一种新的体外活体成像法测定星形胶质细胞的吞噬作用 pH 指标-共轭突

该协议提供了一个体外活体成像吞噬试验来测量星形胶质细胞的吞噬能力。纯化大鼠星形胶质细胞和小胶质和 pH 指标-共轭突。该方法可检测实时吞没和降解动力学, 为确定影响星形胶质细胞吞噬能力的因素提供了一个合适的筛选平台。

本实验的总体目标是通过 pH 指示剂缀合突触体的吞噬作用的体外实时成像来检测神经胶质细胞（如星形胶质细胞和小胶质细胞）的实时吞噬和降解动力学。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如如何在健康和患病的大脑中调节神经胶质细胞吞噬作用。该技术的主要优点是，我们可以通过体外培养细胞的实时成像来有效地监测和分析神经胶质细胞的实时吞噬动力学。

该方法还可用于筛选调节神经胶质细胞吞噬和降解能力的因子和化合物。首先，将解冻的突触体样品在 21、092 G 和 4 摄氏度下离心 3 到 4 分钟。吸出上清液后，将沉淀重悬于每管 200 μL 0.1 mol 碳酸钠中，充分混合后向每个样品中加入 2 μL pH 指示剂。

轻轻涡旋后，用铝箔盖保护溶液避光，并将样品放入扭转摇床中，在室温下轻轻搅拌 2 小时。在孵育结束时，加入 1 毫升 Dulbecco PBS 或 DPBS，并通过离心收集突触体，每次洗涤将沉淀重新悬浮在 1 毫升新鲜 DPBS 中。最后一次离心后，将无功能的突触体沉淀重新悬浮在 200 微升补充有 5% DMSO 的 DPBS 中。

对于突触体吞噬的实时成像，首先从汇合星形胶质细胞培养物的每个孔中取出上清液，然后用每次洗涤 1 毫升 DPBS 快速洗涤细胞 3 次。最后一次洗涤后，加入 300 微升免疫淘洗的星形胶质细胞基础培养基和 5 微升 pH 指示剂偶联突触体，以及任何可以调节神经胶质细胞吞噬作用的其他因子。让突触体沉降到孔的底部，并在 37 摄氏度和 5% Co 2 下附着在星形胶质细胞上的磷脂酰丝氨酸受体上。

40 分钟后，弃去上清液，快速但温和地洗涤孔 3 次，每次洗涤 1 毫升 DPBS。最后一次洗涤后，向适当的孔中加入 500 微升补充有感兴趣因子的新鲜培养基，然后将板转移到活成像仪器中。根据实验情况选择成像位置，调整焦距、曝光时间、亮度和 LED 功率，并设置实时成像的图像格式、时间间隔和总周期数。

然后，开始对吞噬作用实验进行实时成像。在适当的实验终点处，打开一个想象分析程序并导入延时图像序列。将图像转换为 8 位灰度，并启动滚动条半径为 50 像素的背景减法。

接下来，打开 Time Series Analyzer V3 插件，并将感兴趣的区域拖到插件中。在感兴趣区域管理器中，单击 Add。在 Time Series V3 插件中，单击 Get Total Intensity （获取总强度）。

然后，保存结果并集成数据。制备后，突触体在其外膜上表达磷脂酰丝氨酸，表明功能丧失，这可以通过星形胶质细胞和小胶质细胞上的磷脂酰丝氨酸受体来识别。当 pH 指示剂偶联的突触体被吞噬时，它们会发出亮红色的荧光。

为了量化神经胶质细胞吞噬作用，可以测量红色荧光信号或吞噬指数的面积。尽管星形胶质细胞可以有效地吞噬大量 pH 指示剂缀合的突触体，但小胶质细胞在吞噬和降解突触体方面速度更快。有趣的是，星形胶质细胞条件培养基中包含的星形胶质细胞分泌因子对于增加星形胶质细胞和小胶质细胞介导的吞噬作用至关重要。

此外，与野生型细胞相比，小鼠 MEGF10 敲除星形胶质细胞的吞噬能力显著受损。开发后，这项技术为神经科学和神经胶质细胞生物学领域的研究人员铺平了道路，以探索神经胶质细胞吞噬作用调节所涉及的机制，作为治疗各种神经系统疾病的潜在方法。