基于神经网络的小鼠完全生长期卵母细胞发育潜能识别

本实验的总体目标是利用一种非侵入性工具识别具有背面发育潜能的卵母细胞。该方法的主要优势在于，仅通过观察体外成熟过程中卵母细胞的运动情况，即可评估雌性配子的发育潜能。该技术基于延时成像与粒子图像测速法，并结合基于神经网络的分析。

在此，我们将描述一系列实验步骤，以证明小鼠卵母细胞在从生发泡期向第二次减数分裂中期转变的过程中，其胞质运动表现出不同的特征，且这些特征与其发育潜能的高低存在显著相关性。根据世界卫生组织的定义，不孕症是一种影响约20%夫妇的病理状态；此外，接受癌症治疗的女性中有三分之一面临卵巢早衰的风险。这一比例分别相当于美国约30万名女性，或意大利约3万名女性。

设计用于识别卵母细胞发育潜能的非侵入性方法将有助于提高妊娠结局的整体成功率。本文详细描述了在小鼠中建立的该方法最关键的步骤，以便其能够被快速应用于其他哺乳动物物种（如牛或人类）的测试与使用。将卵巢转移至含有预热并平衡的M2培养基的培养皿中，置于37摄氏度、5% CO2的环境中。

如果卵巢周围仍附着输卵管和部分脂肪组织，则应将其去除。随后用镊子夹住卵巢，使用无菌的1G针头穿刺卵巢表面。将穿刺后的卵巢从M2培养基中取出，用手工拉制的微移液管将其转移到新的洁净M2培养基中，反复吹打数秒，直至完全去除包裹卵母细胞的颗粒细胞。

接下来，将卵母细胞转移至含有20微升M2培养基的液滴中，如果仍有部分卵丘细胞残留，则通过在多个液滴之间反复转移卵母细胞，彻底去除卵丘细胞，直至完全清除。为了配制终浓度为0.05微克/毫升的Hoechst 33342染色液，我们首先使用浓度为5毫克/毫升的Hoechst母液（溶于1×PBS中），然后将其进一步稀释至所需浓度。取3.5微升稀释后的Hoechst溶液滴加在培养皿盖底部，将每一个已稀释的卵母细胞分别转移至单独的Hoechst液滴中，并在染色过程中注意减少光照，可通过用深色皿盖覆盖培养皿来实现。

染色十分钟后，在紫外光下用荧光显微镜观察卵母细胞。根据染色质构型，若卵母细胞的核仁周围存在一圈X阳性染色质，则归类为“核仁周围型”（Surrounded Nucleolus, SN）；若核仁周围无X阳性染色质环，且整体染色质在核内呈弥散分布，则归类为“非核仁周围型”（Not-Surrounded Nucleolus, NSN）。在玻璃底培养皿上放置四滴、每滴两微升的α-MEM培养基，注意保持各液滴之间的特定距离，然后覆盖预热并预先平衡的矿物油，将总共三至四个卵母细胞转移至每滴培养基中。

将培养皿转移至延时显微镜的培养舱内，该装置可长期维持37摄氏度、5% CO2的培养环境，并以红色LED光源进行照明。在开始延时成像分析前，需使用BioStation软件设定每一液滴的坐标，以便在延时成像过程中自动逐个切换视野。延时图像以每8分钟采集一帧的频率连续采集，总时长为15小时。

随后使用 CellPave 软件分析所记录的视频，该软件可检测以速度矢量形式表示的细胞质运动。首先，利用 CellPave 工具手动划定每个卵母细胞的周长边界。然后，软件通过比较连续两个延时成像帧，计算细胞质运动的速度，并以彩色箭头表示，箭头颜色的强度和长度分别反映运动的速度和方向。

此处所见卵母细胞下方的直方图描述了SN卵母细胞在15小时记录期间整个胞质运动的速度。对NSN卵母细胞也进行了相同类型的分析。请注意，与SN卵母细胞相比，NSN卵母细胞显示出延迟的第一极体排出峰。

屏幕底部显示卵母细胞胞质流动速度的时间模式。该速度通过比较连续两帧图像计算得出。随后，将胞质流动速度的原始数据导出至Excel表格，其中行表示Frens序列，列表示所分析的单个卵母细胞。

左侧为SN卵母细胞的数据，右侧为NSN卵母细胞的数据。随后将SN或NSN卵母细胞的数据分为10个子组，其中9个用于训练，以绿色表示。

另取一份用于盲法检测，呈红色。此步骤共重复10次，每次更换盲法检测样本。

随后通过前馈人工神经网络（FANN）对数据进行分析。该FANN被构建用于分析整个延时成像帧，此处称为输入神经元。这些输入神经元连接至三个隐藏神经元，而隐藏神经元又连接至两个输出神经元。其中一个输出提供输入为具有发育潜能卵母细胞的概率。

而另一种情况则表明输入的是一个无发育潜能的卵母细胞。通过比较这两种输出结果，可预测卵母细胞发育潜能的准确率达到91.03%。该技术已建立用于小鼠卵母细胞，如此处所示。

然而，未来的应用是将其应用于人类卵母细胞的检测。事实上，在辅助生殖技术领域，特别需要通过非侵入性方法来评估卵母细胞质量。