一种实时3D 单粒子跟踪协议
January 3rd, 2018
本协议详细介绍了一种 real-time 3D 单粒子跟踪显微镜的构造和操作, 能够跟踪高扩散速度和低光子计数率的纳米荧光探针。
该协议的总体目标是实现实时、3D、单颗粒跟踪显微镜。这种技术的主要优点是可以用光子有限的时间分辨率连续监测单个漫射纳米级物体。这项技术可以帮助回答病毒学领域的关键问题，例如在整个感染过程中跟踪单个病毒粒子。
在光学平台上准备设备。此设置已准备好进行校准。关键组件包括一个 488 纳米固态激光器、两个沿光束路径的电光偏转器、一个可调谐的声梯度透镜以及一个带有微米和纳米定位器的样品台。
此设置示意图提供了更多详细信息。这是到样品台的激光束路径。电光偏转器和可调谐声学透镜沿着光束的路径。
这些设备在样品台动态驱动激光光斑。来自样品的光子由雪崩光电二极管计数。摄像头监控粒子的位置。
样品的位置使用微控制器和纳米控制器设置。场可编程门阵列控制激光光斑、实时粒子位置计算、载物台反馈和光子计数。必须准备两个样品。
第一个需要用磷酸盐缓冲盐水稀释的 190 纳米荧光珠。使用盖玻片制备固定颗粒样品。将 400 μL 微珠溶液放在盖玻片上。
现在，生成自由移动的粒子样品。它需要 110 纳米的荧光珠，并在水中稀释。将 400 μL 溶液放在盖玻片上，制备自由移动的颗粒样品。
将固定颗粒样品带到显微镜上进行安装。样品位于 XY 纳米定位器上。打开激光器、光电探测器、光束线元件和定位器的控制器。
在闭环中运行 Piezo nano 定位器。接下来，从光电检测器前面取下荧光发射滤光片。然后，使用微型定位器改变样品的 z 位置。
当位置变化时，使用光电探测器监测激光反射的强度。最大化强度以确定物镜的焦平面。将样品置于焦平面中，更换荧光发射滤光片。
现在，使用计算机控制软件。使用自定义软件对样品进行光栅扫描。首先，设置一个较大的扫描范围，即 start 和 finish 之间的差异。
此处，Y 轴范围为 10 微米，X 轴范围为 10 微米，此外，在每个方向上设置较大的步长。这里是 200 纳米。将两个 Z 场都设置为先前标识的焦平面位置。
按下扫描按钮将启动 Raster 扫描。开始扫描。该软件在夜间游览中驱动光电偏转器，从光电探测器收集计数，驱动纳米定位器，并执行位置计算。
扫描将找到一个可以通过 plata 荧光在软件中识别的颗粒。对于扫描中的每个位置，软件还将确定相对于电物体偏转器扫描中心的 X 和 Y 轴上颗粒位置的估计值。找到粒子后，将其周围的扫描范围在 X 和 Y 方向上缩小到 2 微米，同时，将两者的步长减小到 100 纳米。
在 Z 方向上添加两个千分尺的扫描范围，以包围荧光焦点。将 Z 步长设置为 200 纳米。开始 3D 光栅扫描以找到荧光焦点。
扫描产生的数据显示了可调声梯度镜头通电之前的焦平面。继续在其控制软件中使用可调声学透镜设置。首先，单击 connect（连接），然后打开 power。
进入脉冲和选通控制部分，将输出触发模式从 RGB 改为多平面。然后，将其改回 RGB 以允许更改输出相位。使用滑块将输出相位设置在 0 度、90 度和 270 度之间。
接下来，转到频率控制部分。在那里，选择 68， 500 赫兹的谐振频率。移动到屏幕顶部，然后单击 高级。
然后，选择 settings （设置） 选项卡。在新屏幕上，找到零列的最大频率。调整它以更改频率搜索范围。
单击，保存校准，然后退出校准。返回频率控制并更改谐振频率。立即将其改回 68， 500 赫兹以使校准生效。
在 amplitude control 部分，使用滑块将 amplitude 缓慢提高到 35% 之后，单击 lock resonance。当频率被锁定时，点击 unlock resonance。返回光栅扫描软件。
输入以 X 和 Y 中的粒子为中心的两个千分尺扫描范围，使用 100 纳米的步长。将颗粒置于 Z 轴的 4 微米范围内，步长为 200 纳米。在生成的扫描图像中，代表粒子的照明区域大约有 1 微米宽。
基于此，调整 XY 比例参数，使 X 和 Y 中的估计位置范围为负 0.5 到 0.5 微米。使用 Z 刻度执行类似程序后，将 nano 定位器设置到零位置。在继续之前，请关闭 nano 定位器的电源。
用自由移动的颗粒样品替换固定的颗粒样品。然后，确保所有设备都已打开。在开环中运行 Piezo nano 定位器。
在计算机上，像以前一样设置可调声学梯度透镜软件。从光电检测器的路径上取下荧光发射滤光片。通过改变样品 Z 位置并最大化激光反射强度，从盖玻片中找到焦平面。
找到焦平面后，将焦距位置增加到溶液中 15 微米。更换荧光发射滤光片。打开自定义跟踪软件。
将位置估计参数设置为优化期间找到的值。现在，设置积分控制常数，它决定了纳米定位器的响应速度。从 X 常数开始。
输入一个较低的值并慢慢增加它。当粒子位置读数开始振荡时，请注意控制常数的值。在振荡开始时，将积分控制常数降低到其值的 70% 左右。
使用 Y 和 Z 控制常数重复这些步骤。设置触发器以开始将跟踪阈值设置为 3 kHz。将 track minimum（结束跟踪的触发器）设置为 1.5 kHz。
通过单击 search ，然后单击 auto track 来启动实验。这部电影展示了使用三维动态光子定位跟踪显微镜跟踪 110 纳米荧光纳米颗粒在水中扩散运动的结果。使用 nano 定位器的位置读数测量的颗粒位置显示在 3D 轴上。
插图是科学海苔相机的读数。它表明跟踪系统将粒子保持并锁定在焦点体积中。对粒子进行了跟踪，并记录了它的位置超过两分钟。
一旦掌握，如果系统正确对齐并设置校准参数，则可以在 50 分钟内完成这项技术。该技术开发后，将帮助药物递送领域的研究人员探索细胞货物的内化和运输途径。看完这个视频，你应该对如何作零时间的 3D 单粒子跟踪显微镜有了很好的了解。
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概述
本协议详述了一个实时、3D、单粒子跟踪显微镜的实现，旨在监测纳米尺度荧光探针。该技术允许在光子有限的条件下，连续观察单个扩散物体。
关键研究组成部分
科学领域
- 显微镜
- 单粒子跟踪
- 病毒学
背景
- 实时跟踪纳米尺度粒子在各种科学领域中至关重要。
- 理解单个病毒的动力学可以为感染过程提供洞见。
- 该技术增强了在高扩散速度下研究粒子的能力。
- 通过先进的光学设置解决了光子计数限制。
研究目的
- 开发一台能够实时跟踪单个粒子的显微镜。
- 通过监测个体病毒来促进病毒感染的研究。
- 提高纳米尺度物体跟踪的时间分辨率。
使用的方法
- 构建3D单粒子跟踪显微镜。
- 使用488纳米固态激光器。
- 包含电光偏转器和可调声学梯度透镜。
- 在具有精确定位的光学桌上校准设备。
主要结果
- 显微镜成功地跟踪纳米尺度荧光探针。
- 展示了在低光子计数率下监测粒子的能力。
- 实现了在感染过程中对单个病毒的连续观察。
- 提供了对病毒过程动力学的洞见。
结论
- 本协议建立了一种用于实时粒子跟踪的稳健方法。
- 它为病毒学和相关领域的研究开辟了新的途径。
- 该技术可以显著增强我们对病毒行为的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
