一种用于实时三维单粒子追踪的实验方案

本实验方案的总体目标是构建一台实时三维单粒子追踪显微镜。该技术的主要优势在于，能够以光子限制的时间分辨率对单个扩散的纳米级物体进行持续监测。该技术有助于解答病毒学领域的关键科学问题，例如全程追踪单个病毒颗粒在感染过程中的动态行为。

在光学平台上准备装置。该装置已准备好进行校准。主要组件包括一个488纳米的固态激光器、沿光路方向设置的两个电光偏转器、一个可调声学梯度透镜，以及带有微米和纳米定位器的样品台。

该装置的示意图提供了更多细节。此处为激光束通往样品台的光路。电光偏转器和可调声学透镜位于光束路径上。

这些设备在样品阶段动态驱动激光光斑。样品发出的光子由雪崩光电二极管计数。相机用于监测粒子的位置。

使用微米和纳米控制器来设定样品的位置。现场可编程门阵列控制激光光斑、实时颗粒位置计算、载物台反馈以及光子计数。需要准备两个样品。

第一步，需要将190纳米的荧光微球稀释于磷酸盐缓冲液中。使用盖玻片制备固定的微球样品。将400微升的微球溶液滴加到盖玻片上。

现在制备自由运动颗粒样品。需要将110纳米的荧光微球稀释于水中。取400微升该溶液置于盖玻片上，以制备自由运动颗粒样品。

将固定的颗粒样品送至显微镜进行安装。样品位于XY纳米定位器上。打开激光器、光电探测器、光路元件控制器以及定位器的控制器。

以闭环模式运行压电纳米定位器。接着，从光电探测器前方移除荧光发射滤光片。然后，使用微定位器调节样品的 z 轴位置。

随着位置的变化，使用光电探测器监测激光反射的强度。通过最大化强度来确定物镜的焦平面。当样品位于物镜焦平面时，更换荧光发射滤光片。

现在，使用计算机控制软件。利用自定义软件对样品进行光栅扫描。首先，设置较大的扫描范围，即起始点与终止点之间的差值。

此处，Y 方向范围为 10 微米，X 方向范围为 10 微米。同时，在每个方向上设置较大的步长，此处为 200 纳米。将两个 Z 方向的参数均设置为先前确定的焦平面位置。

启动扫描将开始光栅扫描。开始扫描后，软件会驱动电光偏转器进行逐行扫描，从光电探测器收集计数信号，驱动纳米定位器，并执行位置计算。

扫描将通过平板荧光在软件中识别出颗粒。对于扫描中的每个位点，软件还将确定颗粒相对于电控微粒偏转器扫描中心在 X 和 Y 方向上的位置估计值。找到颗粒后，将扫描范围在 X 和 Y 方向上缩小至两微米，并将步长均减小至 100 纳米。

在 Z 方向上添加两微米的扫描范围以包围荧光焦点。将 Z 轴步长设置为 200 纳米。启动三维光栅扫描以找到荧光焦点。

扫描产生的数据显示了可调谐声学梯度透镜通电前的焦平面。接下来，在其控制软件中操作可调谐声学透镜的设置。首先，单击连接，然后开启电源。

进入脉冲和门控控制部分，将输出触发模式从 RGB 改为多平面。然后，再将其切换回 RGB 模式以允许更改输出相位。使用滑块将输出相位设置为 0 度、90 度和 270 度之间。

接下来，进入频率控制部分。在此处选择 68,500 赫兹的共振频率。然后移动到屏幕顶部并点击“高级”。

然后，选择设置选项卡。在新界面中，找到零列的最大频率。调整该值以改变频率搜索范围。

单击“保存校准”，然后退出校准。返回频率控制界面并更改共振频率，随后立即将其调回 68,500 赫兹，以使校准生效。

在振幅控制部分，使用滑块将振幅缓慢升高至35%。随后，点击“锁定共振”。当频率锁定后，点击“解锁共振”，然后返回光栅扫描软件。

在X和Y方向上，以颗粒为中心设置两个微米级扫描范围，步长为100纳米。在Z方向上，以颗粒为中心设置四微米的扫描范围，步长为200纳米。扫描成像结果中，代表颗粒的照明区域宽度约为一微米。

根据此结果，调整 XY 尺度参数，使 X 和 Y 方向的估计位置范围为负 0.5 至 0.5 微米。采用类似方法调整 Z 尺度后，将纳米定位器归零。继续操作前，请关闭纳米定位器的电源。

将固定粒子样品替换为自由移动粒子样品。然后，确保所有设备均已开启。以开环模式运行压电纳米定位器。

在计算机上，按照之前的方法设置可调声学梯度透镜软件。将荧光发射滤光片从通往光电探测器的光路中移除。通过调节样品的Z轴位置并最大化盖玻片激光反射的强度，找到焦平面。

找到焦平面后，将焦面位置向溶液内增加15微米。更换荧光发射滤光片。打开自定义追踪软件。

将位置估计参数设置为优化过程中确定的数值。现在，设置积分控制常数，该常数决定纳米定位器的响应速度。首先设置 X 方向的常数。

输入一个较小的值并缓慢增加。当颗粒位置读数开始出现振荡时，记录此时的控制常数数值。将积分控制常数减小至振荡开始时数值的约70%。

使用 Y 和 Z 控制常数重复上述步骤。将触发器设置为开始跟踪的跟踪阈值为 3 千赫兹。将跟踪最小值（即结束跟踪的触发器）设置为 1.5 千赫兹。

通过点击搜索，然后点击自动追踪，开始实验。本视频展示了使用三维动态光子定位追踪显微镜追踪水中110纳米荧光纳米颗粒扩散运动的结果。颗粒的位置通过纳米定位器的位置读出，并显示在三维坐标轴上。

插图显示了科学海藻相机的读数输出。它表明，该粒子被追踪系统固定并锁定在焦平面上的观测区域内。该粒子被持续追踪，其位置记录时长超过两分钟。

一旦掌握，若系统已正确校准并设置好校正参数，该技术可在不到 50 分钟内完成。该技术的建立将有助于药物递送领域的研究人员探索细胞摄取及细胞内物质转运的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何操作零时间点三维单粒子追踪显微镜。