 Sf9 细胞维持在含 10% FBS、1% 庆大霉素和 1% 洗涤剂 C（参见材料表）的 Grace 昆虫培养基中，于 27 °C、140 rpm 振荡培养至对数生长期。使用血细胞计数板和台盼蓝染色计数细胞，细胞活力应高于 95%。每 2–3 天按 1:3 传代一次（最低密度约为 0.5 x 106 个细胞/mL）。</li>
		<li>在 2 mL 离心管中加入 2 µL 杆粒 DNA（1 µg/µL）和 98 µL 低血清培养基（参见材料表）。然后加入 4 µL 转染试剂（参见材料表），充分混匀。室温孵育 15 min。</li>
		<li>将该转染混合物（共 104 µL）加入每孔中，于 27 °C 培养 12–16 h。</li>
		<li>轻柔吸除耗尽的培养基，更换为含 10% FBS 和 1% 庆大霉素的新鲜 Grace 昆虫培养基 2 mL。Sf9 细胞与培养板表面结合较松散，轻柔吸液不会对其造成扰动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后收集重组杆状病毒，并扩增以获得高滴度病毒储备液（P1），用于后续实验。
	<ol>
		<li>换液后 72 h，使用无菌细胞刮刀刮下 Sf9 细胞，将每孔的上清液收集至 1.5 mL 离心管中，涡旋振荡 10 s。</li>
		<li>在 4 °C、150 x g 离心 3 min。收集上清液作为 P0 代杆状病毒，分装至 1.5 mL 离心管中（每管 1 mL），于 -80 °C 保存。</li>
		<li>在 10 cm 培养皿中接种 1 x 107 个 Sf9 细胞，加入含 10% FBS 和 1% 庆大霉素的 10 mL Grace 昆虫培养基，于 27 °C 培养 1 h。</li>
		<li>为扩增表达标签-K-bZIP 的重组杆状病毒，向已接种的 Sf9 细胞中加入 0.5 mL P0 代杆状病毒，于 27 °C 培养 48 h。</li>
		<li>将上清液收集至 15 mL 离心管中作为 P1 代杆状病毒，于 4 °C 保存，可稳定存放长达 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. K-bZIP 的纯化
<ol>
	<li>在27 °C、140 rpm的振荡悬浮条件下，使用添加了10% FBS、1%庆大霉素和1%去垢剂C的Grace昆虫培养基培养Sf9细胞，保持其处于对数生长期，具体操作如步骤1.3.2所述。</li>
	<li>转导当天，将1 mL含有杆状病毒的上清液（P1）加入250 mL密度为2 × 10⁶个/mL的Sf9细胞中6 cells/mL</li>
	<li>将Sf9细胞在27 °C、140 rpm振荡条件下于摇床中孵育72 h，随后在4 °C下以2,740 × g离心15 min收集细胞。</li>
	<li>去除上清液，将细胞沉淀在 10 mL 裂解缓冲液（20 mM HEPES pH 7.9，0.5 M NaCl，1% 去垢剂 A（见 材料表），2% 甘油，蛋白酶抑制剂混合物），在 4 °C 下使用悬浮混合器以 50 rpm 转速旋转孵育 30 分钟。</li>
	<li>以15,000 × g离心细胞裂解液15分钟，收集上清液。</li>
	<li>为纯化tag-K-bZIP，将细胞裂解液（10 mL）与50 µL抗体偶联磁珠在14 mL聚丙烯管中混合，于4 °C以50 rpm在悬浮混合器上旋转孵育3小时。蛋白捕获完成后，在4 °C下以800 × g离心30秒收集磁珠。吸除大部分上清液，用残留的约1 mL液体重悬磁珠，转移至1.5 mL离心管中进行洗涤。</li>
	<li>将含有磁珠的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附至管壁后，吸除上清液。</li>
	<li>用裂解缓冲液洗涤珠子四次。
	<ol>
		<li>向1.5 mL离心管中加入1 mL裂解缓冲液，颠倒混匀10次。将1.5 mL离心管置于磁力架上，按2.7步骤所述去除上清液。</li>
		<li>重复上一步骤另外3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠一次。
	<ol>
		<li>向1.5 mL离心管中加入1 mL PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na2HPO4，1.5 mM KH2PO4），倒置混匀10次。</li>
		<li>将1.5 mL离心管置于磁力架上，然后移除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过向1.5 mL离心管中加入100 µL用PBS稀释的150 µg/mL八肽，从抗体标记的磁珠中洗脱tag-K-bZIP蛋白。室温下将离心管置于悬浮混合器上以50 rpm旋转10分钟。随后将离心管放回磁力架，收集含有K-bZIP的上清液至洁净的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 分析 1–5 µL 纯化的 tag-K-bZIP 蛋白，随后进行考马斯亮蓝染色26在同块凝胶上分别上样 2 µg、1 µg 和 0.5 µg 的牛血清白蛋白（BSA）样品，并使用图像处理软件（如 ImageJ）进行定量分析。通过与 BSA 标准品比较，估算 K-bZIP 的浓度。</li>
	<li>纯化的K-bZIP现已可用于各SUMO化实验。用PBS将K-bZIP稀释至终浓度为100 ng/µL，并分装保存于-80 °C。</li>
</ol>
3. SUMO化检测实验
<ol>
	<li>向每份主混合物中加入 3 µL 浓度为 100 ng/µL 的纯化 tag-K-bZIP 体外 SUMO化反应。主混合液的组分包含1 µL蛋白缓冲液、1x SUMO化缓冲液、0.5 µL p53蛋白（0.5 mg/mL）、25 nM E1激活酶（储备浓度：1 µM）、50 nM E2结合酶（储备浓度：10 µM），以及每种SUMO肽（SUMO-1、SUMO-2或SUMO-3；储备浓度：5 µM）各250 nM，最终体积为17 µL。</li>
	<li>轻轻混匀内容物，在30 °C下孵育反应3小时。加入20 µL 2× SDS-PAGE上样缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 6.8，4% 十二烷基硫酸钠，0.2% (w/v) 溴酚蓝，20% (v/v) 甘油，200 mM β-巯基乙醇）终止反应，并在95 °C下变性样品5分钟。</li>
	<li>在SDS-PAGE上分离样品，使用半干式电泳转膜仪将分离的蛋白质转移至PVDF膜，然后用抗p53抗体进行Western blot分析。
	<ol>
		<li>按照步骤2.11安装凝胶装置，并将20 µL样品加入凝胶孔中。</li>
		<li>以恒定电流80 V运行10%凝胶约120分钟（直至染料条带迁移至凝胶底部）。电泳完成后，关闭电源。</li>
		<li>断开电泳装置和胶板夹，取出凝胶，并将凝胶漂浮于半干转印缓冲液（48 mM Tris-HCl, 39 mM 甘氨酸, 20% 甲醇）中，孵育5分钟。</li>
		<li>取另一个容器，将PVDF膜浸入甲醇中1分钟。随后将PVDF膜从甲醇中取出，放入半干转印缓冲液中，轻轻振荡5分钟。</li>
		<li>取下半干电泳仪的安全盖。</li>
		<li>预先润湿滤纸，并在底部铂金阳极上制备凝胶三明治结构，顺序如下：滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸。</li>
		<li>固定阴极板和安全盖，然后以15 V恒定电流运行电转90分钟。关闭电源，断开半干式转膜仪，取出PVDF膜。</li>
		<li>用封闭缓冲液（TBST 缓冲液中的 5% 脱脂奶粉）封闭 PVDF 膜2，20 mM Tris-HCl，0.1% 去垢剂 B（见 材料表），室温下以 30 rpm 摇速在旋转摇床中孵育 1 小时。</li>
		<li>将PVDF膜与用封闭缓冲液按1:1,000稀释的抗p53抗体在4 °C、30 rpm振荡条件下孵育12–16 h，使用悬臂式混合器。</li>
		<li>将PVDF膜取出放入容器中，并加入TBST。用TBST再冲洗PVDF膜两次。</li>
		<li>将PVDF膜浸泡在TBST中，使用旋转摇床以45 rpm振荡30分钟。</li>
		<li>将PVDF膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体按1:4,000比例用封闭缓冲液稀释后，在室温下以30 rpm振荡孵育1小时，使用悬浮混合器进行杂交。</li>
		<li>按照步骤 3.4.10 所述，用 TBST 洗涤 PVDF 膜 3 次。</li>
		<li>将PVDF膜置于TBST中，在悬浮混合器上以45 rpm振荡浸泡30分钟。弃去TBST，加入PBS，于4 °C保存PVDF膜，最长可保存12小时。</li>
		<li>将增强型化学发光底物（ECL底物）试剂1和试剂2按1:1比例混合（见 材料表). 将PVDF膜从PBS中取出，用纸巾或轻质擦拭布轻轻吸去多余水分，立即在每张膜表面加入400 µL ECL试剂，孵育3-5分钟。用纸巾轻轻吸去多余ECL试剂，但切勿使膜完全干燥。</li>
		<li>使用化学发光成像系统或放射自显影胶片曝光印迹27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何潜在的利益冲突。

这 体外 此处描述的SUMO化实验方案通常用于确定已鉴定的Ubc9底物的SUMO化状态。使用标准方案研究SUMO E3连接酶的SUMO化功能时，主要局限在于SUMO E1活化酶和E2结合酶Ubc9的丰度较高，这会最大程度地促进SUMO的共价连接 体外 系统。鉴于这一挑战，我们认为将SUMO E1和E2酶的用量滴定至其SUMO化活性刚好可被检测的水平，是利用该方法测定SUMO E3连接酶催化活性的唯一可行途径 体外 SUMO化系统。基于该假设，我们成功阐明了K-bZIP的E3连接酶活性，并将其鉴定为一种对SUMO-2/3具有特异性的新型SUMO E3连接酶。
该方案中的关键步骤是使用较低量的 E1 和 E2 酶。如图2所示，通过降低 E1 和 E2 的用量，可能有助于鉴定出具有较低连接酶活性但对底物和 SUMO 旁系同源蛋白保持特异性的新型 SUMO E3 连接酶。该技术的主要局限性在于需要高质量的抗体来识别 SUMO 化底物，因为仅有极小部分的底物能够发生 SUMO 修...

SUMO 修饰最初被确定为一种可逆的翻译后修饰（PTM），可调控蛋白质稳定性1除了直接共价连接外，SUMO 还可通过 SUMO 相互作用基序（SIMs）以非共价相互作用的方式结合到蛋白质上。2与含有Src同源2（SH2）或磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域的分子对酪氨酸磷酸化的结合类似3,4SUMO修饰为含有SIM结构域的效应蛋白提供了额外的相互作用平台，从而实现选择性招募5,6除了调控信号转导外，转录因子和染色质重塑分子的SUMO化修饰也参与调控基因表达7,8. 全基因组范围的SUMO化模式研究表明，SUMO修饰与正向调控相关9,10 或阴性10,11,12 转录调控，部分原因是SUMO化修饰具有旁系同源特异性。
哺乳动物细胞中存在三种主要的SUMO蛋白偶联异构体，分别为SUMO-1以及高度同源的SUMO-2和SUMO-3（统称为SUMO-2/3）13。SUMO通常共价连接至靶蛋白中保守序列基序ψKxD/E内的赖氨酸（K）残基上。SUMO E3连接酶中的SIM结构域负责介导其对SUMO旁系同源物的特异性识别14。与含有数百种E3连接酶的泛素化通路不同，目前仅发现少数几种SUMO E3连接酶15。SUMO E3连接酶的定义特征包括其具备以下能力：(i) 结合Ubc9，(ii) 通过SIM结构域结合SUMO基团，以及(iii) 促进SUMO从Ubc9向底物蛋白的转移。尽管SUMO偶联反应并非绝对依赖E3连接酶16，但E3连接酶可提供底物特异性和SUMO旁系同源物的选择性。由于通常仅有少量靶蛋白发生SUMO修饰，因此在活体（in vivo）条件下检测SUMO化蛋白始终是一项挑战。因此，需要准确且可重复的实验方法，以阐明SUMO修饰的确切功能。
该 体外 SUMO化检测，即评估纯化的Ubc9催化底物蛋白SUMO化能力的实验，是研究SUMO修饰的公认方法17然而，由于存在大量Ubc9，大多数情况下无法检测到SUMO E3连接酶活性，或仅能通过标准方案检测到具有高SUMO E3连接酶活性和低底物特异性的突变型SUMO连接酶的活性18该实验的整体成功在很大程度上取决于对纯化Ubc9的精确滴定。 体外 此处描述的SUMO化检测方法是在标准SUMO化实验方案基础上改进而来的（参见 材料表Kaposi肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）再激活过程中观察到全局SUMO化修饰增强，促使我们鉴定可能介导SUMO化上调的病毒SUMO E3连接酶。通过对病毒SUMO E3连接酶K-bZIP相互作用蛋白的小规模筛选，发现p53是一种新的底物。在本实验方案中，我们详细展示了在昆虫细胞中表达和纯化具有SUMO-2/3特异性的野生型K-bZIP（一种病毒SUMO E3连接酶）的步骤。通过在E1和E2酶用量减少的条件下，评估纯化的K-bZIP增强已知SUMO底物p53的SUMO化能力。利用这种改良的SUMO化检测方法，研究人员可可靠地确定SUMO E3连接酶对新或已知底物进行SUMO化的功能，这是蛋白质SUMO化研究中的首要步骤。此外，该方法有助于鉴定具有低连接酶活性但高底物特异性的新型SUMO E3连接酶。

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>双表达杆状病毒载体</td></tr><tr><td>pCR2.1-TOPO 载体</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>PCR 产物克隆载体</td></tr><tr><td>感受态细胞&amp;nbsp; E. coli DH5&amp;alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 细胞 A</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 细胞 B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>T4 连接酶</td><td>NEW England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>半乳糖苷酶底物</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s 昆虫培养基</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS（碱）</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>去垢剂 A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>去垢剂 B</td></tr><tr><td>泊洛沙姆 188 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>去垢剂 C</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Flag 肽</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>抗 FLAG m2 磁珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>抗体标记磁珠</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 试剂盒</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>标准 SUMO 化实验方案&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 试剂盒</td><td>Active Motif</td><td>40220</td><td>标准 SUMO 化实验方案&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN 质粒小提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td><td>质粒提取试剂盒</td></tr><tr><td>聚丙烯管</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>加样尖</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>印迹滤纸</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>小型垂直电泳装置（Bio-Rad Mini Protean II Cell）</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD 半干式电泳转印槽</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL 蛋白印迹试剂</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL 试剂</td></tr><tr><td>悬浮混合器</td><td>Digisystem laboratory instruments&amp;nbsp; Inc.</td><td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&lt;br/&gt; 生物分子成像仪</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 细胞</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>抗 p53 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>抗兔抗体</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 sumo化检测法用于研究sumo e3连接酶活性

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

小泛素样修饰（SUMO）是一种重要的翻译后修饰（PTM），主要通过调节蛋白质-蛋白质相互作用来介导信号转导。与泛素化修饰类似，SUMO化修饰由一系列级联酶反应催化完成，包括E1激活酶（SAE1/SAE2）、E2结合酶（Ubc9）和E3连接酶（即，PIAS家族、RanBP2和Pc2）。然而，与泛素化不同，SUMO修饰反应并不必需E3连接酶，但E3连接酶可提高修饰的精确性和效率。经SUMO修饰的蛋白质可通过以下方法鉴定 体内 通过使用底物特异性抗体进行免疫沉淀，再结合SUMO特异性抗体进行免疫印迹来检测。然而，证明蛋白质SUMO E3连接酶活性需要 体外 使用纯化的酶、底物和SUMO蛋白重建SUMO化反应体系。由于在 体外 反应通常仅需 SAE1/SAE2 和 Ubc9 即足以实现 SUMO 结合，但由假定的 E3 连接酶增强的 SUMO 化修饰并不总是易于检测。在此，我们描述了一种改良的 体外 使用该SUMO化实验方案可稳定鉴定SUMO修饰 体外 重建系统。本文还提供了一步一步纯化具有催化活性的K-bZIP（一种病毒性SUMO-2/3 E3连接酶）的实验方案。所纯化的K-bZIP对p53（SUMO的一个已知靶蛋白）的SUMO化活性得到了展示。该方案不仅可用于鉴定新的SUMO E3连接酶，还可用于揭示其对SUMO旁系同源蛋白的特异性。

根据制造商提供的信息，SUMO化反应中E1和E2酶的标准用量分别为50 nM和500 nM。首先通过以下实验确定能够对p53进行SUMO化的E2结合酶Ubc9的最低用量： 体外 SUMO化检测。所用Ubc9的量可低至标准方法的五分之一 体外 SUMO化检测实验方案能够高效地对p53进行SUMO化修饰（图1A）。因此，另一组实验采用了标准方案中E1酶用量的一半，以及Ubc9用量的十分之一 体外 SUMO化检测。与标准方案相比，观察到SUMO化效率显著降低（图1B).
因此，利用这些修饰后的条件确定了SUMO E3连接酶K-bZIP增强p53 SUMO化的功能 体外 SUMO化反应条件。从Sf9细胞中...

与泛素连接酶不同，目前已鉴定的E3 SUMO连接酶数量较少。这种修饰 体外 SUMO化实验方案能够通过以下方法鉴定新的SUMO E3连接酶 体外 重建实验

体外 SUMO化检测法用于研究SUMO E3连接酶活性

小泛素样修饰（SUMO修饰）是一种重要的翻译后修饰（PTM），主要介导信号转导……

本实验的总体目标是验证一种感兴趣的蛋白质是否可被SUMO化，或其本身是否为SUMO E3连接酶。该方法有助于解答SUMO化领域中的关键问题，例如SUMO E3连接酶的鉴定。该技术的主要优势在于，可用于研究SUMO E3连接酶对不同SUMO亚型的特异性。本实验操作将由我实验室的博士生 Wan-Shan Young 演示。为纯化标签蛋白 K-bZIP，首先在 14 毫升聚丙烯管中，将 10 毫升细胞裂解液与 50 微升抗体标记的磁珠混合，充分孵育。随后，在 4 摄氏度条件下，以每分钟 50 转的速度于悬浮混合器中旋转孵育 3 小时。蛋白捕获后，在4°C条件下以800 × g离心30秒，使磁珠沉淀。弃去上清液，仅保留1毫升，用于重悬磁珠。将重悬的磁珠转移至1.5毫升离心管中。为洗涤捕获的蛋白质，将含有磁珠的离心管置于磁力架上。静置约三秒钟，待磁珠吸附至管壁侧面后，移除上清液。洗涤磁珠时，向1.5毫升离心管中加入一毫升裂解缓冲液。然后将离心管颠倒十次。接着，将1.5毫升离心管置于磁力架上，待磁珠吸附至管壁后，移除上清液。为再次洗涤磁珠，向1.5毫升离心管中加入一毫升磷酸盐缓冲液，再颠倒十次。然后将离心管转移至磁力架上，待磁珠吸附至管壁一侧后，移除上清液。为从抗体标记的磁珠中洗脱K-bZIP标记的蛋白质，向1.5毫升离心管中加入100微升磷酸盐缓冲液稀释的八肽，终浓度为每毫升150微克。随后在室温下以每分钟50转的速度在旋转混合仪上孵育10分钟。将离心管转移至磁力架上，收集含有 K-bZIP 的上清液。接着，取一到五微升纯化的蛋白质进行 SDS-PAGE 分析，随后用考马斯亮蓝染色检测纯化的 K-bZIP 标签。在凝胶上分别上样 0.5、1 和 2 微克的牛血清白蛋白作为标准品，用于定量 K-bZIP 的浓度。在 Image J 中处理图像后，用磷酸盐缓冲液稀释纯化的 K-bZIP，使其最终浓度达到每微升 100 纳克。分装成小份，于 -80 摄氏度保存。在体外 SUMO 化反应主混合液中加入 3 µL 浓度为 100 ng/µL 的纯化标记 K-bZIP。然后轻轻混匀主混合液各组分，于 30 摄氏度孵育 3 小时。接下来，加入20 µL的2X SDS上样缓冲液以终止反应。然后将样品在95 °C加热5分钟，使蛋白质变性。随后，将20 µL样品加入10% SDS-PAGE凝胶中上样。以80伏电压电泳约120分钟，直至染料迁移至凝胶底部。电泳结束后，关闭并断开凝胶装置电源，将凝胶转移至半干转缓冲液中，孵育5分钟。然后将PVDF膜浸入另一个装有甲醇的容器中，浸泡1分钟。从甲醇中取出PVDF膜，浸入半干转膜缓冲液中。随后轻轻振荡膜5分钟。取下半干电泳装置的安全盖。将一张滤纸预先润湿，并在铂阳极底部制备凝胶三明治结构。将阴极板固定在安全盖内后，在30转/分钟的摇床上以15伏恒定电流电泳90分钟。随后关闭电源，断开半干转装置，取出PVDF膜。现在将PVDF膜置于封闭缓冲液中，在室温下于摇床上以30转/分钟封闭1小时。接下来，在4°C条件下，将PVDF膜与抗p53抗体和封闭缓冲液在悬臂式混匀仪上孵育12至16小时，转速为每分钟30转。然后取出PVDF膜，转移至盛有含吐温20的Tris缓冲盐水的容器中。接着，将PVDF膜在含吐温20的Tris缓冲盐水中于旋转摇床孵育30分钟，转速为每分钟45转。然后将PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体在封闭缓冲液中稀释，于室温下在悬浮混合器上以每分钟30转的速度孵育1小时。接着用Tris-缓冲盐水吐温20溶液洗涤PVDF膜三次。洗涤后，将PVDF膜置于Tris-缓冲盐水吐温20溶液中，在悬浮混合器上以每分钟45转的速度浸泡30分钟。然后用磷酸盐缓冲液替换Tris缓冲盐水Tween 20。将PVDF膜在4°C条件下保存，最长可保存12小时。接下来，按1:1的比例混合增强型化学发光底物试剂一和试剂二。然后将PVDF膜从磷酸盐缓冲液中取出，用打孔器孔洞处轻轻吸印以去除多余水分。立即向膜表面加入400 µL化学发光试剂，静置三至五分钟。短暂吸印以去除多余的化学发光试剂，注意防止膜完全干燥。使用Luminescent的成像系统对印迹进行曝光。此处通过免疫印迹分析展示了SUMO化p53靶蛋白所需的Ubc9酶浓度。结果表明，在体外SUMO化实验中，使用SUMO1和SUMO2多肽时，Ubc9酶浓度为常规浓度的1/2和1/5时，即可充分实现对p53蛋白的SUMO化。为了分析发生SUMO化的p53，将膜用抗p53抗体进行杂交检测。类似的免疫印迹分析用于证明，在体外SUMO化实验中，使用SUMO1、SUMO2和SUMO3肽段对p53靶蛋白进行SUMO化时，仅需一半浓度的E1酶和十分之一浓度的Ubc9酶。此处，膜经考马斯亮蓝染色以显示纯化的K-bZIP蛋白。采用杆状病毒表达系统表达纯化的K-bZIP，并通过SDS-PAGE分析，以牛血清白蛋白作为标准品进行比较。此外还进行了免疫印迹分析，结果显示，在E1酶用量减半、Ubc9酶用量降至十分之一的情况下，随着K-bZIP浓度的增加，其可催化p53的SUMO化修饰。若操作熟练，该技术在正确实施的情况下可在四小时内完成。进行该实验操作时，重要的是要记住将体外SUMO化反应所需的所有试剂保持在冰上，并采用系列稀释而非一次性大幅稀释。此外，还可通过其他方法（如过表达SUMO化酶）来验证体外SUMO化反应。该技术建立后，为SUMO化领域的研究人员探索更多SUMO化酶并验证其特异性能力奠定了基础。观看本视频后，您应能充分理解如何利用体外模拟实验鉴定SUMO E3连接酶。

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

体外sumo 法研究相扑 E3 连接活动

SUMO化检测实验：一种通过免疫印迹法体外检测底物蛋白SUMO化状态的技术

本文描述了在芽殖酵母Saccharomyces...

一种可检测出芽酵母着丝粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80 发生 SUMO 化与泛素化修饰的蛋白质纯化技术

小泛素样修饰蛋白（SUMO）家族蛋白可共价结合至靶蛋白的赖氨酸残基，从而调控多种细胞过程。本文介绍了一种在人源细胞中检测视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白在内源性和外源性条件下发生SUMO化修饰的实验方案。...

体内检测与分析人细胞中Rb蛋白的SUMO化修饰

SUMO 是一种必需且高度保守的小分子泛素样修饰蛋白。本实验方案描述了利用一种耐受应激的重组 SUMO 捕获蛋白（kmUTAG）来可视化多种细胞类型中天然的、未标记的 SUMO...

利用荧光Sumo捕获蛋白定位SUMO化修饰蛋白

本文介绍了一种利用SUMO结合元件（SUBEs）从人肝癌细胞以及肝细胞癌小鼠模型获得的肝肿瘤组织中，在体内富集、分离、鉴定和表征经SUMO修饰蛋白的实验方案。...

用于肝癌中SUMO蛋白组富集、分离、鉴定与表征的SUMO结合元件（SUBEs）工具

本文旨在为RING型E3泛素连接酶的全面生化与功能研究提供一个框架。这一多步骤流程包含详细的实验方案，可用于验证待测蛋白的酶活性，并阐明如何将酶活性与生物学功能相联系。...

体外及植物体内RING型E3泛素连接酶的功能表征

本研究提供了详细的 体外 泛素化检测方案用于分析E3泛素连接酶催化活性。重组蛋白使用原核表达系统（如）进行表达 大肠杆菌...

体外分析E3泛素连接酶功能

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。...

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

本方案重点介绍了一种改进的方法，用于检测和定量由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化，从而能够研究DPC及其翻译后修饰的形成与修复过程。...

DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。...

以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

本方案描述了一种利用哺乳动物细胞裂解液或纯化的泛素酶复合物对Streptococcus...

体外 重建细菌泛素化及VCP/p97介导的清除过程

了解体外SUMO化修饰实验方法，用于鉴定新型SUMO E3连接酶并研究其对不同SUMO亚型的特异性。该技术通过抗体标记磁珠纯化目标蛋白，为蛋白质翻译后修饰研究提供可靠工具。

体外 SUMO化检测法用于研究SUMO E3连接酶活性

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