全自动微流控装置在白色念珠菌生物膜形成中的可视化
2017年12月14日
本协议描述了在宿主生理条件下, 使用可定制的自动微流控装置来可视化白色念珠菌中的生物膜形成。
该协议的总体目标是在宿主生理条件下实时可视化白色念珠菌的生物膜形成。这种方法可以实时观察生物膜的形成，并可用于测试抗菌剂的有效性或评估遗传突变体。该技术可用于以高通量方式筛选潜在的针对生物膜的活性疗法，并且可以测量、可视化和比较它们的有效性。
该技术的主要优点是它可用于在研究人员感兴趣的几种不同条件下测定生物膜的形成。虽然这种方法是专门为研究白色念珠菌生物膜的形成而开发的，但它也可以应用于其他形成生物膜的微生物，包括其他真菌物种和细菌。首先，按照标准微生物学实践，从接种在酵母提取物蛋白胨葡萄糖或 YPD 培养基琼脂上的细胞中制备不同白色念珠菌菌株的单菌落培养物。
接下来，打开微流体系统，该系统包括控制器、两个电源单元、显微镜、相机和连接到系统的计算机。计算机加载后，打开控制系统的软件。找到正在使用的板的条形码编号，并在软件提示时输入编号。
然后在控制模块中，将微流体系统温度设置为 37 摄氏度。接下来，点击入口孔 I1、I7、I13 和 I19，将无菌空气流过接口板管 5 分钟，以去除任何冷凝水。当所有冷凝物蒸发后，将 48 孔 0-20 达因微流控板放在显微镜载物台上。
对于 12 小时的生物膜形成实验，首先向入口孔中加入 600 μL 预热培养基。慢慢降低 48 孔微流控板顶部的清洁界面板。然后将接口板稍微向左滑动，直到试管位于入口和出口孔的顶部并锁定到位。
在软件的剪切控制 部分中，将流动模式设置为恒定，并将最大剪切力设置为每平方厘米 1 达因。然后单击带有介质的入口孔，开始介质从入口流向出口孔，以便灌注通道。流式 5 分钟后，单击软件孔板控制部分中的停止按钮。
然后取下接口板并观察微流体板孔。出口孔中应该只可以看到一小滴介质。为了测试野生型和突变型白色念珠菌菌株，将蜘蛛培养基中的 50 微升野生型 SC5314 细胞培养物添加到两个出口孔中，将蜘蛛培养基中的 bcr1 突变体添加到两个出口孔中，将蜘蛛培养基中的 EFG1 突变体添加到两个出口孔中。
将接口板放回微流体板上，并将盖子锁定到位。返回软件的剪切控制部分，将流动模式设置为恒定，并将最大剪切力设置为每平方厘米 2 达因。单击带有细胞的出口孔，开始将培养基从出口流向入口孔，开始接种白色念珠菌。
三秒后，单击孔板控制部分中的停止按钮，以防止细胞进入进样孔。让细胞在观察通道中保持静止 10-20 分钟，以实现初始细胞贴壁。在成像模块窗口中，打开多维采集模块，然后单击左侧菜单中的 stage 选项卡。
在阶段部分中，加载 48 孔 0-20 达因微流体板的主阶段列表。接下来，打开样品重新加载调整并将载物台移至绝对位置模块。在样本重新加载调整模块中，按下实时按钮可查看带有十字准线的图像预览。
使用纵杆定位孔板，使与查看通道 4 相邻的箭头尖端与软件上的十字准线对齐。然后转到 move stage to absolute position 菜单并按下 set origin 按钮。接下来，返回样品重新加载调整模块，单击左侧菜单中的初始参考点部分，然后加载 48 孔 0-20 达因微流控板的文件。
在多维采集模块的载物台部分，双击载物台位置 22.2，通过查看通道 22 使显微镜观察台和相机焦点靠近箭头标记。然后使用纵杆定位孔板，使与观察通道 22 相邻的箭头尖端与十字准线对齐。将多维采集模块中的 Y 坐标复制到 的 Y 位置。
2 在 Sample Reload（样品重新加载调整）模块的 Update Reference points（更新参考点）选项卡中。最后，在样本重新加载调整模块的 Update stage positions（更新阶段位置）选项卡中，单击 apply to MDA stage（应用于 MDA 阶段列表）。在成像模块窗口中，使用多维采集模块，然后单击左侧菜单中的保存选项卡。
然后选择实验的文件名和用于在计算机上存储采集图像的文件夹。接下来，单击延时选项卡并将其设置为在每张图像之间 5 分钟之间获取总共 145 张图像。然后在波长选项卡中，将波长数设置为 1，并以 50%Brightfield 和 50%camera 拍摄，曝光时间为 12-20 毫秒。
将增益设置为 0.6，将数字化器设置为 20 毫赫兹。按照随附的文本协议中的说明设置焦点后，选择 acquire 开始捕获所有子阶段的粘附细胞的预刷新图像。在剪切控制 部分中，将流动模式设置为恒定，并将最大剪切设置为每平方厘米 1 达因。
然后单击入口孔，开始培养基从入口流向出口孔，以去除任何未粘附的细胞。五分钟后，单击孔板控制部分中的停止按钮。允许采集第二轮图像，然后在剪切控制部分，将最大剪切流量调整为每平方厘米 0.5 达因并确认更改。
在成像模块窗口中，选择 analysis tools 选项卡，然后单击下拉菜单中的 review multidimensional data。然后单击 Select base file。这将打开 Multidimensional Data Set utilities 窗口。
接下来，单击 select directory 按钮并选择用于保存实验的文件夹。在数据集列表中，选择实验文件日志。加载日志后，单击 view 按钮。
通过单击左侧波长菜单中的选项来选择波长，然后从下拉菜单中选择要查看的载物台位置。右键单击图像编号，从模块顶部的数字中选择要加载的图像。然后选择所有图像以制作延时视频。
所选图像将在新窗口中作为视频打开。单击成像模块窗口中的 file 选项卡，然后从下拉菜单中选择 Save as。将生成的视频保存为默认文件格式。
最后，打开保存的视频文件并将其加载到图像 J.In 图像 J 中，单击文件选项卡，然后单击另存为。选择 AVI 从下拉菜单中，然后使用设置为每秒 10 帧的 JPEG 转换将文件转换为 AVI 文件。在 RPMI 1640 培养基的野生型条件下，几个细胞强烈粘附在通道上。
它们形成菌丝，并且可以在嵌入菌丝和酵母细胞中观察到厚的生物膜。在微流体实验结束时，野生型生物膜完全填满了这个观看频道。然而，两性霉素 B 的存在对减少生物膜形成有显着作用。
具体来说，细胞的粘附性降低，可以看到几个细胞随着介质的剪切流走。野生型对照细胞，这次在蜘蛛培养基中生长，形成类似于刚才显示的在 RPMI 中生长的生物膜。在该培养基中还生长了两个生物膜缺陷突变体。
与对照相比，两种菌株都显示出生物膜形成严重减少。在该细胞群中，粘附的细胞不会形成菌丝，因此产生的生物膜存在严重缺陷。另一种菌株在生物膜形成和粘附在通道上的能力方面都有缺陷。
掌握后，可以在不到一个小时的时间内设置此实验。使用这种方法，人们可以学到很多关于生物膜形成的许多不同方面的信息，包括初始细胞粘附、生物膜成熟和细胞扩散。该协议是高度可定制和通用的。
它可以进行调整以评估不同王国的不同微生物物种。流速、温度、孵育时间和培养基也可用于研究混合物种生物膜。我们强烈推荐这种微流体生物膜测定法作为体外测定法，在体内动物试验之前使用。
根据我们的经验，该测定的结果与现有的体内生物膜测定非常相关。
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概述
本协议描述了在宿主生理条件下实时可视化白色念珠菌生物膜形成的方法。该技术允许评估抗菌效力和遗传突变体。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 真菌学
- 生物膜研究
背景
- 生物膜是复杂的微生物群落。
- 白色念珠菌是常见的真菌病原体。
- 理解生物膜的形成对开发治疗方法至关重要。
- 该方法可适用于各种微生物。
研究目的
- 实时可视化生物膜的形成。
- 测试抗菌剂的有效性。
- 评估白色念珠菌的遗传突变体。
使用的方法
- 从YPD培养基制备单菌落培养物。
- 使用可定制的自动化微流控设备。
- 实时观察生物膜的发展。
- 对潜在治疗方法进行高通量筛选。
主要结果
- 生物膜形成的实时可视化。
- 能够比较治疗的有效性。
- 适用于其他生物膜形成的微生物。
- 适应各种实验条件的多功能方法。
结论
- 该方法为生物膜动态提供了见解。
- 它可以帮助开发新的抗真菌疗法。
- 在微生物学研究中有广泛应用的潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Real-time visualization of biofilm formation under physiologically relevant flow conditions addresses a critical gap in antifungal target validation, enabling mechanistic de-risking of virulence pathways. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking genetic or pharmacological perturbations to dynamic biofilm phenotypes. The method enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by providing quantitative, reproducible readouts for go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing biofilm development dynamics in real time under controlled shear stress.
- Scientific Value: Supports functional target validation by comparing biofilm formation in wild-type strains versus genetic mutants such as bcr1 and EFG1.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through automated microfluidic control of temperature, flow rate, and media composition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative time-lapse imaging data to assess antimicrobial effects, such as amphotericin B-mediated biofilm inhibition.
- Operational Value: Enables high-throughput screening of potential therapeutics with reproducible biofilm formation metrics under laminar flow.
- Operational Value: Supports assay adaptation across microbial species, including bacteria and other fungi, broadening platform utility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant insights by mimicking host conditions encountered in vascular catheters and mucosal layers.
- Operational Value: Offers predictive de-risking by correlating in vitro biofilm dynamics with established in vivo assay outcomes.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying biofilm-defective mutants or compounds with inhibitory activity.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic biofilm assay integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical support, enabling iterative design-make-test cycles.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of virulence factors by visualizing hyphal formation and intercellular matrix development over time.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized image acquisition and timelapse video generation for comparative analysis.
- Analytics: Enables quantitative comparison of biofilm architecture, adherence, and dispersal under varying shear stress and drug exposure conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by modeling biofilm formation on abiotic surfaces relevant to medical devices.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for antifungal and antibiofilm compound screening across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in biofilm formation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through automated fluidic control and standardized imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage de-risking of biofilm-active compounds before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by linking genetic or chemical perturbations to quantifiable biofilm defects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological culture preparation and microfluidic system operation.
- Dependent on access to automated microfluidic platforms with precise shear stress and temperature control.
- Necessitates cross-team standardization for image acquisition, analysis, and data interpretation across biology and imaging teams.
- Involves adaptation considerations when extending the method to mixed-species biofilms or alternative microbial kingdoms.
- Practical limitations include the need for optimized staining or contrast agents to enhance visualization of specific biofilm components.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Preparation of Microfluidic Channels of the Microfluidic Plate
2:08
Candida albicans Biofilm Formation in the Microfluidic System
4:06
Setting Up the Stage Positions for the Microfluidic Experiment
6:01
Microfluidic Experiment Image Acquisition
7:38
Analyzing the Results
9:07
Results: Drug Exposure and Genetic Mutations Can Alter Biofilm Formation
10:20
Conclusion
