生物膜形成的可视化 白色念珠菌 使用自动化微流控装置

本实验方案的总体目标是在宿主生理条件下实时观察白色念珠菌生物膜的形成过程。该方法能够实时监测生物膜的动态发育过程，可用于评估抗菌剂的效果或分析基因突变体的表型。该技术可用于高通量筛选针对生物膜的潜在治疗药物，并可对药物效果进行测量、可视化分析，并与现有治疗方法进行比较。

该技术的主要优势在于可用于检测在研究人员关注的多种不同条件下生物膜的形成情况。尽管该方法最初是为研究白色念珠菌（Candida albicans）生物膜形成而开发的，但也可应用于其他能够形成生物膜的微生物，包括其他真菌种类以及细菌。首先，根据标准的微生物学操作规范，从接种于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基琼脂平板上的细胞中制备不同白色念珠菌（C.albicans）菌株的单菌落培养物。

接下来，启动包括控制器、两个电源单元、显微镜、相机以及连接至系统的计算机在内的微流控系统。计算机启动完成后，打开控制该系统的软件。找到正在使用的培养板上的条形码编号，并在软件提示时输入该编号。

然后在控制模块中，将微流控系统的温度设置为 37 摄氏度。接着，点击入口孔 I1、I7、I13 和 I19，使无菌空气通过接口板管道持续五分钟，以去除任何冷凝液。当所有冷凝液完全蒸发后，将 48 孔 0–20 达因微流控板放置在显微镜载物台上。

进行12小时生物膜形成实验时，首先向入口孔中加入600微升预热的培养基。将清洗干净的接口板缓慢放置在48孔微流控板上方，然后将接口板轻轻向左滑动，直至管道位于入口孔和出口孔的正上方并锁定到位。

在软件的剪切力控制部分，将流动模式设置为恒定，并将最大剪切力设为1达因每平方厘米。然后点击含有培养基的入口孔，以启动培养基从入口孔到出口孔的流动，从而对通道进行预灌注。流动5分钟后，点击软件微孔板控制部分的停止按钮。

然后移除接口板，观察微流控板的孔。仅在出口孔中可见少量培养基液滴。为检测野生型和突变型白色念珠菌菌株，将50 µL以蜘蛛培养基培养的野生型SC5314细胞培养物加入两个出口孔，将bcr1突变株加入另外两个出口孔，再将EFG1突变株加入剩余两个出口孔。

将接口板重新放回微流控板上，并锁定盖子。返回软件的剪切力控制部分，将流速模式设置为恒定，并将最大剪切力设为2 dyne/cm²。点击含有细胞的出口孔，以启动培养基从出口孔向入口孔流动，开始接种白色念珠菌。

三秒后，点击孔板控制区域中的停止按钮，以防止细胞进入进样孔。让细胞在观察通道中静置 10–20 分钟，无液体流动，以实现细胞的初始贴附。在成像模块窗口中，打开多维采集模块，并点击左侧菜单中的载物台标签。

在阶段设置部分，加载用于48孔0-20达因微流控板的主阶段列表。接着，打开样品重装调整界面，并将阶段移动至绝对位置模块。在样品重装调整模块中，按下实时按钮，即可看到带十字准线的图像预览。

使用操纵杆移动孔板，使观察通道四旁边的箭头尖端与软件中的十字准线对齐。然后进入“移动载物台至绝对位置”菜单，按下“设置原点”按钮。接下来，返回样品重新加载调整模块，点击左侧菜单中的“初始参考点”部分，并加载适用于48孔0-20达因微流控板的文件。

在多维采集模块的载物台区域，双击载物台位置 22.2，通过观察通道 22，使显微镜观察载物台和相机焦点接近箭头标记。然后使用操纵杆调整孔板位置，使紧邻观察通道 22 的箭头尖端与十字准线对齐。将多维采集模块中的 Y 坐标复制到 Y 位置中。

在样本重新加载调整模块的“更新参考点”选项卡中选择2。最后，在样本重新加载调整模块的“更新载物台位置”选项卡中，单击“应用于MDA载物台列表”。在成像模块窗口中，使用多维采集模块，并在左侧菜单中单击“保存”选项卡。

然后选择实验的文件名以及用于在计算机上存储所采集图像的文件夹。接下来，点击时间序列（timelapse）标签，设置共采集145张图像，每张图像间隔5分钟。随后在波长标签中，将波长数量设置为1，以50%明场光和50%相机光进行采集，曝光时间为12–20毫秒。

将增益设为0.6，数字化仪设为20毫赫兹。按照随附文本方案中的描述设置好焦距后，选择“采集”以开始捕获所有阶段中黏附细胞的灌注前图像。在剪切力控制部分，将流动模式设为恒定，最大剪切力设为1达因每平方厘米。

然后点击入口孔，以启动培养基从入口孔到出口孔的流动，从而去除任何未贴壁的细胞。五分钟后，点击孔板控制部分的停止按钮。等待第二轮图像采集完成，然后在剪切力控制部分，将最大剪切流速调整为 0.5 dyne/cm²，并确认更改。

在成像模块窗口中，选择分析工具选项卡，然后从下拉菜单中点击“查看多维数据”。接着点击选择基础文件，这将打开多维数据集工具窗口。

接下来，单击选择目录按钮，并选择用于保存实验的文件夹。在数据集列表中，选择实验文件日志。日志加载完成后，单击查看按钮。

通过单击左侧波长菜单中的选项来选择波长，并从下拉菜单中选择要查看的载物台位置。通过右键单击模块顶部的图像编号来选择要加载的图像。然后按顺序选择所有图像，以生成延时视频。

所选图像将在新窗口中以视频形式打开。单击成像模块窗口中的文件选项卡，然后从下拉菜单中选择“另存为”。将生成的视频以默认文件格式保存。

最后，将保存的视频文件打开并载入 ImageJ。在 ImageJ 中，单击“文件”选项卡，然后单击“另存为”。从下拉菜单中选择 AVI 格式，并使用 JPEG 编码将其转换为每秒 10 帧的 AVI 文件。在 RPMI 1640 培养基的野生型条件下，多个细胞牢固地黏附于通道上。

它们形成菌丝，可观察到由交织的菌丝和酵母细胞构成的较厚生物膜。在微流控实验接近结束时，野生型生物膜完全填满观察通道。然而，两性霉素B的存在显著抑制了生物膜的形成。

具体而言，细胞的黏附能力减弱，多个细胞可见随培养基的剪切流被冲走。野生型对照细胞此次在蜘蛛培养基中培养，形成的生物膜与之前在RPMI培养基中生长的生物膜相似。在同一培养基中还培养了两种生物膜缺陷型突变株。

与对照组相比，这两种菌株的生物膜形成能力均显著降低。在此细胞群体中，黏附的细胞无法形成菌丝，导致所形成的生物膜存在严重缺陷。该菌株在生物膜形成能力以及黏附至通道表面的能力方面均存在缺陷。

一旦掌握，该实验可在不到一小时内完成设置。通过此方法，可深入了解生物膜形成的多个不同方面，包括初始细胞黏附、生物膜成熟以及细胞扩散。该方案具有高度可定制性和广泛适用性。

该方法可调整用于评估不同界中的多种微生物物种。通过调节流速、温度、培养时间及培养基，也可用于研究多物种混合生物膜。我们强烈推荐将此微流控生物膜检测法作为体内动物实验前的体外检测手段。

根据我们的经验，该检测的结果与现有的体内生物膜检测结果具有很好的相关性。