Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

本实验的总体目标是使用带有磷酸盐结合标签的 SDS-PAGE 检测 LRRK2 对 Rab10 的磷酸化。该方法可以帮助回答帕金森研究领域的关键问题，例如 LRRK2 中的疾病突变如何影响 Rab10 磷酸化。该技术的主要优点是可以使用简单的蛋白质印迹粗略估计 Rab10 磷酸化的化学计量。

该协议的许多步骤都是相当标准的，并且本视频附带的文本协议对此进行了足够详细的描述。在这里，我们想向您展示从视觉教学中受益最大的步骤。按照文本方案中的说明准备转染的 HEK293 细胞板。

将板放在冰上，吸出并丢弃培养基。接下来，小心地在每个板的角落加入 2 毫升 DPBS，并摇动板以铺开溶液。然后删除并丢弃 DPBS。

接下来，向每个板中加入 100 微升裂解缓冲液。倾斜板并使用刮刀铺开缓冲液并释放细胞裂解物。然后吸出裂解物，将其转移到冰上预冷的微量离心管中，等待 10 分钟。

接下来，通过离心试管并将上清液转移到冰上的新试管中来收集无碎片的细胞裂解物。然后使用 Bradford 测定法测量澄清的裂解物的蛋白质浓度。对于浓度数据，准备 100 微升裂解物样品用于凝胶分析。

制备更致密的裂解物以测量与过表达血凝素 Rab10 相比的内源性 Rab10。通过在 100 摄氏度下孵育 5 分钟来完成样品的制备。然后将样品储存在零下 20 摄氏度以下，直到需要为止，最长可保存 6 个月或更长时间。

首先，根据文本协议准备 SDS-PAGE 细胞。然后将凝胶装入槽中并用活页夹固定。接下来，用电泳缓冲液填充槽，并使用连接到注射器的针头去除孔中和凝胶下的气泡。

现在向样品中加入氯化锰并旋转以去除沉淀物。然后用等体积的样品、10 μg 蛋白质分析过表达的血凝素 Rab10 或 30 μg 蛋白质分析内源性 Rab10 上样凝胶。用含有氯化锰的样品缓冲液加载空泳道。

此外，用缓冲液和氯化锰补充分子量标准品，使其与样品的体积相同。现在开始在 50 伏特下运行凝胶。样品堆栈后，将电压增加到 120 以获得分离。

当染料前沿到达凝胶底部时，终止电压。接下来，按如下方式洗涤凝胶 3 次。将分离凝胶加载到添加了 EDTA 和 SDS 的干净转印缓冲液浴中。

然后在室温下在摇床上摇动 10 分钟。洗涤 3 次后，使用添加 SDS 但不含 EDTA 的转印缓冲液再进行一次洗涤。然后使用湿槽转移凝胶。

将水箱装入装满冰水的泡沫盒中，将水箱连接到电源并开始传输。长时间转移和高效冷却对于手术至关重要。转移后，通过用丽春红 S 对膜染色来检查转移，然后根据文本方案在 TBST 中洗涤。

接下来，应用一个块。将印迹浸入乳白色的 TBST 中，并在室温下在摇床上摇动印迹 1 小时。然后去除并丢弃封闭溶液，并涂抹一抗溶液。

现在在 4 摄氏度下摇动膜过夜。第二天，去除一抗溶液。然后像以前一样用新鲜的 TBST 洗涤膜 3 次。

洗涤后，将印迹浸入二抗溶液中，并在室温下将膜在摇杆上孵育约一小时。孵育后，再次用 TBST 洗涤膜 3 次。现在显影膜。

将 1 毫升 ECL 溶液加入一大张保鲜膜中。然后将膜放入 ECL 中，并迅速翻转以润湿两侧。接下来，提起膜并让它排出。

沥干后，让一侧触碰纸巾约 5 秒钟，以帮助吸走多余的溶液。然后将膜包裹在无皱纹的坚硬透明薄膜中，并将其转移到黑色托盘中进行成像。用血凝素 Rab10 野生型和 3xFLAG-LRRK2 转染 HEK293 细胞。

检测了在家族性帕金森病 LRRK2 突变中失活的野生型激酶。LRRK2 和 Rab10 的共过表达导致 P 标签凝胶中的主要条带偏移。相比之下，与激酶失活突变体共表达导致 Rab10 迁移率没有变化，这表明激酶是带转移的原因。

同样，正如预期的那样，家族性 PD 突变都增加了带移。P 标签凝胶系统还用于分析用 LRRK2 抑制剂处理的小鼠 3T3-Swiss 白化胚胎成纤维细胞。当用 GSK2578215A 处理细胞时，对应于磷酸化内源性 Rab10 的带移消失。

还使用人 A549 细胞进行了相同的测试。在这些实验中，使用抗 p 丝氨酸 935 LRRK2 抗体验证了 LRRK2 抑制剂的疗效，LRRK2 抑制剂是 LRRK2 抑制的公认标志物。一旦掌握，与常规的蛋白质印迹程序相比，该技术只需要额外的 14 分钟，后者用于在转印前洗涤凝胶。

按照此程序，可以执行其他方法（如质谱法）来回答其他问题，例如 FPD 突变体是否磷酸化 Rab10 的相同残基。开发后，该技术为帕金森研究领域的研究人员探索培养细胞和组织中 Rab10 磷酸化的内源水平铺平了道路。不要忘记，在裂解缓冲液中添加微囊藻毒素可能非常危险，因此在制备细胞裂解物时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护设备。