March 3rd, 2018
在这里, 我们提出了一个非侵入性评估的卵母细胞发育能力在他们的体外成熟从生发泡到中期 II 阶段。该方法将时间推移成像与粒子图像测速 (PIV) 和神经网络分析相结合。
该程序的总体目标是使用非侵入性工具识别具有背部发育能力的 occytes。这种方法的主要优点是,通过简单地观察体外成熟过程中发生的卵母细胞运动,可以评估雌性配子的发育潜力。该技术基于延时成像与粒子图像测速法(一种基于神经网络的分析)相结合。
在这里,我们将描述为证明小鼠卵母细胞在从生发囊泡过渡到中期第二阶段期间,表现出与其发育能力或无能显着相关的所述质细胞运动的不同特征所采取的步骤。根据世界卫生组织的数据,不孕症是一种影响约 20% 夫妇的病症,此外,三分之一接受癌症治疗的女性有卵巢早衰的风险。这分别相当于美国或意大利等国家/地区的约 300, 000 或 30, 000 名女性。
设计用于识别卵母细胞发育能力的非侵入性程序将有助于提高妊娠结局的整体成功率。在这里,我们详细介绍了为小鼠开发的程序的最关键步骤,以便使其易于测试和用于其他哺乳动物物种,如牛或人类。将卵巢转移到含有预热和平衡的 M2 培养基的培养皿中,培养皿为 37 摄氏度和 5% 的 CO 2 。
如果输卵管和一些脂肪仍然存在于卵巢周围,则应将其切除。然后,用一把镊子夹住卵巢,用无菌的 1G 针刺穿卵巢表面。从 M2 培养基中取出穿刺的卵巢,并使用手拉微量移液器,首先移动到新的干净 M2 培养基中,然后移入和移出几秒钟,直到卵母细胞周围的卵丘细胞完全去除。
接下来,将卵母细胞转移到 20 μL M2 培养基中,如果一些卵丘细胞持续存在,则通过从一滴到另一滴的几次传代彻底去除它们,直到卵丘细胞完全消除。为了制备终浓度为 0.05 μg/mil 的 Hoechst 33342,我们首先使用浓度为 5 mil/mil 的 Hoechst 温和溶液,在一次性 pbs 中制备,然后进一步稀释直至获得所需的浓度。将 3.5 微升微滴 Hoechst 溶液置于培养皿盖的底部,然后将每个稀释的卵母细胞转移到单个 Hoechst 滴中,小心减少 Hoechst 染色过程中的光线照射,用深色盖子盖住培养皿。
染色 10 分钟后,在紫外光荧光显微镜下观察卵母细胞。根据染色质构象,如果它们在核仁周围呈现一圈 x 阳性染色质,则它们被分类为包围核仁 (SN),或者如果核仁缺乏 x 阳性染色质环并且整体染色质似乎分散在核仁中,则被归类为非包围核仁 (NSN)。将四滴 2 微升的 α mem 培养基滴放在玻璃底培养皿上,小心地将液滴保持在特定距离内,滴剂覆盖预热和均衡的矿物油,总共将三到四个卵母细胞转移到每滴中。
将培养皿转移到延时显微镜的培养室中,该显微镜可以长时间保持 37 摄氏度和 5% CO2 的温度,并使用红色 LED 灯照明。在延时分析之前,使用 BioStation 软件设置每个液滴的坐标,以便在延时程序中自动从一个液滴通过到下一个液滴。延时摄影帧以 8 分钟为间隔拍摄,总共 15 小时。
然后使用 CellPave 软件分析录制的电影,该软件可以检测以速度矢量表示的细胞质运动。首先,使用 CellPave 工具,手动划定每个卵母细胞的周长。然后,软件计算在两个连续延时帧之间的比较中发生的细胞质运动速度,并通过放置一个彩色箭头来表示,该箭头的颜色强度和长度定义了运动的速度和方向。
此处看到的卵母细胞下方的直方图描述了 SN 卵母细胞在 15 小时记录期内的整体细胞质运动速度。对 NSN 卵母细胞进行相同类型的分析。请注意 NSN 卵母细胞与 SN 卵母细胞相比显示的延迟极体 1 挤出峰。
屏幕底部显示卵母细胞细胞质运动速度的时间模式。速度是通过比较两个连续的帧来计算的。然后将细胞质运动速度的原始数据导出到 Excel 表格中,在行上报告 Frens 序列,在列上报告分析的单个卵母细胞。
左侧是 SN 卵母细胞的数据,而右侧是 NSN 卵母细胞的数据。然后将 SN 或 NSN 卵母细胞的数据分成 10 个子组。九个用于训练,绿色。
一个用于盲测,红色。此过程总共重复 10 次。每次更换盲测样本。
然后通过前馈人工神经网络 (FANN) 检查数据。FANN 旨在分析整个延时帧,此处命名为 Input Neurons"后者连接到三个隐藏的神经元,它们本身与两个输出神经元相连。一个输出给出了输入是合格卵母细胞的概率。
另一种恰恰相反,输入是无能的卵母细胞。两个输出之间的比较以 91.03% 的准确率预测卵母细胞硬糖智力。该技术已针对小鼠卵母细胞进行设置,如下所示。
然而,未来的召回是在人类卵母细胞上进行测试。事实上,在人工生殖技术领域,特别需要来自卵母细胞质量分析的非侵入性程序。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
本文介绍了一种用于评估体外成熟过程中卵母细胞发育能力的非侵入性协议。该方法结合了时间序列成像和粒子图像测速法(PIV)以及神经网络分析。
Assessing oocyte developmental competence non-invasively addresses a critical bottleneck in assisted reproductive technologies by enabling early selection of viable gametes. This approach supports predictive confidence in fertility treatment pipelines by correlating cytoplasmic movement profiles with developmental outcomes. The method’s adaptability to human oocytes offers translational value for improving IVF success rates and reducing clinical trial attrition in reproductive medicine.
The method integrates into early discovery workflows by providing a predictive assay for oocyte quality prior to fertilization, enabling go/no-go decisions in gamete selection pipelines.