通过鱼眼研究糖尿病: 成人 tg (fli: EGFP) 斑马鱼视网膜血管的显微解剖、可视化和分析
2017年12月26日
在这里, 我们讨论的方法协议, 将允许简单的分析成人 tg (fli: EGFP) 的斑马鱼视网膜血管作为一个快速出的设置长期血管病理与血管和结构的变化。
成年斑马鱼视网膜脉管系统的解剖方案的总体目标是通过荧光或激光扫描共聚焦显微镜在与新血管生成和结构变化相关的长期血管病变的环境中提供快速读数。这种方法可以帮助回答微血管并发症领域的关键问题，例如糖尿病视网膜病变的发展。该技术的主要优点是可以在生理和疾病过程中呈现和分析整个网状脉管系统，而无需以相对较快速和标准化的方式应用血管间荧光。
首先，将每个样品中新鲜制备的 6 毫升 4% PFA PBS 溶液转移到 6 孔板的孔中。根据文本协议对成年斑马鱼实施安乐死后，将它们放在干净的纸巾上并擦干。使用手术刀切开鳃盖后面的头部。
然后将头部直接转移到新鲜制备的固定剂的孔中。将含有鱼头的板在 4 摄氏度下存放至少 24 小时，以确保固定剂穿透更深的视网膜层。用加热的 2% 琼脂糖，将培养皿装满至三分之一，然后等待琼脂变硬。
用一个 X PBS 覆盖琼脂板，以创建一个工作区来解剖眼睛。将固定的样品转移到培养皿中。然后用一个镊子将头部固定在切割面上，插入另一个，将镊子固定在眼球下方的眼眶腔处。
慢慢打开眼睛下方的镊子，抓住视神经。然后小心地撕开并分离眼睛。要去除连接到眼睛的四块直肌和两块斜眼外肌中的任何一块，以及将眼睛连接到眼眶腔的残留眼外组织，请用半闭合的镊子挡住眼睛，并用另一把镊子夹住结构，使用直径运动轻轻地将其撕下。
接下来，使用 27 号一次性针头在外侧刺穿角膜。通过这个开口，用两个镊子夹住角膜并轻轻撕开它。然后小心地创建一个大约相应瞳孔大小的中心撕裂。
在虹膜上方的外角膜边缘处对眼球的角膜侧施加压力。这将产生一个小凹痕并将晶状体推到角膜撕裂的高度。然后将镊子放在镜头下并将其取下。
接下来，将眼睛倒置，视神经朝上。请注意，巩膜和角膜相连并形成眼球的纤维外衣，以保护杯状视网膜。这个壳，称为角膜巩膜，保留了视神经周围的区域。
在此停药处插入针头，以在巩膜和视网膜之间形成一个开口。然后用两个镊子小心地将巩膜轴向撕成条状，以增加视神经周围的开口。在过渡到角膜侧围时要小心保持角膜膜完整。
在从剩余的眼内组织中取出角膜之前，尝试严重任何连接，因为附着在其他结构上将是一个关键点。然后用一把镊子握住巩膜，用另一把镊子抓住视神经并拉开，从眼睛中完全去除角膜并丢弃。此步骤将提供一个杯状结构，由葡萄膜和包含视网膜脉管系统的视网膜组成。
接下来，将 27 号针侧向放在剩余的杯子上，同时用针尖的边缘刮擦外表面，从而在脉络膜和 RPE 层中造成破裂。使用破裂处作为接入点，抓住脉络膜和 RPE 层，并使用两把镊子将其撕成条纹，保持与虹膜的连接完好无损。之后，在虹膜下运行一把镊子，从外部在电路中移动它，同时通过拉动已停止的脉络膜和 RPE 层来产生张力并分离组合结构。
如果虹膜的某些部分在去除后无法去除并保持与杯状视网膜的连接，则脉络膜和 RPE 层利用成年斑马鱼眼睛在感光层内表现出的另一个自然断裂点。以类似的方式，刚刚演示了去除虹膜。刮擦剩余的杯状视网膜以诱导感光层中断。
然后使用 created 的访问权限删除该层，同时保持与虹膜的可能连接不变。然后，在虹膜下运行镊子，并继续按照本视频前面演示的电路进行作，以分离组合结构。以合理的方式断开虹膜与其底层组织的连接至关重要，因为在血管可视化过程中，它会阻挡内视圈正上方的荧光。
过于直接的方法会导致血管破损。然后使用带有两点 5 毫米直刀刃的显微解剖弹簧剪刀，尽可能靠近视网膜切割视神经。这将允许更好地平装组织。
要安装和观察视网膜脉管系统，请使用一个 X PBS 清洗解剖的视网膜两次，每次 5 分钟。将一滴 PBS 滴在载玻片上。然后使用带有微勺端的实验室刮刀，将视网膜转移到液滴中。
用镊子将组织固定在原位，同时用手术刀切割杯状结构，形成扁平的四瓣或五瓣形状，具体取决于视网膜大小。用一张细纸吸取剩余的 PBS，注意不要触摸视网膜。然后将平面安装的视网膜涂在安装介质中，并用盖玻片覆盖。
注意不要产生泡沫，因为气泡会扭曲视网膜血管的可视化。使用指甲油密封盖子。最后，进行荧光或激光扫描显微镜检查以可视化视网膜脉管系统。
这里显示的是用荧光显微镜观察的成年转基因苍蝇 EGFP 斑马鱼视网膜脉管系统的形态学示例，以及用减少背景荧光的共聚焦激光扫描显微镜成像的第二个示例。揭示的视网膜结构显示出高度组织化的模式。视动脉在视神经头处穿透视网膜，在大多数样本中扩散到 5 到 7 条主要血管中。
然后，主要血管分支成一连串的拱廊，并连接到内视圈或 IOC，也称为圆周静脉，围绕着平面视网膜外围的视盘。成年斑马鱼视网膜由以下层从内到外组成。神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、外核层、感光层和视网膜色素上皮。
此处显示了从视网膜脉管系统可视化对脉管系统参数的估计。视网膜内脉管系统位于神经节细胞层，而亲毛细血管将与视网膜色素上皮相关联。一旦训练好，如果执行得当，这项技术可以在 20 分钟内完成。
尝试此程序时，请务必记住定期练习，因为长时间不准备会降低容器完整性的结果。按照这个程序，可以分析成年斑马鱼的糖尿病和神经血管病变。
概述
本文介绍了一种解剖协议，用于分析成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统。该方法提供了对新生血管生成和结构变化相关的血管病理的快速评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 血管生物学
- 斑马鱼模型
背景
- 了解视网膜血管系统对于研究微血管并发症至关重要。
- 糖尿病视网膜病变是与血管变化相关的一个关键领域。
- 荧光和激光扫描显微镜对于可视化至关重要。
- 该协议旨在标准化解剖过程以获得更好的可重复性。
研究目的
- 提供一种快速有效的方法来分析视网膜血管系统。
- 促进长期血管病理的研究。
- 改善对视网膜疾病中新生血管生成的理解。
使用的方法
- 固定剂的准备和斑马鱼的安乐死。
- 解剖眼睛以分离视网膜结构。
- 使用镊子和针进行组织的小心操作。
- 使用荧光显微镜可视化解剖出的视网膜。
主要结果
- 该协议允许对视网膜血管系统进行全面分析。
- 标准化的方法增强了研究的可重复性。
- 促进了对各种疾病模型中血管变化的研究。
- 提供了对糖尿病视网膜病变机制的洞察。
结论
- 该解剖协议对于研究视网膜血管系统是有效的。
- 它有助于理解斑马鱼模型中的血管病理。
- 这种方法可以应用于血管生物学中的各种研究环境。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, standardized assessment of retinal vascular pathology in a genetically tractable model, supporting early-stage target validation for diabetic retinopathy and related vasculopathies. By providing quantitative visualization of neoangiogenesis and structural vascular changes, it enhances predictive confidence in preclinical de-risking strategies. The approach aligns with discovery-stage needs for mechanistic insight and translational biomarker alignment in neurovascular disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to retinal vascular integrity and neoangiogenic pathways.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized visualization of vasculopathy phenotypes in adult zebrafish.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking vascular readouts to disease-modifying target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated retinal tissue for high-content imaging assays that quantify vascular architecture changes.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized dissection and mounting procedures minimizing vessel breakage.
- Scalability: Enables rapid (<20 min) sample processing for screening campaigns in vascular biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides disease-relevant system for modeling long-term vascular pathologies linked to diabetic retinopathy.
- Mechanistic De-risking: Allows analysis of vascular layer-specific changes (inner vs. outer retina) to clarify pathophysiological mechanisms.
- Biomarker Alignment: Supports quantification of vascular parameters (e.g., vessel branching, inner optic circle integrity) as translational readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, particularly for neurovascular and metabolic disease programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation via direct visualization of EGFP-labeled retinal vasculature.
- Screening: Delivers quantitative, fluorescence-based outputs suitable for automated image analysis and compound effect assessment.
- Analytics: Enables measurement of vascular parameters (e.g., main vessel count, arcade formation, IOC integrity) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling human-relevant vascular pathologies in a genetic model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple vasculopathy indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in retinal vasculopathy models.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs through defined dissection and visualization steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular safety and efficacy signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and tissue dissection.
- Dependent on fluorescence or laser scanning confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of fixation, dissection, and mounting techniques across users.
- Adaptation considerations include alternative transgenic lines or disease models affecting retinal integrity.
- Practical limitations include tissue fragility and risk of vascular damage during dissection if not performed with precision.
