Name: 基于神经网络的发育能力或不称职小鼠全生长卵母细胞的识别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 了解如何利用延时成像和粒子图像测速技术结合神经网络分析，在小鼠卵母细胞体外成熟过程中非侵入性地识别具有发育能力的卵母细胞。该方法可评估雌性配子发育潜力，为辅助生殖技术提供新策略。

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本研究得以完成，得益于以下支持：帕维亚大学FRG 2016项目；帕尔马大学FIL 2014、2016项目；以及Kinesis公司为开展本研究所提供的必要塑料实验耗材。我们感谢英国布里斯托大学工程学院Shane Windsor博士提供Cell_PIV软件。

所有涉及动物的实验程序均经帕维亚大学机构动物护理与使用及伦理委员会批准。动物饲养环境条件为22 °C、60%空气湿度，光照/黑暗循环周期为12:12 h。
1. 卵巢分离
<ol>
	<li>使用无菌的1 mL胰岛素注射器，向2只4至11周龄的CD1雌性小鼠腹腔内注射10 U促卵泡激素。</li>
	<li>等待46–48小时。</li>
	<li>称量小鼠体重，并通过肌肉注射50 mg/kg Zoletil（替来他明和盐酸唑拉西泮）进行麻醉，随后通过颈椎脱臼法处死小鼠。</li>
	<li>用解剖镊夹住覆盖腹壁的皮肤，用剪刀剪开皮肤和体壁，并用镊子将切口拉开。</li>
	<li>用镊子将肠道移至一侧，找到子宫角，并在其末端定位卵巢。</li>
	<li>用钟表镊轻轻夹住卵巢，用剪刀剪断其与子宫相连的韧带，另一侧卵巢重复相同操作。</li>
	<li>将收集的卵巢转移至一个含有1 mL预热至37 °C、5% CO2空气环境下的M2分离培养基的35 mm细胞培养培养皿中。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用精细剪刀去除脂肪组织和输卵管。</li>
</ol>
2. 放射冠-卵母细胞复合体的分离
<ol>
	<li>使用无菌镊子和1G无菌胰岛素针头刺破卵巢表面，直至窦腔卵丘-卵母细胞复合体（COCs）被动释放。</li>
	<li>用口控自制的巴斯德微量移液管（直径200 µm）收集具有三层以上卵丘细胞的COCs，并将其转移至300 µL新鲜M2培养基液滴中。</li>
	<li>使用自制的巴斯德微量移液管（直径80 µm）轻轻吹打数秒，去除包围卵母细胞的卵丘细胞。</li>
	<li>将卵母细胞在20 µL M2培养基液滴之间反复转移，直至卵丘细胞被完全清除。</li>
</ol>
3. 基于染色质组织的卵母细胞分类
<ol>
	<li>从5 mg/mL的母液（溶于1×PBS）开始，用M2培养基将Hoechst 33342染色液稀释至终浓度为0.05 µg/mL。</li>
	<li>在35 mm培养皿盖底部放置3.5 µL的Hoechst染色液微滴。</li>
	<li>将每个单独的卵母细胞转移至一滴Hoechst染色液中，将培养皿置于预热（37 °C）的加热板上，并用避光盖子覆盖，避免光照暴露。</li>
	<li>室温孵育10分钟后，在荧光显微镜下用UV光（330–385 nm）以10倍放大观察卵母细胞，观察时间不超过1–2秒。</li>
	<li>若卵母细胞的核仁周围出现一圈Hoechst染色阳性的染色质，则将其归类为核仁被包围型（SN）（图1A）。</li>
	<li>若卵母细胞的核仁未被Hoechst染色阳性的染色质包围，且在细胞核内呈现弥散的异染色质斑点，则将其归类为核仁未被包围型（NSN）（图1B）。</li>
</ol>
4. 基于神经网络的卵母细胞分类
<ol>
	<li>在35 mm玻璃底培养皿中制备四滴2 µL的α-MEM培养基，培养基中添加5%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、5 mM牛磺酸、100 U/mL青霉素、75 µg/mL链霉素和23.5 µg/µL丙酮酸钠，然后覆盖预热（37 °C）并预先平衡的矿物油，以防止培养基蒸发。 
	注：若使用活细胞筛选系统，可使用7 mm × 7 mm的网格作为参考，保持各液滴之间的特定距离。</li>
	<li>将3–4个卵母细胞转移至每滴培养基中。</li>
	<li>将玻璃底培养皿放入配备延时成像记录软件的活细胞筛选系统（见材料表），在温度稳定（37 °C）和CO2浓度恒定（5%）的环境中观察卵母细胞成熟过程。</li>
	<li>打开延时成像记录软件，屏幕左侧显示卵母细胞的实时图像，右侧显示所有设置按钮。</li>
	<li>选择卵母细胞中心，将其定位在屏幕中央；必要时调整焦距。</li>
	<li>选择Ph按钮，并将DIA Lamp设置为192；曝光时间设置为1/125 s；增益设置为1.99；分辨率设置为1600 × 1200。</li>
	<li>选择FL2，并将DIA Lamp设置为5；曝光时间设置为3 s；增益设置为2.37；分辨率设置为1600 × 1200。</li>
	<li>点击新建点按钮，以记录卵母细胞在培养液滴中的位置。对液滴内的每个卵母细胞重复相同操作。</li>
	<li>选择时间，并将采集周期设置为8 min，总时间设置为15 h。</li>
	<li>点击开始延时成像以启动记录循环。</li>
	<li>打开MATLAB软件，输入>>cell_piv，然后选择PIV工具。</li>
	<li>选择包含录制视频的文件夹，并加载任意一个.jpeg文件以导入整个图像序列。对每个卵母细胞，通过点击选择区域工具选定感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>在文件菜单中选择处理PIV，然后点击查看器工具按钮。 
	注：程序将计算ROI内的速度矢量，并自动生成一个以.mat格式保存的数据文件。</li>
	<li>打开.mat文件，点击选择ROI工具按钮，在卵母细胞轮廓周围绘制一个圆形，然后在文件菜单下点击保存。 
	注：该区域内的矢量将被显示，图形窗口中的平均幅值数据也将更新为该新ROI的结果。</li>
	<li>将整个延时成像序列中收集的平均幅值数据导入电子表格，行表示帧序列，列表示每个被分析的单个卵母细胞。</li>
	<li>将NSN和SN卵母细胞的数据分别组织为10个子组。</li>
	<li>使用9个子组迭代训练前馈人工神经网络（FANN），1个子组用于盲法测试。
	<ol>
		<li>重复上述过程9次，每次更换盲法测试样本（10折交叉验证）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开MATLAB，运行自定义脚本main，根据提示输入训练数据文件名（train.txt）、用于训练的NSN和SN卵母细胞数量，以及待分析的延时成像时间区间（通常为第1–2帧至第112–113帧）。</li>
	<li>按回车键开始训练。</li>
	<li>输入测试数据文件名（test.txt）。</li>
	<li>在MATLAB工作区中打开向量test_outputs_cyt。 
	注：屏幕上将出现一个窗口，第一行显示NSN和SN卵母细胞获得真阳性（TP或真NSN）和假阳性（FP或假NSN）的概率；第二行显示获得假阴性（FN或假SN）和真阴性（TN或真SN）的概率。</li>
	<li>使用公式：(TP+TN)/(TP+FP+FN+TN)，计算FANN的准确率，以百分比表示。</li>
</ol>

<ol><li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li>
<li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Human.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380(2013).</li>
<li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li>
<li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li>
<li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li>
<li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417(2011).</li>
<li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-%CE%B6-induced+Ca2%2B+oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li>
<li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed+forward+artificial+neural+network%3A+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li>
<li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Comput.+Intell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在对小鼠卵母细胞以及其他物种卵母细胞执行本方案时，有几个关键步骤需要特别注意。一旦从卵泡中分离出来，应立即将卵母细胞转移至记录液滴中，因为与伴随之卵丘细胞分离会启动核膜破裂（GV）至第二次减数分裂中期（MII）的转变过程。本方案的一个可能改进措施是在用于卵母细胞复合体（COCs）分离的M2培养基中添加3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）。IBMX可防止GV-to-MII转变的即时启动，从而实现整个实验组卵母细胞的同步化。
我们实验中使用的活细胞筛选系统（见材料表）将成熟液滴数量限制为每滴4个卵母细胞，共4滴，即每次实验最多16个卵母细胞。通过使用其他 commercially available 且配备多个培养腔室的延时活细胞筛选系统，可克服这一限制。
根据我们的经验，每帧图像与其后续帧之间的记录间隔是一个关键因素。经过多次预实验，我们确定每8分钟拍摄一次图像，因为这是能够清晰观察生发泡破裂和第一极体排出等GV至MII期转变过程中主要事件的最短时间窗口。在观察其他物种的卵母细胞时，该时间窗口...

女性不孕症是一种影响越来越多女性的病理状态。根据世界卫生组织的数据，大约20%的夫妇存在不孕问题，其中40%是由于女性不孕所致。此外，接受癌症治疗的女性中有三分之一（美国每年约30万名，意大利每年约3万名）会发生早发性卵巢功能衰竭。
一种预防癌症患者不孕的策略是在肿瘤治疗前分离并冷冻保存卵巢卵泡，随后 体外 卵母细胞由生发泡期（GV期）体外成熟至第二次减数分裂中期（MII期）的过程（GV-to-MII转变）。无创性卵母细胞发育潜能标志物的可及性将有助于改善受精与胚胎发育过程，并提高整体妊娠成功率1,2.
根据活体荧光染料Hoechst 33342染色后观察到的染色质构型，哺乳动物完全生长期的卵母细胞可分为核仁周围型（SN）和非核仁周围型（NSN）。3除了染色质组织不同外，这两种卵母细胞在形态和功能上也存在诸多差异3,4,5,6,7,8,9，包括其减数分裂能力和发育潜能。当从卵巢中分离并进行成熟培养时 体外, 两种类型的卵母细胞均可达到MII期，受精后均能发育至2细胞期，但只有具有SN型染色质结构的卵母细胞才能发育至足月9尽管作为一种选择胜任者的分类方法效果良好 与 非成熟卵母细胞的主要缺点是荧光染料本身以及尤其用于其检测的紫外光可能对细胞产生的诱变效应。
基于上述所有原因，我们致力于寻找其他与SN或NSN染色质构型相关的非侵入性标志物，以替代Hoechst染料的使用，同时保持相同的高分类准确率。胞质运动速度（CMV）的延时观察正逐渐成为反映细胞状态的独特特征。例如，近期研究表明，在受精时记录的CMV与小鼠和人类合子完成着床前及足月发育的能力之间存在关联10,11。
基于这些早期研究，本文描述了一种用于识别具有发育能力或无发育能力的小鼠完全生长期卵母细胞的平台5,6,7,8。该平台包括三个主要步骤：1）从窦状卵泡中分离卵母细胞，并根据其染色质构型将其分类为核仁周围型（SN）或非核仁周围型（NSN）；2）利用粒子图像测速技术（PIV）采集并分析单个卵母细胞在GV至MII期转变过程中皮质肌动蛋白流动（CMV）的时间推移图像；3）将PIV获得的数据输入前馈型人工神经网络（FANN）进行盲分类分析12,13。我们详细阐述了该方法中针对小鼠设计的关键步骤，以便其可被进一步测试并应用于其他哺乳动物物种（e.g., 牛、猴和人类）。

<table><tbody><tr><td>Folligon</td><td>Intervet</td><td>A201A02</td><td>激素处理</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>用于卵母细胞异染色质染色</td></tr><tr><td>细胞培养培养皿 35 mm x 10 mm&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430165</td><td>用于COCs分离</td></tr><tr><td>EmbryoMax M2培养基（1X），液体，含酚红</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>用于COCs分离</td></tr><tr><td>MEM Alpha培养基（1X）+ Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td>用于卵母细胞体外成熟</td></tr><tr><td>35 mm玻璃底细胞培养培养皿&amp;nbsp;</td><td>WillCo&amp;nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>用于成像实验</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MFA91001</td><td>活细胞筛选系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Delchimica Scientific Glassware</td><td>6709230</td><td>用于卵泡操作</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>防止污染和培养基蒸发</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>防止培养基污染&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML16141079</td><td>用于配制&amp;alpha;MEM培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>用于配制&amp;alpha;MEM培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>用于配制&amp;alpha;MEM培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3310</td><td>用于配制&amp;alpha;MEM培养基</td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;P4562</td><td>用于配制&amp;alpha;MEM培养基</td></tr><tr><td>Zoletil（替来他明和盐酸唑拉西泮）</td><td>Virbac Srl</td><td>QN01AX9</td><td>用于小鼠麻醉</td></tr><tr><td>Cell_PIV软件&amp;nbsp;</td><td>由英国布里斯托大学Shane Windsor博士惠赠</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>用于多范式数值计算</td></tr></tbody></table>

基于神经网络的小鼠完全生长期卵母细胞发育潜能识别

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

不孕症诊所将受益于选择具有发育潜能的胚胎的能力 与 使用非侵入性方法筛选无发育潜能的卵母细胞，从而提高整体妊娠结局。我们近期开发了一种分类方法，基于对小鼠卵母细胞在发育过程中进行显微活体观察 体外 从生发泡（GV）期到第二次减数分裂中期（metaphase II）的成熟过程，随后分析此时间推移期间发生的细胞质运动。本文提供了该实验方法的详细操作流程。卵母细胞从完全成熟的有腔卵泡中分离后，置于配备时间推移成像系统的显微镜中，在37 °C、5% CO₂条件下培养15小时。2每隔8分钟拍摄一次图像。采用粒子图像测速法（Particle Image Velocimetry, PIV）对图像进行分析，计算每个卵母细胞在整个培养期间的胞质流动速度（Cytoplasmic Movement Velocities, CMVs）分布曲线。随后，将每个卵母细胞的CMVs数据输入一种数学分类工具（前馈型人工神经网络，Feed-forward Artificial Neural Network, FANN），该工具可预测配子是否具有发育潜能，预测准确率达91.03%。本方案虽建立于小鼠模型，但未来可应用于其他物种（包括人类）卵母细胞的检测。

图2 分别展示了体外成熟（IVM）过程开始阶段（GV期）和结束阶段（MII期）具有代表性的发展成熟能力和不具发展成熟能力的卵母细胞。完全生长的小鼠卵母细胞的体外成熟过程在15小时的培养期间完成。时间推移观察记录了减数分裂的进程，并检测到主要的减数分裂事件，包括生发泡破裂（GVBD）和第一极体的排出。
对两百多个具有发育潜能的样本进行分析与比较 与 发育能力差的卵母细胞在减数分裂进程上表现出时间差异。具体而言，在NSN型卵母细胞中，生发泡破裂（GVBD）显著延迟了1-2个时间间隔帧，而第一极体（PB1）排出则延迟约15帧。尽管存在这些差异，但个体变异度过高，无法实现单个卵母细胞的准确分类。因此，本研究引入了一种数学分类工具来优化该分析流程。
<strong ...

在此，我们介绍一种在卵母细胞发育过程中进行非侵入性评估其发育潜能的实验方案 体外 从生发泡期到第二次减数分裂中期的成熟过程。该方法结合了延时成像、粒子图像测速技术（PIV）和神经网络分析。

不孕症诊所若能通过非侵入性方法区分具有发育潜能与无发育潜能的卵母细胞，将大受裨益，从而……

本实验的总体目标是利用一种非侵入性工具识别具有背面发育潜能的卵母细胞。该方法的主要优势在于，仅通过观察体外成熟过程中卵母细胞的运动，即可评估雌性配子的发育潜能。该技术基于延时成像与粒子图像测速法，并结合基于神经网络的分析。在此，我们将描述一系列实验步骤，以证明小鼠卵母细胞在从生发泡期向第二次减数分裂中期转变的过程中，其胞质运动模式存在差异，且这种差异与其发育潜能的高低显著相关。根据世界卫生组织的定义，不孕症是一种影响约20%夫妇的病理状态；此外，接受癌症治疗的女性中有三分之一面临发生早发性卵巢功能衰竭的风险。这一比例分别相当于美国约30万名女性，或意大利约3万名女性。设计用于识别卵母细胞发育潜能的非侵入性方法将有助于提高妊娠结局的整体成功率。本文详细描述了在小鼠中建立的该方法最关键的步骤，以便其能够被快速应用于其他哺乳动物物种（如牛或人类）的测试与使用。将卵巢转移至含有预热并平衡的M2培养基的培养皿中，置于37摄氏度、5% CO2条件下。如果卵巢周围仍附有输卵管和部分脂肪组织，则应将其去除。随后用镊子夹住卵巢，使用无菌的1G针头穿刺卵巢表面。将穿刺后的卵巢从M2培养基中取出，用手工拉制的微移液管将其转移到新的洁净M2培养基中，然后反复吹打数秒，直至完全去除包裹卵母细胞的卵丘细胞。接下来，将卵母细胞转移至含有20 µL M2培养基的液滴中，如果仍有部分卵丘细胞残留，则通过在多个液滴之间反复转移卵母细胞，彻底去除卵丘细胞，直至完全清除。为了配制终浓度为0.05 µg/mL的Hoechst 33342染色液，我们首先使用一次性PBS配制浓度为5 mg/mL的Hoechst母液，然后将其进一步稀释至所需浓度。将3.5 µL的Hoechst染色液滴加在培养皿盖底部，随后将每一个稀释后的卵母细胞分别转移至单独的Hoechst液滴中，并在染色过程中注意减少光照，可通过用深色皿盖覆盖培养皿来实现。染色十分钟后，在紫外光下用荧光显微镜观察卵母细胞。根据染色质构型，若卵母细胞的核仁周围存在一圈x阳性染色质，则归类为“核仁周围型”（SN）；若核仁周围无x阳性染色质环，且整体染色质在核内呈弥散分布，则归类为“非核仁周围型”（NSN）。在玻璃底培养皿上放置四滴、每滴两微升的α-MEM培养基，注意保持各液滴之间的特定距离，液滴表面覆盖预热并预先平衡的矿物油，每个液滴中转移入总共三至四个卵母细胞。将培养皿转移至延时显微镜的培养室中，以维持长期的培养环境，温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5%，并使用红色LED光源进行照明。在进行延时分析之前，利用BioStation软件设定每滴液滴的坐标，以便在延时成像过程中自动逐个切换视野。延时图像以每8分钟采集一帧的频率连续采集，总时长为15小时。随后使用 CellPave 软件分析所记录的视频，该软件可检测以速度矢量表示的细胞质运动。首先，利用 CellPave 工具手动划定每个卵母细胞的周长边界。然后，软件通过比较连续两个延时成像帧，计算细胞质运动的速度，并以彩色箭头表示，箭头颜色的强度和长度分别定义了运动的速度和方向。此处所见卵母细胞下方的直方图描述了SN卵母细胞在15小时记录期内整体胞质运动的速度。对NSN卵母细胞也进行了相同类型的分析。请注意，与SN卵母细胞相比，NSN卵母细胞显示出第一极体排出峰的延迟。屏幕底部显示卵母细胞胞质流动速度的时间模式。该速度通过比较连续两帧图像计算得出。随后，将胞质流动速度的原始数据导出至Excel表格，表格的行表示Frens序列，列表示所分析的单个卵母细胞。左侧为SN卵母细胞的数据，右侧为NSN卵母细胞的数据。随后将SN或NSN卵母细胞的数据分为10个子组，其中9个用于训练，以绿色表示。另取一份用于盲法测试，红色。此步骤共重复10次，每次更换盲法测试样本。随后通过前馈人工神经网络（FANN）对数据进行分析。该FANN用于分析整个延时成像的帧序列，这些帧序列在此被称为输入神经元。输入神经元连接至三个隐藏神经元，而隐藏神经元又连接至两个输出神经元。其中一个输出给出输入为成熟卵母细胞的概率。而另一种情况则相反，即输入的是一个不具备发育潜能的卵母细胞。通过比较这两种输出结果，可预测卵母细胞的发育潜能，准确率达到91.03%。该技术已建立用于小鼠卵母细胞，如此处所示。然而，未来的应用是将其应用于人类卵母细胞的检测。事实上，在辅助生殖技术领域，特别需要通过非侵入性方法来评估卵母细胞质量。

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发育生物学

基于神经网络的发育能力或不称职小鼠全生长卵母细胞的识别

卵母细胞在减数分裂成熟过程中由于染色体分离错误而容易发生非整倍性。非整倍体卵子可导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。本文介绍了将目标物质导入卵母细胞的方法，以及研究减数分裂成熟过程和评估倍性的方法。...

小鼠卵母细胞显微注射、成熟及倍性评估

本文介绍了一种基于核仁组织对小鼠窦状卵泡卵母细胞进行表征的实验方案。...

基于核仁染色质结构的小鼠窦卵泡卵母细胞的分离与鉴定

随着与人类疾病相关的遗传变异逐渐被揭示，开发能够快速评估这些已鉴定变异生物学意义的系统变得日益重要。本方案描述了利用小鼠卵母细胞评估人类基因在女性减数分裂Ⅰ期中功能的方法。...

利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能

卵巢组织培养可作为卵泡发育、排卵和卵泡闭锁的模型，并揭示动态卵巢过程的调控机制。...

小鼠卵巢组织培养以观察卵巢中的现象

本文介绍、比较并对比了两种用于准确计数固定小鼠卵巢组织卵泡的不同技术。...

成年小鼠卵巢中卵泡的精确计数

本文介绍了一种优化的完整卵巢成像方案，可用于通过整体免疫染色、多光子显微镜以及三维可视化与分析进行定性和定量研究。该方案适用于高通量、可靠且可重复的操作，可用于卵巢功能的毒理学、临床诊断及基因组学检测。...

小鼠卵巢储备发育过程中全卵巢免疫荧光、透明化及多光子显微镜定量三维分析

染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。...

小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

小鼠卵母细胞减数分裂染色体铺片的制备用于联会与重组的评估

本方案描述了以下操作步骤 体外 小鼠卵母细胞的成熟， 体外...

小鼠卵母细胞体外成熟、受精及植入前胚胎培养

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。...

小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

了解如何利用延时成像和粒子图像测速技术结合神经网络分析，在小鼠卵母细胞体外成熟过程中非侵入性地识别具有发育能力的卵母细胞。该方法可评估雌性配子发育潜力，为辅助生殖技术提供新策略。

基于神经网络的小鼠完全生长期卵母细胞发育潜能识别

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