Name: 通过鱼眼研究糖尿病: 成人 tg (fli: EGFP) 斑马鱼视网膜血管的显微解剖、可视化和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管显微解剖技术，用于快速评估糖尿病视网膜病变等微血管并发症中的新生血管和结构变化。该方法通过荧光显微镜实现标准化可视化分析。

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作者感谢Katrin Bennewitz和Marlene Hausner在斑马鱼饲养和技术支持方面的帮助。作者感谢曼海姆生物医学与医学技术中心活细胞成像核心设施提供的支持（DFG INST 91027/9-1）。本研究得到了德国研究基金会（国际研究培训组1874/1 &#34;DIAMICOM&#34;，项目SP5和SP9；合作研究中心SFB1118，项目B1；以及合作研究中心SFB/TR23，项目Z5）的资助。

所有实验步骤，包括涉及动物受试者的操作，均已获得动物伦理委员会（卡尔斯鲁厄政府区）的批准，并遵循海德堡大学的动物护理指南。
1. 固定液（4% PFA/PBS）的配制
<ol>
	<li>每天新鲜配制固定液，以确保组织学组织结构的最佳保存。</li>
	<li>在室温下持续搅拌，将 0.2 g 氢氧化钠（NaOH）溶于 90 mL 双蒸水（ddH2O）中。</li>
	<li>加入 4 g 多聚甲醛（PFA），持续搅拌直至溶液完全澄清，至少持续 5–10 分钟，以确保大分子充分解聚。 
	注意：PFA 有毒，操作时需小心。</li>
	<li>将 0.84 g 磷酸二氢钠（NaH2PO4）溶于上述溶液中，并通过测量将 pH 控制在 7.2。</li>
	<li>用双蒸水（ddH2O）定容至 100 mL，并通过 3 号滤纸过滤溶液。</li>
	<li>将 4% PFA/PBS 溶液置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 安乐死溶液的制备
注意：以下步骤使用 ABTL 野生型斑马鱼品系进行，鱼龄通常为 6-8 个月。
<ol>
	<li>使用浓度为 0.31 mg/mL 的三卡因甲烷磺酸盐（即“三卡因”或 MS-222）进行斑马鱼安乐死16。以1倍胚胎水（用于饲养斑马鱼胚胎）作为安乐死溶液的溶剂。通常在处理镇静后的鱼类前，通过观察其失去平衡能力及触觉反应消失来判断麻醉深度是否合适。
	<ol>
		<li>配制 1,000 mL 10倍胚胎水时，将以下盐类按顺序加入 1,000 mL 双蒸水（ddH2O）中，并持续搅拌：10 g NaCl、0.3 g KCl、0.4 g CaCl2*6H2O、1.32 g MgSO4*6H2O。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 斑马鱼组织的固定
<ol>
	<li>提前将每份样品 6 mL 4% PFA/PBS 溶液加入六孔板的孔中。</li>
	<li>安乐死处理成年斑马鱼（此前维持在标准光照-黑暗循环条件下）， 例如，12小时光照：12小时黑暗）在早晨光照开启2小时后，将斑马鱼放入三卡因溶液中，等待其达到安乐死状态。在鳃盖运动停止后，此过程可能需要长达10分钟。</li>
	<li>将鱼从三卡因安乐死溶液中取出，放在干净的纸巾上。擦干鱼体，用解剖刀在鳃盖后方切断鱼头（参见 图2A将头部直接转移至已准备好的孔板中，孔板内含有新配制的固定液。</li>
	<li>将含有鱼头的孔板储存于 4 °C 过夜固定至少24小时，以确保固定剂渗透至视网膜深层。 
	注意：斑马鱼头部在 1x 磷酸盐缓冲液（PBS）中最多可保存 48 小时 4 °C 在制备前应避免荧光信号强度的显著下降。延迟时间增加可能导致组织完整性丧失和图像质量降低，因此应予以避免。</li>
</ol>
4. 斑马鱼视网膜血管的制备
<ol>
	<li>将加热的 2% 琼脂糖填充至培养皿的三分之一处，等待琼脂凝固。用 1× PBS 覆盖琼脂平板，以创建解剖眼球的工作空间。 
	注意：这可以同时保护解剖镊子并减少组织在解剖过程中的受力，从而降低结构损伤的可能性。所有后续制备步骤均应在该工作空间内进行，使用尖端精细的 #5 直头镊子，并在具有附加透射照明的解剖显微镜下操作。
	<ol>
		<li>解剖过程中，使用 4.0× 至 6.0× 的放大倍数，以便同时观察组织的整体情况和细节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将固定的样品转移至培养皿中，用一把镊子夹住头部的切面，另一把合拢的镊子插入眼眶窝下方的眼球处。缓慢张开眼球下方的镊子，夹住视神经，然后小心撕开并分离眼球（图 2B）。</li>
</ol>
<img alt="鱼类眼睛解剖结构：展示眼睛结构、眼眶腔和视网膜层的图片与示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：成年斑马鱼眼球的摘除。 眼球仍位于眼眶腔内且视神经完整的角膜侧面观 (A)。已分离眼球的角膜侧面观 (B)。此步骤斑马鱼眼球的示意图 (C)。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>移除仍附着在眼球上的四条直肌和两条斜肌，以及连接眼球与眼眶的残余眼外组织（参见图3和图4）。
	<ol>
		<li>操作时用一把半闭合的镊子向后固定眼球，用另一把镊子夹住目标结构，通过相对方向的轻柔动作将其撕下。由于直接夹持眼球会导致内部血管破裂，该技术足够轻柔，可有效保护血管系统。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="眼部解剖分析；显微图像（A，B）和带有肌肉、视神经标注的示意图（C）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：成年斑马鱼眼球，重点显示眼外肌。 侧视图，显示一条眼外肌附着于眼球左侧外缘，处于焦点位置 (A)。视神经侧面观，眼外肌对称分布于视神经两侧 (B)。此步骤中斑马鱼眼球的示意图 (C)。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>使用一次性 27G（0.4 × 19 mm）针头在外侧区域刺穿角膜（图 4C，红色箭头）。通过此开口用镊子夹住角膜并轻轻撕开。随后小心操作，制造一个大小约与相应瞳孔相当的居中撕裂口。</li>
</ol>
<img alt="眼睛解剖示意图，显示角膜、视网膜；显微图像突出视神经结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：去除所有眼外肌后的成年斑马鱼眼睛。 侧视图，可见透明的眼球外缘 (A)。视神经侧面观，视神经位于中央。反光的巩膜未完全覆盖神经周围的区域（红色虚线） (B)。此步骤斑马鱼眼睛的示意图 (C)。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>在眼球（bulbus oculi）角膜侧虹膜上方的角膜外缘施加压力。这将形成一个小凹陷，并将晶状体推至角膜裂口的高度。将镊子伸入晶状体下方并将其取出（图5A）。</li>
</ol>
<img alt="眼睛解剖及晶状体分离示意图；显示角膜结构的示意图和显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：成年斑马鱼眼睛正在进行晶状体移除过程。 晶状体从角膜撕裂处被推出时的角膜侧面观 (A)。晶状体位于眼球旁的角膜侧面观 (B)。此步骤中斑马鱼眼睛的示意图 (C)。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>将眼球翻转，使视神经朝向研究人员。注意巩膜和角膜相连，共同构成眼球的纤维膜，以保护杯状的视网膜。（图6）。
	<ol>
		<li>由角膜和巩膜组成的这一壳层也称为“角巩膜”，在视神经周围区域存在中断（图4B，红色虚线）。在此中断处插入一根针头一次，以在巩膜与视网膜之间制造一个开口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="眼部组织切片，组织学切片；示意图显示角膜和巩膜在研究中的方向。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：由巩膜和角膜组成的角巩膜，已从其余眼内组织分离。 角膜侧视图，显示透明的角膜延续至有色素的巩膜 (A)。聚焦于角巩膜中巩膜部分的侧面视图 (B)。所切除角巩膜的示意图 (C)。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="7">
	<li>使用镊子从两侧进入，小心地沿轴向将巩膜撕成条状，以扩大视神经周围的开口。注意在向角膜侧边缘过渡的区域保持角巩膜的完整性（见图6A）。</li>
	<li>用一把镊子夹住巩膜，另一把镊子夹住视神经并向外牵拉，将角巩膜整体从眼球上移除并丢弃（图6）。在分离角巩膜与剩余眼内组织前，应尽量切断所有连接，因为与其他结构的附着将成为关键难点；此步骤将获得一个由葡萄膜和视网膜构成的杯状结构，其中包含视网膜血管系统（图7）。</li>
	<li>将27G针头侧向贴附于剩余的杯状结构，用针尖边缘刮擦其外表面，从而在脉络膜/RPE层上制造一处破裂口。利用该破裂口作为操作入口，用两把镊子夹住脉络膜/RPE层并将其撕成条状，但需保持其与虹膜的连接。
	<ol>
		<li>随后，将一把镊子伸至虹膜下方，从外周环绕一周，同时通过牵拉已断裂的脉络膜/RPE层施加张力，使整个复合结构得以分离。 
		注意：必须将虹膜完全断开，以免在观察血管荧光时造成遮挡（图8B）。直接抓取虹膜进行移除可能导致广泛的血管损伤，尤其是在内视盘环（IOC）区域，因为虹膜仍与周围组织相连。脉络膜层与视网膜色素上皮（RPE）可被分离，且常保留与虹膜的连接，从而便于后续间接移除。</li>
		<li>若部分虹膜无法移除，可利用成年斑马鱼眼球光感受器层（PL）内部存在的天然断裂点，参照步骤4.9的方法移除虹膜。</li>
		<li>刮擦剩余杯状视网膜的外表面，使光感受器层（PL）在断裂点上方出现中断（图11C，黑色箭头）。利用所形成的入口移除该层的上部，同时保持其与虹膜可能存在的连接。随后，将镊子伸入虹膜下方，如前所述环绕一周，使复合结构完全脱离。 
		注意：此步骤4.9整体操作可能较为困难，需保持耐心。相比直接在瞳孔边缘抓取虹膜，或通过破坏脉络膜/RPE层或光感受器层的连接强行打开，本方法虽耗时但可获得更佳的血管完整性结果。尽管如此，该操作仍会导致外层视网膜结构的损伤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="视网膜结构；显微组织图像，横截面示意图；眼球解剖；用于教学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：去除角巩膜后的成年斑马鱼眼球。 侧面观显示眼内组织保留完整，虹膜和视神经均完好 (A)。角膜侧观，虹膜处于焦点位置 (B)。此步骤中斑马鱼眼球的示意图 (C)。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="10">
	<li>使用直刃切割边缘为2.5 mm的显微解剖弹簧剪，尽可能靠近视网膜处切断视神经；这将有助于组织更好地进行平铺固定。</li>
</ol>
<img alt="视网膜横截面显微图像及突出显示血管结构的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：去除视网膜色素上皮层/脉络膜及截断视神经后的成年斑马鱼眼球。 视神经侧面观显示带有截断视神经的视网膜 (A)。角膜侧观直接显示视网膜最内层 (B)。此步骤斑马鱼眼球的示意图 (C)。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 视网膜血管的封片
<ol>
	<li>用1x PBS将分离的视网膜清洗两次，每次5分钟。在切断视神经后转移视网膜时，使用带有微小勺头的实验室刮铲进行操作，避免直接接触暴露的组织。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴PBS，将视网膜转移至液滴中。用镊子固定组织，同时用手术刀将杯状结构切开，形成平坦的四瓣或五瓣形状，具体瓣数根据视网膜大小而定（见图9）。</li>
	<li>用细小的纸条吸除残留的PBS。注意不要触碰视网膜。</li>
	<li>在平铺的视网膜上加封片剂，并加盖盖玻片。注意避免产生泡沫，因为气泡会影响视网膜血管的观察。</li>
	<li>尽量减少盖玻片的移动，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。</li>
</ol>
6. 视网膜血管结构的可视化
<ol>
	<li>尽量缩短制备与观察之间的时间间隔，以减少因荧光信号衰减导致的图像细节丢失。若无法立即观察，可将制备好的视网膜血管铺片置于 4 °C 保存，以减缓信号衰减；但需注意，制备后 48 小时开始，图像质量的下降将逐渐显现。</li>
	<li>通过荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜血管铺片。 
	注意：荧光显微镜下血管观察采用 2.5 倍放大倍数，曝光时间为 2.0 s，增益为 6.0x，伽马值设为 1.67。共聚焦显微镜观察时使用 Ar 激光器（488 nm/20 mW），输出功率设为 20%，配备 TD 488/543/633 激光分光镜，采用 20x/0.7 NA 多介质浸没物镜（浸没介质为 ddH2O），发射滤光片设置为 505–560 nm。共聚焦图像根据视网膜大小，通过拼接扫描（tile scan）组合 4×4、4×5 或 5×5 幅单幅图像构成。</li>
</ol>
7. 斑马鱼视网膜的HE切片
注意：对于斑马鱼视网膜的HE切片，按照本方案所述步骤处理组织至第4.5步，之后直接跳转至第7.1步。
<ol>
	<li>将去核的眼球（步骤 4.5 之后）用 1x PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。随后将组织转移至 70% 乙醇（EtOH）中。此时，制备好的眼球可在 4 °C 下保存，直至进行石蜡包埋。</li>
	<li>在石蜡包埋前，按以下步骤洗涤组织以进行脱水：80% 乙醇中处理 2 次，每次 15 分钟；90% 乙醇中处理 2 次，每次 15 分钟；96% 乙醇中处理 3 次，每次 15 分钟；99% 乙醇中处理 3 次，每次 15 分钟；丙酮/99% 乙醇（1:2）中处理 2 次，每次 15 分钟；丙酮中处理 3 次，每次 15 分钟。将组织在 62 °C 的石蜡中浸泡过夜。</li>
	<li>将新鲜石蜡加热至 62 °C，并倒入包埋模具中。迅速将组织转移至模具内，并快速调整眼球的方向，以获得所需的切片方向。随后，在模具上放置包埋盒，并覆盖额外加热的石蜡。</li>
	<li>待石蜡块冷却后，取出包埋模具。使用切片机将石蜡块切成 10 µm 的切片，并将其漂浮于 45 °C 的水浴表面，持续足够长时间以使其完全展平。</li>
	<li>用载玻片捞取切片，并垂直放置以沥干多余水分，随后在 45 °C 烘箱中过夜干燥。</li>
	<li>按照以下程序进一步处理切片，以进行脱蜡和苏木精-伊红（HE）染色：二甲苯中处理 4 次，每次 1 分钟；99% 乙醇中处理 1 次，每次 1 分钟；96% 乙醇中处理 1 次，每次 1 分钟；80% 乙醇中处理 1 次，每次 1 分钟；70% 乙醇中处理 1 次，每次 1 分钟；ddH2O 中处理 1 次，每次 1 分钟；Mayer 苏木精染液中染色 4 分钟；ddH2O 中冲洗 10 分钟；0.5% 伊红染液中染色 2 分钟；ddH2O 中冲洗 30 秒；80% 乙醇中处理 30 秒；96% 乙醇中处理 2 次，每次 30 秒；99% 乙醇中处理 3 次，每次 1 分钟；最后在二甲苯中处理 1 分钟。</li>
	<li>从二甲苯中取出载玻片，迅速在组织上覆盖封片介质。注意避免组织完全干燥，然后盖上盖玻片并密封染色组织。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

缺氧诱导的视网膜新生血管生成模型显示，斑马鱼的分支点数量、血管出芽、总血管面积增加，毛细血管间距减小20。这些发现支持斑马鱼易发生糖尿病微血管并发症的观点21，因为糖尿病视网膜病变晚期的关键特征包括缺氧介导的新生血管生成，而这一过程与VEGF表达密切相关。高血糖诱导的斑马鱼视网膜变化导致血管厚度增加，但整体血管模式保持不变22。在葡萄糖溶液中交替浸泡30天还会导致内丛状层（IPL）和内核层（INL）厚度减小23。已有研究证实葡萄糖代谢产物在斑马鱼中作为血管病变的代谢驱动因子具有直接作用。斑马鱼胚胎经甲基乙二醛孵育后，其躯干血管系统也观察到额外的血管过度分支现象24。目前尚无一种动物模型能够完全再现糖尿病视网膜病变的所有关键标准。虽然常可观察到早期改变，但进展至增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）的过程仍缺乏25。斑马鱼也属于此类情况，迄今为止我们仅观察到缺氧介导的新生血管生成或高血糖诱导的结构变化。当前的研究结果支持斑马鱼对高血糖介导的血管改变具有易感性，作为一种动物模型，未来可能展现出向增殖性糖尿病视网膜病变发展的趋势。根据高血糖效应的强度和暴露时间，合适的实验模型可能在斑马鱼视网膜的特定区域引发缺血，从而促进新生血管生成——这正是增殖性糖尿病视网膜病变的关键特征。然而，由于斑马鱼在模拟长期微血管病理方面仍属相对较新的模型，未来建立的糖尿病斑马鱼模型将提供更多信息，并明确其相对于其他模型及其病理特征的重要性。例如，将表达DsRed标记红细胞的tg(gata1a:DsRed)斑马鱼与tg(fli:EGFP)品系杂交，可在未来模拟微动脉瘤的斑马鱼模型中同时可视化潜在的眼内出血，作为进展为PDR的预测指标。
由于视网膜血管系统逐渐形成一系列血管弓结构，血管间距离、分支点数量以及总血管面积的评估均与视神经中央动脉的距离相关。为避免所评估血管参数出现偏差，需要一个定位参考点。视神经中央（IOC）即为这样一个结构，具有高度相关性，因为血管活动区域与其在空间上直接相邻。为实现一致性的评估，应将视网膜扫描图像划分为多个矩形图像区域，且各区域与IOC保持一致的距离。整个视网膜均应被分析，图像区域应数值上对称分布。斑马鱼视网膜存在毛细血管密度高区与低区，若图像区域分布不均，可能导致额外的偏差。
<img alt="显示植物根细胞结构的共聚焦显微镜图像，展示细胞排列和分裂情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图12"> 
图12：视网膜血管可视化中血管参数的示例展示。 在内视网膜环（IOC）附近测量血管间距离（红色双箭头）(A)。IOC附近三个分支点（红色圆圈）(B)。 斑马鱼视网膜血管结构的可视化，其中放大区域（红色方框）显示一条出芽血管 (C)。从中央动脉（白色十字）沿一定距离测量血管直径（白色双箭头）(D)。血管密度是指重叠血管所占视网膜面积的百分比（红色斜线区域）(E)。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了测量血管间距离，需要将视神经盘（IOC）设定为某一固定距离作为标准（图12A，白色双箭头），并绘制一条与IOC平行的假想水平线（图12A，水平白色线）。该线上各血管之间的距离相加后取算术平均值，即为血管间距离。每当血管发生分支且从起始点延续出一个以上血管管腔时，均需在每张图像内计入分支点。这同样包括毛细血管之间的横向连接。在分析过程中必须保持一致性，明确哪些分支点应被计入，并在整个实验中始终遵循相同规则，以减少不必要的变异。如图12C所示，血管出芽是另一个可在每张图像中进行计数的参数，用于评估对视网膜血管系统的影响。新生血管芽不遵循中央动脉与IOC之间的弓状血管排列模式，而是主要集中于视网膜外周区域。为了测定特定血管的直径，必须始终选择一个定位参考点，并从该点起确定固定距离作为测量位置。视网膜内中央动脉的起始点即可作为主干血管的参考依据（图12D，白色十字）。血管所占面积（图12E，斜向红色线条区域）占整个视网膜面积的百分比即为血管密度，其数值与无血管区域呈间接负相关。
一个样本的完整共聚焦扫描应由多张高细节图像组成，以便观察微小毛细血管的过度出芽。为了优化此步骤所耗费的时间和资源，应采用自动拼接扫描程序，并对每张图像设置相同的扫描深度。视网膜封片不平整会显著增加使用共聚焦显微镜扫描血管结构所需的时间。理想情况下，应仅扫描血管层（图13B，白色框），但通常需要部分包含神经节细胞层。在截断视神经时保留过长的视神经残端，或制作平铺标本时切口过短，均可能导致封片不平整。
<img alt="视网膜组织的组织学荧光显微图像，显示细胞层，绿色通道中的荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图13"> 
图13：成年斑马鱼视网膜中苏木精-伊红染色与自发荧光的比较。 位于GCL上方聚焦的视网膜血管 (A)。 白色方框区域显示绿色EGFP信号，以及表现出强烈自发荧光的视网膜各层 (B)。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
由于斑马鱼视网膜血管的正确制备需要事先训练，因此由未经训练的操作者进行操作时样本量较小，且制备结果差异较大，这是该技术的主要局限性。尽管tg(fli:EGFP)斑马鱼眼球的制备能够快速反映血管系统的状态，但对于有经验的研究人员而言，每份视网膜的制备仍需耗时约20分钟。所有视网膜血管的制备步骤均需在解剖显微镜下完成，操作者必须全程保持专注，因为任何疏忽的操作步骤都可能导致血管破裂。操作者应定期练习，因为长时间不进行制备会降低其维持血管完整性的可能性。
此外，通过免疫组织化学（IHC）进行额外检测的应用仍受限，因为经过人和啮齿类组织验证的抗体中，仅有少数可用于斑马鱼。建议对IHC感兴趣的实验人员寻找针对斑马鱼的特异性抗体，尤其是在研究新靶点时。另一种方法是使用额外的斑马鱼报告基因品系，这些品系有助于研究眼部血管以外的细胞类型。然而，该策略耗时较长，因为需要数月时间才能培育出携带多个转基因报告基因的成年斑马鱼品系。
尽管如此，斑马鱼具有一系列独特的优势。它们体型相对较小，繁殖能力强，能够快速发育至成体阶段，其胚胎非常适合用于药物筛选。该研究领域发展迅速，相关文献日益增多。凭借快速构建基因敲除模型的能力以及大量可用的转基因荧光报告品系，选择斑马鱼作为研究对象的限制因素仅取决于具体的研究问题。

糖尿病是一种代谢性疾病，其特征是由于胰岛素分泌功能障碍或机体组织对分泌的胰岛素反应不足而导致高血糖。世界卫生组织估计，2014年全球有4.22亿成年人患有糖尿病1，预计到2035年，全球糖尿病患病率将上升至人口的8-10%2，这使得糖尿病成为未来几十年的关键研究领域之一。长期处于高血糖状态会导致微血管的慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病和多发性神经病变。这些并发症的管理和预防十分困难；事实上，糖尿病正成为终末期肾病（ESRD）最常见的病因，进而导致透析治疗2，同时也是中青年人群失明的首要原因3。
糖尿病眼病中微血管损伤的初始原因包括慢性高血糖、代谢紊乱以及某些危险因素（例如，高血压、血脂异常），这些因素导致血管内皮功能障碍、周细胞丢失和毛细血管退化，从而形成无细胞血管套。由此产生的视网膜缺血是新生血管形成和血管通透性增加的原因，进而促进增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）的发展4。在UKADS研究中，糖尿病视网膜病变在37%的糖尿病患者中被检出，而在接受筛查的英国白人欧洲队列中，威胁视力的糖尿病视网膜病变占12%5。目前的治疗方法仅能预防进一步的并发症，无法完全修复已造成的损伤。全视网膜光凝联合血糖控制是增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）的标准疗法，但也会对邻近的健康组织造成影响。抗VEGF干预作为激光治疗的替代方案显示出良好的疗效6,7，但最终仍需要特异性靶向治疗和新药来应对日益增多的视力丧失风险患者群体。
已建立的糖尿病视网膜病变动物研究模型并不能完全再现人类疾病的病理生理特征。针对特定科学研究问题选择合适的物种，是实验设计中最关键的部分之一。斑马鱼胚胎（Danio rerio）已在发育生物学研究中被广泛应用，并可通过吗啉代寡核苷酸（morpholinos）或CRISPR/Cas9技术高效地实现特定基因的敲低或敲除，具备理想的实验操作基础8。这些方法可便捷地应用于斑马鱼，以研究通过大规模全基因组关联分析（GWAS）所鉴定出的基因，从而揭示疾病进展和易感性的特定机制9。斑马鱼具有世代周期短、子代数量多、操作简便且成本低、检测方法日益完善等优势，使其模型的重要性不断提升，尤其在代谢性疾病建模方面展现出巨大潜力。斑马鱼中生物学机制的高度保守性，已为药理治疗策略的开发提供了依据。例如，降糖药二甲双胍和降胆固醇药物辛伐他汀已被证实可在cAMP/地塞米松诱导的PEPCK高表达模型以及高胆固醇饮食诱导的高胆固醇血症模型中“治疗”相应病理状态10,11,12。随着越来越多斑马鱼糖尿病模型的建立，人们对保守性代谢机制的理解不断深入，相关实验包括：葡萄糖溶液交替孵育、链脲佐菌素（Streptozotocin）诱导的β细胞消融、利用前药甲硝唑（metronidazole）介导的硝基还原酶系统实现β细胞消融、通过pdx1基因敲低或敲除构建单基因型糖尿病模型，以及骨骼肌胰岛素抵抗增强的模型12。这些已建立的实验方案、该物种上述特有的优势，以及在大量样本中高效操控基因组的能力，充分体现了斑马鱼在研究复杂疾病机制及筛选药理干预手段方面的突出优势。
为了将斑马鱼作为视网膜血管病变的模型，操作者必须对斑马鱼眼睛的基本解剖结构（图1）有基本了解。斑马鱼的眼睛具有六条眼外肌，包括四条直肌和两条斜肌，这些肌肉附着在眼球巩膜外侧13。角膜是覆盖晶状体的透明组织，并直接延续为构成眼球外壁的巩膜。巩膜不透明，表面部分具有反光性，并含有大量色素。斑马鱼的晶状体相较于人类更为球形。视网膜由三层神经元细胞核层组成，而提供氧气的视网膜血管系统与内层的节细胞层紧密相关，但并不形成视网膜下血管网络。相反，脉络膜血管位于巩膜与视网膜之间，与视网膜色素上皮层（RPE）相关联。这一毛细血管网络为视网膜外层提供氧气14。
<img alt="眼睛解剖图，角膜、视网膜、视神经、晶状体、巩膜；结构示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：成年斑马鱼眼睛的示意图。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
通过使用转基因 tg(fli:EGFP) 斑马鱼品系，可简便地实现视网膜血管系统的可视化15。该品系中，血管内皮细胞在 fli 启动子调控下表达绿色荧光蛋白，为后续使用激光扫描显微镜进行观察提供了基础。该方法通过解剖斑马鱼视网膜并进行组织整体封片来实现。该转基因模型无需进行血管内标记或整体免疫组织化学染色，即可快速获得血管表型结果。为分析斑马鱼中的糖尿病性视网膜病变，每位解剖操作者均应采用逐步标准化的制备流程。以下制备方案可为其他研究团队提供一种简便评估成年斑马鱼眼球暴露血管中血管变化的方法，并指导建立优化的斑马鱼视网膜解剖流程。

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Roth</td><td>6771.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2*&lt;/sub&gt;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4*&lt;/sub&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Roth</td><td>2370.1</td><td></td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222，三卡因）</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo-Fischer</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Greiner Bio one</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>六孔板</td><td>StarLab</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>BD 300900</td><td></td></tr><tr><td>微型镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Carl Roth</td><td>H872.1</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 22 mm × 22 mm</td><td>neoLab</td><td>103512222</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>FEA111</td><td></td></tr><tr><td>落射照明装置</td><td>Leica</td><td>10446389</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜 MZ10 F</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜 SP5 DS</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜 M80</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼品系：Tg(fli:EGFP)，ABTL 野生型</td><td>NA</td><td>NA</td><td>参见参考文献15</td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s 苏木精</td><td>Dr. K. Hollborn &amp;amp; S&amp;ouml;hne</td><td>0088663</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 伊红</td><td>Dr. K. Hollborn &amp;amp; S&amp;ouml;hne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>99.9% 乙醇</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Merck</td><td>1,071,501,000</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Roth</td><td>4436.2</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Emsure</td><td>606-001-00-8</td><td></td></tr><tr><td>切片机 RM 2165</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

通过鱼类之眼研究糖尿病：成年tg(fli:egfp)斑马鱼视网膜血管系统的显微解剖、可视化与分析

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

糖尿病视网膜病变是中青年人群失明的首要原因。随着全球糖尿病患病率不断上升，预防糖尿病微血管并发症将成为未来几十年的关键研究领域之一。目前亟需开发靶向特异性治疗手段和新型治疗药物，以应对日益增多的视力丧失风险患者。斑马鱼是一种成熟的发育研究动物模型，近年来在模拟代谢性多因素疾病过程中也日益受到重视。该物种具有诸多优势，可实现血管结构的清晰可视化，并适用于高通量药物筛选，同时具备高效敲除目标基因的能力。本文介绍一种实验方案，可用于对成年 tg(fli:EGFP) 斑马鱼视网膜血管系统进行简便分析，作为长期血管病变（与新生血管形成或血管损伤相关）的快速检测手段。该方法通过解剖斑马鱼视网膜并进行组织整体封片来实现。随后利用共聚焦显微镜观察成年视网膜血管中表达的绿色荧光蛋白（EGFP）报告信号，从而实现血管结构的可视化。正确处理组织可获得更佳成像效果，并减少血管内部断裂，确保真实反映原始血管结构。该方法适用于研究视网膜血管病变的斑马鱼模型，尤其适用于血管结构改变及新生血管形成的相关研究。

本文展示了成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统的两种典型形态学示例：一种使用荧光显微镜观察（图9A），另一种使用共聚焦激光扫描显微镜观察（图9B）。所呈现的视网膜结构显示出高度有序的模式。当使用荧光显微镜观察时，斑马鱼视网膜表现出强烈的自发荧光。因此，建议通过共聚焦扫描仅观察血管层，以降低背景荧光并提高对比度。在需要快速成像或仅需定性数据的情况下，荧光显微镜是一种具有吸引力的替代方案。
<img alt="花冠荧光显微成像；光学分析中的维管模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统的代表性图像。 图中展示了视网膜血管系统的两种典型形态：中央视网膜动脉延伸出5-7条主血管，随后逐级分支形成一系列弓形血管。所有更远端的血管均汇入位于每个花瓣状结构外缘的环周静脉（CV）。图(A)为2.5倍放大倍数下通过荧光显微镜成像的结果。图(B)为通过5×5单幅图像拼接扫描方式，利用共聚焦激光扫描显微镜对视网膜血管系统进行的成像。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
视动脉在视神经乳头处穿透视网膜，在大多数样本中，延伸出5-7条主血管（图10A）。这些主血管随后分出一系列血管弓，并与内侧视网膜环状静脉（IOC），即周缘静脉（CV）相连，环绕于平铺视网膜周边的视盘周围（见图10B）。IOC是位于眼球内侧边缘的静脉血管，负责引流动脉血。斑马鱼视网膜血管系统还存在血管活动活跃的区域，表现为毛细血管分支及血管新生出芽现象（图10C）。此类血管活动主要集中在IOC附近。需要注意的是，同一只眼睛的不同视网膜区域可能同时表现出高或低程度的血管活动性（比较图10B与图10C）。总体而言，与小鼠视网膜相比，斑马鱼视网膜血管系统在主支之间具有更多的无血管区域，且毛细血管数量较少17。每个样本的双眼均应进行分析，因为血管结构可能存在差异，单一观察可能导致偏差。
<img alt="显微镜图像：神经网络结构，荧光染色，生物分析，比例尺指示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图10"> 
图10：成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统的放大区域可视化。 视动脉分支形成主要血管(A)。在血管活性较低区域的视网膜毛细血管，连接至图像底部的内视网膜环（IOC）(B)。在血管活性较高区域的视网膜毛细血管，连接至IOC(C)。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
大约从受精后72小时（hpf）开始，斑马鱼中已存在一种高度保守的神经元层状结构18。成年斑马鱼视网膜从内到外依次呈现以下层次（图11）：神经节细胞层（GCL）、内丛状层（IPL）、内核层（INL）、外丛状层（OPL）、外核层（ONL）、光感受器层（PL）以及视网膜色素上皮层（RPE）。视网膜血管可视化后对血管参数的估算如图12所示。内层视网膜血管位于神经节细胞层（GCL）上方（图13B，白色框），而脉络膜毛细血管则与视网膜色素上皮层（RPE）相关联。
<img alt="视网膜各层的组织学横截面显微图像；结构标注对比；100 µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图11"> 
图11：成年斑马鱼眼睛的苏木精-伊红（HE）染色。 摘除晶状体后整个眼球的横截面概览 (A)。成年斑马鱼眼睛的视网膜各层19 (B)。色素层（PL）中自然断裂点的指示（黑色箭头）(C)。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种实验方法，可用于对成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统进行简便分析，作为长期血管病变（与新生血管形成及结构改变相关）研究中的快速检测手段。

通过鱼类之眼研究糖尿病：成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统的显微解剖、可视化与分析

糖尿病视网膜病变是中青年人群失明的首要原因。全球糖尿病患病率的不断上升将使该病的预防成为……

本成年斑马鱼视网膜血管灌注解剖方案的总体目标是，通过荧光或激光扫描共聚焦显微镜，快速评估与新生血管形成及结构改变相关的长期血管病变。该方法有助于回答微血管并发症领域中的关键问题，例如糖尿病性视网膜病变的发生发展机制。该技术的主要优势在于，无需使用血管内荧光示踪剂，即可在生理状态和疾病过程中，以相对快速且标准化的方式展示并分析完整的视网膜血管系统。首先，将每份样本六毫升新配制的4% PFA PBS溶液转移至六孔板的孔中。根据文本方案实施成年斑马鱼的安乐死后，将其放置在干净的纸巾上并擦干。使用手术刀在鳃盖后方切断头部。然后将头部直接转移至新配制的固定液孔板中。将盛有鱼头的孔板置于4摄氏度环境中保存至少24小时，以确保固定液充分渗透至视网膜深层组织。用加热的2%琼脂糖填充培养皿至其三分之一高度，待琼脂凝固后备用。用一滴 X PBS 覆盖琼脂平板，以创建解剖眼球的操作区域。将固定后的样本转移至培养皿中。用一把镊子夹住头部的切面处固定，另一把镊子插入眼眶下方，与眼球一同轻轻夹起。缓慢打开镊子，置于眼球下方，夹住视神经。然后小心撕裂并摘除眼球。为去除连接在眼球上的四条直肌和两条斜肌等眼外肌，以及残留的将眼球与眼眶腔相连的眼外组织，用半闭合的镊子向后固定眼球，另一把镊子夹住待分离结构，通过相对方向的轻柔撕扯动作将其分离。接下来，使用27号一次性针头在角膜的周边区域穿刺。通过此开口，用镊子夹住角膜并轻轻撕开。然后仔细操作，形成一个与相应瞳孔大小相近的居中撕口。在虹膜上方的角膜外缘处，对眼球的角膜侧施加压力。这将形成一个小凹陷，并使晶状体上升至角膜裂口处。然后将镊子伸入晶状体下方，将其取出。接下来，将眼球翻转，使视神经朝上。需要注意的是，巩膜和角膜相连，共同构成眼球壁的纤维层，以保护杯状的视网膜。这一外壳称为角巩膜，但在视神经周围区域则不包含在内。在该中断处插入针头，在巩膜与视网膜之间创建一个开口。然后利用此通路，用两把镊子小心地沿轴向将巩膜撕成条状，以扩大视神经周围的开口。注意在向角膜侧周缘过渡时，保持角巩膜交界处的完整。在将角巩膜从剩余的眼内组织上分离之前，应尽量切断其与其他结构的任何连接，因为残留的附着物将成为关键问题。随后，用一把镊子夹住巩膜，另一把镊子夹住视神经并向外牵拉，从而将角巩膜完全从眼球上移除并丢弃。此步骤将获得一个由葡萄膜和视网膜构成的杯状结构，其中包含视网膜血管系统。接下来，将27号针头侧向抵住残留的杯状结构，用针尖边缘刮擦其外表面，从而在脉络膜和视网膜色素上皮（RPE）层上制造一个破裂口。利用该破裂口作为切入点，用镊子夹住脉络膜和RPE层，并使用两把镊子将其撕成条状，同时保持其与虹膜的连接完整。随后，将一把镊子从虹膜下方伸入，从外部沿环形方向移动，同时通过牵拉已断开的脉络膜和RPE层产生张力，从而将整个结构分离下来。如果在去除脉络膜和视网膜色素上皮层后，部分虹膜仍无法移除并继续与杯状视网膜相连，则可利用成年斑马鱼眼球光感受器层内存在的另一个天然断裂点。采用类似前述去除虹膜的方法，轻轻刮擦残留的杯状视网膜，以在光感受器层内诱导产生断裂。 然后利用已建立的通路去除该层组织，同时保持与虹膜可能的连接完整。随后将镊子伸入虹膜下方，按照本视频前面演示的方式沿环形路径继续操作，以分离整体结构。在分离过程中，必须合理地将虹膜与其下方组织完全断开，因为在观察血管时，未分离的虹膜会遮挡内侧视光学环正上方的荧光信号。过于直接的操作可能导致血管破裂。然后使用直刃、刃口长2.5毫米的显微弹簧剪，在尽可能靠近视网膜处剪断视神经。这将有助于组织更平整地铺片。为了安装和观察视网膜血管系统，使用一倍磷酸盐缓冲液（1× PBS）清洗已解剖的视网膜，每次五分钟，共清洗两次。在载玻片上滴加一滴 PBS，然后使用带有微勺端的实验 spatula 将视网膜转移至液滴中。用镊子固定组织，同时使用解剖刀将杯状结构切开，根据视网膜大小形成一个平坦的四瓣或五瓣形状。用一小片滤纸小心吸去残留的 PBS，注意不要触碰视网膜。然后在平展的视网膜上滴加封片剂，并加盖盖玻片。注意避免产生泡沫，因为气泡会影响视网膜血管的观察。使用指甲油封固盖玻片。最后，通过荧光显微镜或激光扫描显微镜观察视网膜血管结构。图中显示了成年转基因斑马鱼（EGFP）视网膜血管系统的形态学示例，该图像通过荧光显微镜观察获得；另一示例则通过共聚焦激光扫描显微镜成像，后者可降低背景荧光。所呈现的视网膜结构显示出高度有序的模式。视动脉在视神经乳头处穿入视网膜，并在大多数样本中分支为五至七条主要血管。主要血管随后分支形成一系列弓状血管丛，并与位于视网膜平铺标本周边部视盘周围的内侧视网膜环状血管（inner optic circle, IOC）或称环周静脉相连接。成年斑马鱼视网膜从内向外依次由以下几层构成：神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、外核层、光感受器层以及视网膜色素上皮层。本文展示了如何从视网膜血管成像中估算血管参数。内层视网膜血管位于神经节细胞层上，而脉络膜毛细血管则与视网膜色素上皮层相关联。只要操作得当，该技术在经过训练后可在20分钟内完成。在尝试此操作时，重要的是要记住定期练习，因为长时间不进行操作会降低血管完整性的成功率。通过此操作，可在成年斑马鱼中分析糖尿病和神经血管病理学。

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