Name: 全自动微流控装置在白色念珠菌生物膜形成中的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 了解全自动微流控装置实时可视化白色念珠菌生物膜形成的方法。该技术可评估抗真菌药物效果及基因突变株，为开发新型抗真菌疗法提供高通量筛选平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Nobile实验室所有成员对生物膜检测实验的有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R21 AI125801（资助对象：C.J.N.）支持。D.L.R. 受加州大学墨西哥与美国研究所（UC-MEXUS）和国家科学技术委员会（CONACYT）博士生奖学金资助。

1. 真菌细胞培养物的制备
注意：细胞培养操作（例如打开冷冻保存管、细胞培养管和培养瓶）必须在生物安全柜内进行。操作前至少1小时开启生物安全柜的紫外线（UV）杀菌灯，并在开始操作时关闭UV灯。操作过程中需佩戴手套、护目镜及其他适当的个人防护装备，实验开始前使用70%乙醇对实验台面和移液器表面进行去污处理。建议使用带滤芯的无菌吸头，并熟悉基本的无菌微生物操作技术。
<ol>
	<li>在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖；pH 6.8）琼脂平板上划线接种白色念珠菌（C. albicans）菌株（野生型、bcr1 Δ/Δ 和 efg1 Δ/Δ）。按照标准微生物操作规范，在 30 °C 下培养 48 小时19。</li>
	<li>从平板上挑选一个单一孤立菌落，接种至 4 mL YPD 液体培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖；pH 6.8）中，在标准摇床培养箱中于 30 °C、225 rpm 振荡培养 12–15 小时，遵循标准微生物操作规范19。</li>
	<li>使用比色皿（1 mL，光程 1 cm）在 600 nm 处测定培养物的光密度（OD），以确定细胞密度，操作遵循标准微生物操作规范19。</li>
	<li>将细胞培养物用 RPMI-1640 培养基（含 165 mM 3-吗啉丙磺酸（MOPS）、L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，pH 7.0）或 Spider 培养基（1% 营养肉汤，1% 甘露醇，0.4% K2HPO4，pH 7.2）稀释至终 OD600 为 0.5，相当于 2 × 107 个细胞/mL。 
	注意：可根据需要使用其他培养基以支持特定目标菌株的生长。 
	注意：细胞稀释不宜过早进行。建议在完成下述步骤 3.3 后再开始稀释，以防止细胞在接种至观察通道前启动菌丝形成。</li>
</ol>
2. 微流控板微流控通道的制备
注意：有关芯片和仪器设置的信息，请参阅微流控系统的用户手册（见材料表）。
<ol>
	<li>在进行微流控实验之前，将 20 mL RPMI-1640 培养基或 Spider 培养基置于 37 °C 培养箱中预热。根据步骤 2.8 的计算结果，可能需要额外的培养基体积。预热培养基可防止实验过程中产生气泡。</li>
	<li>开启微流控系统，包括控制器、两个电源单元、显微镜、相机以及连接系统的计算机。在计算机的程序菜单中打开控制系统软件（参见材料表）。程序启动后将显示两个窗口。</li>
	<li>找到正在使用的芯片的条形码编号，并在软件提示时输入该编号。使用两个独立的计算机屏幕分别查看两个窗口。其中一个窗口（控制模块）包含芯片的控制功能，另一个窗口（Montage，成像模块）包含显微镜和相机的控制功能。</li>
	<li>打开控制器上的加热电源按钮，并使用温度控制器上的箭头按钮将微流控系统的温度设置为 37 °C。</li>
	<li>使用无菌水清洁接口板（图 1），具体操作如下：用无菌水喷洒接口板底部，并用镜头纸擦拭去除灰尘或污物。将接口板正面朝下放置在干净的镜头纸上自然晾干。使用 70% 异丙醇和镜头纸清洁接口板顶部。 
	注意：接口板用于连接微流控系统与含有细胞和培养基的芯片。请确保无任何液体残留，并彻底清除所有纤维和灰尘。清洁不当可能导致图像和视频质量下降。</li>
	<li>去除接口板管路上的冷凝水。
	<ol>
		<li>将接口板正面朝下放置在镜头纸上。在控制模块窗口中，点击芯片的手动模式。在剪切力控制菜单部分，点击第 1–4 列和第 5–8 列的流体选择，并从下拉菜单中选择 37 °C。在剪切力控制部分，将流动模式设为恒定，并将最大剪切力设为 2 dyne/cm2（0.2 Pa）（图 2A）。</li>
		<li>点击进样孔以启动无菌空气流经接口板管路，从而去除冷凝水。5 分钟后，点击孔板控制区域的停止按钮（图 2A）。观察接口板中的管路，确认所有冷凝水已被清除。若仍可见液滴，请重复上述无菌空气流动过程，再持续 5 分钟。 
		注意：进样管连接有 0.22 微米滤器，以确保仅有无菌空气进入微流控系统。可通过控制模块窗口屏幕上的事件日志监控气流情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 48 孔 0–20 dyne 微流控芯片放置在显微镜载物台上。</li>
</ol>
3. 白色念珠菌 微流控系统中的生物膜形成
<ol>
	<li>为记录生物膜形成过程，向入口孔中加入 600 µL 预热的 RPMI-1640 培养基或蜘蛛培养基（参见 图 1 了解板布局）。每种实验条件需设置两个重复。
	<ol>
		<li>若检测 C. albicans 野生型及突变株的生物膜形成能力，向实验板的入口孔中加入 600 µL 蜘蛛培养基。</li>
		<li>若检测在抗真菌药物（或其他目标化合物）存在条件下的生物膜形成，向两个入口孔中各加入 600 µL RPMI-1640 培养基（阴性对照），并向另外两个入口孔中各加入 600 µL 添加两性霉素 B（16 µg/mL）（或目标药物在所需浓度下）的 RPMI-1640 培养基。 
		注：对于 12 小时的生物膜形成实验，向入口孔中加入 600 µL 预热培养基；对于更长时间的实验，需额外补充培养基（50 µL/h）。切勿超过孔的最大容量（1,500 µL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将清洁的接口板缓慢放置在 48 孔微流控板上方。将接口板轻微向左滑动，使接口板上的管子对准入口和出口孔。将接口板上的杠杆从左向右转动，以锁定接口板位置，确保实验系统密闭。 
	注：接口板中管子流出的无菌空气会推动入口或出口孔中的液体（具体方向由计算机软件设定），使液体以用户指定的方向和速度流经入口与出口孔之间的观察通道。</li>
	<li>在剪切力控制部分，将流动模式设为恒定，并将最大剪切力设为 1 dyne/cm2（0.1 Pa）。点击含有培养基的入口孔，启动培养基从入口孔向出口孔的流动（图 2A），以预润通道。5 分钟后，点击微孔板控制部分的停止按钮。取下接口板并观察微流控板的孔。完成通道预润后，仅在出口孔中可见少量液滴。若未见液滴，以每次 2 分钟的增量继续预润通道，直至出口孔中出现少量液滴。 
	注：预润操作旨在清除观察通道中的空气，确保通道完全充满所需培养基。</li>
	<li>将接口板从微流控板上取下，并置于无菌表面备用。向每个出口孔中加入 50 µL 细胞培养物（见步骤 1.5 的描述）。
	<ol>
		<li>若检测 C. albicans 野生型及突变株，向两个出口孔中各加入 50 µL 野生型（SC5314）细胞培养物（在蜘蛛培养基中），向另外两个出口孔中各加入 50 µL bcr1 Δ/Δ 细胞培养物（在蜘蛛培养基中），再向另外两个出口孔中各加入 50 µL efg1 Δ/Δ 细胞培养物（在蜘蛛培养基中）。将接口板重新放回微流控板上并锁紧盖子（参见 图 1 了解板布局）。 
		注：如步骤 3.1.1 所述，所有对应的入口孔中均含有蜘蛛培养基。</li>
		<li>若检测 C. albicans 在两性霉素 B 或其他目标化合物存在条件下的生物膜形成，向四个出口孔中各加入 50 µL 野生型（SC5314）细胞培养物（在 RPMI-1640 培养基中）。将接口板重新放回微流控板上并锁紧盖子（参见 图 1 了解板布局）。 
		注：如步骤 3.1.2 所述，所有对应的入口孔中均含有含或不含两性霉素 B 或其他目标化合物的 RPMI-1640 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在剪切力控制部分，将流动模式设为恒定，并将最大剪切力设为 2 dyne/cm2（0.2 Pa）。点击含有细胞的出口孔，启动培养基从入口孔向出口孔的流动（图 2A），开始接种 C. albicans。3 秒后，点击微孔板控制部分的停止按钮，防止细胞进入入口孔。 
	注：细胞从出口孔向入口孔移动；必须在细胞到达入口孔前停止流动，以确保入口孔不被细胞培养物污染，并保证入口孔中的培养基在整个实验过程中保持无菌。所需的剪切力和时间取决于所用培养基的黏度和细胞大小。</li>
	<li>让细胞在观察通道中静置，不施加流动（0 dyne/cm2），持续 10 - 20 分钟，以实现初始细胞黏附。在此 10 - 20 分钟的黏附期间，设置计算机以捕获相机阶段位置，并开始采集冲洗前图像（详见第 4 - 6 节）。</li>
</ol>
4. 为微流控实验设置显微镜载物台位置
注意：应在实验开始前立即设置显微镜载物台位置和微流控板校准。此设置可使计算机存储实验过程中每个观察通道的成像位置。完成载物台位置设置后，不得再移动微流控板。若微流控板发生位移，则必须在实验开始前重新设置载物台位置。
<ol>
	<li>使用可视化分析软件（见材料表）设置载物台位置；每个观察通道对应一个载物台位置（1 - 24）图1D）且每个阶段均包含三个子阶段（1 - 3），用于在观察通道的不同位置进行图像采集图1C）。在成像模块窗口中，通过点击 MDA 选项卡打开“多维采集”（MDA）模块（图2B).</li>
	<li>在 MDA 模块中，单击左侧菜单中的“Stage”标签页（图2B）。在阶段设置部分，加载适用于48孔0-20达因微流控板的主阶段列表。每个观察通道应包含三个用于图像采集的阶段。</li>
	<li>单击 SRA 选项卡和 MAP 选项卡，打开“样品重装调整”（SRA）和“将载物台移动至绝对位置”（MAP）模块图2B在SRA模块中，按下“实时”按钮以查看带十字准线的图像预览。</li>
	<li>使用操纵杆移动孔板，使位于孔板上的箭头尖端（物理位置在孔板上）与软件中第4观察通道附近的十字准线对齐。在MAP菜单中，按下“Set Origin”按钮（图2B）。此时，X、Y 和 Z 的当前位置读数均应为 0。</li>
	<li>在 SRA 模块中，单击左侧菜单中的“初始参考点”部分（图2B). 单击“加载设置”，并加载适用于48孔0-20达因微流控板的文件。</li>
	<li>在MDA模块的载物台部分，双击“载物台位置 22,2”。该位置表示第22号观察通道的中间位置（子阶段2）。此操作将使显微镜观察载物台和相机焦点接近第22号观察通道的箭头标记。使用操纵杆移动孔板，使位于孔板上、紧邻第22号观察通道的箭头尖端与十字准线对齐。</li>
	<li>将 MDA 模块中的 Y 坐标复制到 SRA 模块“更新参考点”选项卡中点 2 的 Y 位置图2B).</li>
	<li>在 SRA 的“更新阶段位置”选项卡中，单击“应用于 MDA 阶段列表”图2B). 
	注意：此操作将更新微流控板上所有观测区域（1-24）的载物台位置，使其与显微镜载物台上微流控板的特定位置对齐校准。现在，该板已准备好进行图像采集，在从全部24个观测通道的三个位置采集图像时，将使用已校准的载物台位置进行移动。</li>
</ol>
5. 微流控实验中图像采集的设置
<ol>
	<li>在成像模块窗口中，使用MDA模块，点击左侧菜单中的“保存”选项卡（图2B）。为实验选择文件名，并指定计算机上用于存储所采集图像的文件夹。</li>
	<li>在MDA模块中，点击左侧菜单中的“时间序列”选项卡，设置总共采集145张图像；图像间的时间间隔设为5分钟。这将实现每5分钟采集1张图像，持续12小时的生物膜发育实验。 
	注意：图像间的时间间隔和总图像数量可根据实验需求进行调整。若成像时间超过12小时，请在步骤3.1中向入口孔添加额外培养基，以确保孔内不会干涸。对于更长时间的实验，根据需要（50 µL/h）向入口孔补充额外培养基。</li>
	<li>在MDA模块中，点击左侧菜单中的“波长”选项卡（图2B），将实验的波长数量设置为1。设置采集波长为50%明场和50%相机，曝光时间为12–20 ms，增益为0.6，数字化器频率为20 MHz。 
	注意：可使用更多波长，包括用于荧光成像的波长（例如，我们已成功利用该微流控装置观察到标记mCherry和GFP的C. albicans菌株）。采集参数也可根据实验需求进行调整。例如，建议初学者设置第二个波长并选择“每个时间点自动对焦”，以及设置第三个波长并选择“每个时间点自动曝光”，以最大程度确保获得清晰的图像。</li>
	<li>在MDA模块中，选择左侧菜单中的“阶段列表”选项卡。阶段1,1至24,3将被显示出来。逐一点击每个阶段，使用精细对焦设置手动对每个阶段观察通道中的细胞进行对焦。当视野清晰后，点击阶段列表旁的黑色箭头，以更新并保存每个阶段的设置。计算机将使用这些手动设定的位置和焦距参数，在每个时间点自动采集图像。使用“移除”箭头从列表中删除未使用的阶段。 
	注意：MDA模块及程序中将观察通道与阶段互换使用，软件采用相同的术语。</li>
</ol>
6. 运行微流控实验
<ol>
	<li>在成像模块窗口中，使用 MDA 模块，选择“Acquire”以开始捕获所有子阶段中贴壁细胞的冲洗前图像（图2B）。 
	注意：此时成像模块窗口和相机控制界面将显示正在捕获的图像，而 MAP、SRA 和 MDA 模块将不再可见。所捕获的图像侧面还将显示计时器，用于指示当前捕获的图像编号以及下一次图像捕获周期开始前的时间间隔。请等待完成一轮图像采集后再进行下一步操作。 
	注意：请勿点击成像模块窗口界面上的“Pause”或“Mark Event”按钮。从本步骤开始，在整个实验过程中，仅将鼠标操作保留在第二台计算机屏幕上的控制模块窗口（图2A）。这一点至关重要，以避免干扰成像模块窗口。</li>
	<li>在控制模块窗口中，保持微孔板处于手动模式。在剪切力控制部分，将流动模式设置为恒定，并将最大剪切力设为 1 dyne/cm2（0.1 Pa）。点击出口孔 O1、O7、O13 和 O19，以启动培养基从入口孔到出口孔的流动（图2A），从而去除未贴壁的细胞。5 分钟后，点击微孔板控制部分的停止按钮。随后允许系统再进行一轮图像采集。可在第二块屏幕的成像模块窗口中查看所采集的图像并监控时间间隔。</li>
	<li>在剪切力控制部分，通过点击最大剪切力列中的数值，并使用键盘输入 0.5，将最大剪切力调整为 0.5 dyne/cm2（0.05 Pa）。按下键盘上的回车键，并在控制模块窗口的事件日志中确认流速变化（图2A）。随后将实验装置置于黑暗环境中静置 12 小时，期间避免扰动。 
	注意：光照以及移动/振动会显著降低整个实验过程中所采集图像的质量。微流控实验结束后，成像模块窗口将不再显示任何图像，并恢复显示 SRA、MAP 和 MDA 模块。可使用成像模块软件查看图像、组装视频，并对形成的生物膜进行定量分析（如下所述）。</li>
</ol>
7. 结果分析
<ol>
	<li>在成像模块窗口中，选择“分析工具”选项卡，然后从下拉菜单中点击“查看多维数据”（RMD）。在RMD模块中，点击“选择基础文件”，这将打开“多维数据集工具”窗口。</li>
	<li>点击“选择目录”按钮，选择在步骤5.1中用于保存实验的文件夹。在“数据集”列表中，选择实验日志文件（.nd扩展名）。日志加载完成后，点击“查看”按钮。</li>
	<li>通过点击左侧“波长”菜单中的选项选择波长，并从下拉菜单中选择要查看的载物台位置。通过右键点击模块顶部的图像编号，选择要加载的图像。选择完成后，点击“加载图像”按钮以加载图像。您可以一次查看单张图像或全部图像。</li>
	<li>选择所有图像以生成延时视频。所选图像将在新窗口中以视频形式打开。点击成像模块窗口中的“文件”选项卡，从下拉菜单中选择“另存为”，将生成的视频保存为默认格式（TIFF/MetaSeries）。</li>
	<li>使用ImageJ软件打开并加载已保存的视频文件。在ImageJ中，点击“文件”选项卡，然后点击“另存为”。从下拉菜单中选择“.avi”格式，并使用JPEG转换设置为10帧/秒，将文件转换为.avi格式。 
	注意：可通过调整帧率（帧/秒）来改变视频播放速度。</li>
	<li>为定量分析生物膜，重复步骤7.2、7.3和7.4。选择最后一张图像（编号144），点击“加载图像”按钮以加载该图像。图像将在新窗口中打开。点击“设定阈值图像”按钮，选择“包含性”阈值。移动光标，使生物膜细胞区域显示为红色，而无细胞区域不着色。</li>
	<li>点击“打开日志”按钮以记录测量值（该按钮初始显示为“打开日志”；当日志激活后，按钮名称将更改为“F9: 记录数据”）。在“打开数据日志”窗口中选择“动态数据交换”，然后点击“确定”。</li>
	<li>在成像模块窗口中，选择“分析工具”选项卡，然后点击“显示区域统计”。这将打开一个新窗口，显示来自图像的测量结果。在“测量”选项中选择“整幅图像”，然后点击“F9: 记录数据”。一个包含所有测量值的Excel文件将被显示。找到“面积”和“阈值化面积”的数值，将后者除以前者，得到生物膜占据面积的数值。 
	注意：实验过程中获得的每幅图像的“面积”均相同，因此可通过“阈值化面积”测量值评估野生型菌株与突变菌株之间生物膜形成的差异，或评估测试药物对生物膜形成的影响效果。</li>
</ol>

<ol><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Biofilms+and+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Biofilms and Human Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).</li>
<li>Kojic, E. M., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+infections+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida infections of medical devices.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).</li>
<li>Fox, E. P., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+EP+%22Candida+albicans%3A+Symptoms%2C+Causes+and+Treatment+Options%22">Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options</a>. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).</li>
<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Uppuluri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+as+an+important+step+in+the+Candida+albicans+biofilm+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000828(2010).</li>
<li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li>
<li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li>
<li>Nett, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+indwelling+urinary+catheter+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection.</a> Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).</li>
<li>Krom, B. P., Willems, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+for+Candida+Biofilm+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models for Candida Biofilm Development.</a> Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).</li>
<li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Candida+species+on+the+surface+of+catheter+materials+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro.</a> Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).</li>
<li>Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+Candida+biofilm+microtiter+plate+model+for+measurement+of+antifungal+susceptibility+by+tetrazolium+salt+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay.</a> J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).</li>
<li>Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+candidal+biofilm+microtiter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized candidal biofilm microtiter assay.</a> J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).</li>
<li>Lohse, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+Optimizations+of+Candida+albicans+In+Vitro+Biofilm+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).</li>
<li>Winter, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Identification+of+Biofilm-Specific+Proteolysis+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans.</a> mBio. 7 (5), (2016).</li>
<li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li>
<li>Fox, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+regulatory+network+temporally+controls+Candida+albicans+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
<li>Baker, K. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/link/atbench2.htm">At the bench: A laboratory navigator</a>. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Clarissa J. Nobile 是 BioSynesis 公司的创始人，该公司致力于开发针对白色念珠菌（C. albicans）生物膜的抑制剂和诊断工具。

本文所述的可定制微流控生物膜检测方法能够在固定流速的层流和恒定温度条件下，实时观察单细胞水平的生物膜形成过程。该方法为研究野生型和突变菌株中生物膜的发育过程，以及在模拟临床生理环境条件下抗菌剂处理对生物膜的影响提供了有力手段。与大多数体外（in vitro）生物膜检测方法不同，该技术允许对形成过程中的生物膜进行实时动态观察。
该方法可用于高通量操作，可同时运行多达24个样品以评估生物膜的形成。该方法还可用于对突变体文库进行遗传筛选，以鉴定生物膜正常发育所必需的基因，并可用于在化合物文库筛选中评估感兴趣抗菌化合物对生物膜的作用效果。我们预计，该微流控装置未来的应用将包括此类筛选。然而需要注意的是，某些药物处理测试会受到该微流控装置所形成生物膜厚度的限制，因为培养时间超过&#62;16小时的生物膜容易堵塞观察通道。因此，药物测试实验需在&#60;16小时内完成。
总体而言，该装置具有高度的可定制性和多功能性，可调节用于评估不同界微生物物种、流速、温度、孵育时间及培养基条件下的生物膜形成。本方法可提供关于生物膜形成...

白色念珠菌 是人类微生物群的共生成员，但同时也是一种机会性病原体，可引起浅表及严重的真菌感染1,2一种主要的毒力特征 C. albicans 是其能够形成具有较强抵抗力且耐药的生物膜，即附着在表面并被包裹于胞外基质材料中的细胞群落1,3. C. albicans 生物膜具有高度结构化特征，包含多层不同类型的细胞（圆形出芽酵母样细胞、椭圆形假菌丝细胞和管状菌丝细胞）4. C. albicans 生物膜的发育始于圆形酵母样细胞附着于表面（生物膜的定植），随后这些细胞在表面增殖，接着未成熟的生物膜结构进一步成熟，形成被胞外基质物质包围的完整生物膜4成熟的生物膜主要由细长的菌丝细胞构成，这些细胞形成致密且相互连接的网络结构，为生物膜提供结构稳定性。4在整个生物膜生命周期中，圆形出芽的酵母细胞会从成熟的生物膜中分散出来，可能迁移至机体其他部位，引发播散性感染或在其他位点形成新的生物膜。4,5. C. albicans 可在生物表面（如黏膜表面和宿主组织）以及非生物表面（如导管、起搏器、义齿和人工关节）上形成生物膜。由于生物膜具有顽固性，极难清除，许多情况下唯一有效的治疗策略是移除受感染的装置4因此，有必要在与临床环境相似的条件下研究生物膜的形成。
目前有多种关键的体内动物模型用于研究C. albicans生物膜的形成6,7,8；然而，这些研究成本较高、耗时较长，且在特定时间内可测试的菌株和抗菌剂数量有限。体外生物膜检测方法则能够快速、高通量地评估抗真菌化合物和突变菌株，相较于动物模型中的生物膜检测，具有更高的成本效益和伦理优势9,10,11,12,13,14。本文介绍了一种我们开发并优化的体外检测方法，该方法利用可定制的微流控装置，在层流条件下实现对生物膜形成过程的动态观察14,15。该检测方法可清晰呈现生物膜形成的各个阶段，包括初始黏附、细胞增殖、生物膜成熟以及细胞扩散过程，同时也有助于观察生物膜发育过程中细胞形态的动态变化。
微量滴定板，通常用于 体外 生物膜检测虽然通量较高，但无法实现对流体条件的精确控制。传统的层流细胞系统可在受控的流动条件下连续评估生物膜的形成，但其搭建过程通常耗时较长，且动态范围调控能力有限，通量较低。本文所采用的微流控装置通过将高通量培养板（含48孔）与内置的层流腔室相结合，克服了上述局限，具有高度可重复性、多功能性及可定制性。
本文介绍了一种利用市售自动化微流控装置检测野生型菌株生物膜形成的实验方案 C. albicans 菌株、已知抗真菌剂对生物膜发育的影响，以及两种突变株的生物膜形成能力bcr1Δ/Δ 和 efg1 Δ/Δ）菌株，先前报道称其存在生物膜缺陷 体外 和 体内16,17,18该方案可用于测试抗菌剂在生物膜发育全过程中的抑制生物膜形成效果，并通过筛选突变体文库鉴定生物膜正常发育所必需的基因。

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>用于活细胞分析的自动化微流控设备</td></tr><tr><td>48孔板 0-20 达因</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>微流控板</td></tr><tr><td>Montage 软件</td><td>Fluxion</td><td>版本 7.8.4.0</td><td>可视化分析软件</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Criterion</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>右旋糖（D-葡萄糖）</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>营养肉汤</td><td>Criterion</td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-甘露醇</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Criterion</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>无菌接种环</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>带透明盖的培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>一次性比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>镜头纸</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>微孔板和比色皿分光光度计</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

生物膜形成的可视化 白色念珠菌 使用自动化微流控装置

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

白色念珠菌 是人类最常见的真菌病原体，导致约15%的医院获得性败血症病例。其主要毒力特征之一是 C. albicans 是其形成生物膜的能力，即附着于生物性和非生物表面的结构化细胞群落。 C. albicans 生物膜可在宿主组织（如黏膜层）以及医疗器械（如导管、起搏器、义齿和关节假体）表面形成。由于生物膜对物理和化学干扰具有高度抗性，并可作为播散性感染的感染源，因此构成了重大的临床挑战。各种 体外 已采用多种检测方法来研究 C. albicans 生物膜形成，例如微孔板检测、干重测量、细胞活力检测以及共聚焦激光扫描显微镜观察。上述所有检测均为单时间点终点检测，即在特定时间点评估生物膜的形成情况。本文描述了一种利用自动化微流控装置在层流条件下实时研究生物膜形成的实验方案。该方法可在生物膜随时间发育的过程中对其进行动态观察，并可自定义模拟宿主环境的条件，例如血管导管中的环境。本方案可用于实时评估基因突变株在生物膜形成中的缺陷，以及抗菌剂对生物膜发育的抑制作用。

我们在此描述的微流控生物膜实验中，使用野生型 C. albicans 菌株在两种培养基条件下（RPMI-1640 和 Spider 培养基）、野生型菌株在 RPMI 培养基中添加已知抗真菌药物两性霉素 B（16 µg/mL）的条件，以及两种先前报道在生物膜形成方面存在缺陷的突变菌株（bcr1Δ/Δ 和 efg1Δ/Δ）在 Spider 培养基中进行实验。
视频1展示了野生型生物膜在RPMI-1640培养基中的形成过程，以及抗真菌药物两性霉素B对生物膜形成的抑制作用。在野生型条件下，大量细胞牢固黏附于微流控通道内，随着时间推移，细胞逐渐形成菌丝，可见由交织的菌丝和酵母细胞构成的厚实生物膜。在微流控实验接近结束时，野生型生物膜完全充满观察通道。然而，添加两性霉素B后，生物膜的形成受到显著抑制：细胞的黏附能力明显减弱，在药物存在下，许多细胞随培养基的剪切流被冲走，与未处理组形成鲜明对比。随着时间推移，细胞...

本方案描述了使用可定制的自动化微流控装置来观察生物膜形成的实验方法 Candida albicans 在宿主生理条件下

白色念珠菌是人类最常见的真菌病原体，导致约15%的医院获得性败血症病例。C. ...

本实验方案的总体目标是在宿主生理条件下实时观察白色念珠菌生物膜的形成过程。该方法能够实时监测生物膜的动态发育过程，可用于评估抗菌剂的效果或分析基因突变体的表型。该技术可用于高通量筛选针对生物膜的潜在治疗药物，并可对药物效果进行测量、可视化分析，并与现有治疗方法进行比较。该技术的主要优势在于可用于检测在研究人员关注的多种不同条件下生物膜的形成情况。尽管该方法最初是为研究白色念珠菌（Candida albicans）生物膜形成而开发的，但也可应用于其他能够形成生物膜的微生物，包括其他真菌种类以及细菌。首先，根据标准的微生物学操作规范，从接种于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基琼脂平板上的细胞中制备不同白色念珠菌（C.albicans）菌株的单菌落培养物。接下来，启动包括控制器、两个电源单元、显微镜、相机以及连接至系统的计算机在内的微流控系统。计算机启动完成后，打开控制该系统的软件。找到正在使用的培养板上的条形码编号，并在软件提示时输入该编号。然后在控制模块中，将微流控系统的温度设置为 37 摄氏度。接着，点击入口孔 I1、I7、I13 和 I19，使无菌空气通过接口板管道持续五分钟，以去除任何冷凝液。当所有冷凝液完全蒸发后，将 48 孔 0–20 达因微流控板放置在显微镜载物台上。进行12小时生物膜形成实验时，首先向入口孔中加入600微升预热的培养基。将清洗干净的接口板缓慢放置在48孔微流控板上方，然后将接口板轻轻向左滑动，直至管道位于入口孔和出口孔的正上方并锁定到位。在软件的剪切力控制部分，将流动模式设置为恒定，并将最大剪切力设为1达因每平方厘米。然后点击含有培养基的入口孔，以启动培养基从入口孔到出口孔的流动，从而对通道进行预灌注。流动5分钟后，点击软件微孔板控制部分的停止按钮。然后移除接口板，观察微流控板的孔。仅在出口孔中可见少量培养基液滴。为检测野生型和突变型白色念珠菌菌株，将50 µL以蜘蛛培养基培养的野生型SC5314细胞培养物加入两个出口孔，将bcr1突变株加入另外两个出口孔，再将EFG1突变株加入剩余两个出口孔。将接口板重新放回微流控板上，并锁定盖子。返回软件的剪切力控制部分，将流速模式设置为恒定，并将最大剪切力设为2 dyne/cm²。点击含有细胞的出口孔，以启动培养基从出口孔向入口孔流动，开始接种白色念珠菌。三秒后，点击孔板控制区域中的停止按钮，以防止细胞进入进样孔。让细胞在观察通道中静置 10–20 分钟，无液体流动，以实现细胞的初始贴附。在成像模块窗口中，打开多维采集模块，并点击左侧菜单中的载物台标签。在阶段设置部分，加载用于48孔0-20达因微流控板的主阶段列表。接着，打开样品重装调整界面，并将阶段移动至绝对位置模块。在样品重装调整模块中，按下实时按钮，即可看到带十字准线的图像预览。使用操纵杆移动孔板，使观察通道四旁边的箭头尖端与软件中的十字准线对齐。然后进入“移动载物台至绝对位置”菜单，按下“设置原点”按钮。接下来，返回样品重新加载调整模块，点击左侧菜单中的“初始参考点”部分，并加载适用于48孔0-20达因微流控板的文件。在多维采集模块的载物台区域，双击载物台位置 22.2，通过观察通道 22，使显微镜观察载物台和相机焦点接近箭头标记。然后使用操纵杆调整孔板位置，使紧邻观察通道 22 的箭头尖端与十字准线对齐。将多维采集模块中的 Y 坐标复制到 Y 位置中。在样本重新加载调整模块的“更新参考点”选项卡中选择2。最后，在样本重新加载调整模块的“更新载物台位置”选项卡中，单击“应用于MDA载物台列表”。在成像模块窗口中，使用多维采集模块，并在左侧菜单中单击“保存”选项卡。然后选择实验的文件名以及用于在计算机上存储所采集图像的文件夹。接下来，点击时间序列（timelapse）标签，设置共采集145张图像，每张图像间隔5分钟。随后在波长标签中，将波长数量设置为1，以50%明场光和50%相机光进行采集，曝光时间为12–20毫秒。将增益设为0.6，数字化仪设为20毫赫兹。按照随附文本方案中的描述设置好焦距后，选择“采集”以开始捕获所有阶段中黏附细胞的灌注前图像。在剪切力控制部分，将流动模式设为恒定，最大剪切力设为1达因每平方厘米。然后点击入口孔，以启动培养基从入口孔到出口孔的流动，从而去除任何未贴壁的细胞。五分钟后，点击孔板控制部分的停止按钮。等待第二轮图像采集完成，然后在剪切力控制部分，将最大剪切流速调整为 0.5 dyne/cm²，并确认更改。在成像模块窗口中，选择分析工具选项卡，然后从下拉菜单中点击“查看多维数据”。接着点击选择基础文件，这将打开多维数据集工具窗口。接下来，单击选择目录按钮，并选择用于保存实验的文件夹。在数据集列表中，选择实验文件日志。日志加载完成后，单击查看按钮。通过单击左侧波长菜单中的选项来选择波长，并从下拉菜单中选择要查看的载物台位置。通过右键单击模块顶部的图像编号来选择要加载的图像。然后按顺序选择所有图像，以生成延时视频。所选图像将在新窗口中以视频形式打开。单击成像模块窗口中的文件选项卡，然后从下拉菜单中选择“另存为”。将生成的视频以默认文件格式保存。最后，将保存的视频文件打开并载入 ImageJ。在 ImageJ 中，单击“文件”选项卡，然后单击“另存为”。从下拉菜单中选择 AVI 格式，并使用 JPEG 编码将其转换为每秒 10 帧的 AVI 文件。在 RPMI 1640 培养基的野生型条件下，多个细胞牢固地黏附于通道上。它们形成菌丝，可观察到由交织的菌丝和酵母细胞构成的较厚生物膜。在微流控实验接近结束时，野生型生物膜完全填满观察通道。然而，两性霉素B的存在显著抑制了生物膜的形成。具体而言，细胞的黏附能力减弱，多个细胞可见随培养基的剪切流被冲走。野生型对照细胞此次在蜘蛛培养基中培养，形成的生物膜与之前在RPMI培养基中生长的生物膜相似。在同一培养基中还培养了两种生物膜缺陷型突变株。与对照组相比，这两种菌株的生物膜形成能力均显著降低。在此细胞群体中，黏附的细胞无法形成菌丝，导致所形成的生物膜存在严重缺陷。该菌株在生物膜形成能力以及黏附至通道表面的能力方面均存在缺陷。一旦掌握，该实验可在不到一小时内完成设置。通过此方法，可深入了解生物膜形成的多个不同方面，包括初始细胞黏附、生物膜成熟以及细胞扩散。该方案具有高度可定制性和广泛适用性。该方法可调整用于评估不同界中的多种微生物物种。通过调节流速、温度、培养时间及培养基，也可用于研究多物种混合生物膜。我们强烈推荐将此微流控生物膜检测法作为体内动物实验前的体外检测手段。根据我们的经验，该检测的结果与现有的体内生物膜检测结果具有很好的相关性。

visualization-biofilm-formation-candida-albicans-using-an-automated

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

全自动微流控装置在白色念珠菌生物膜形成中的可视化

我们介绍一种使用96孔微孔板形成Candida...

一种基于96孔微孔板的真菌生物膜形成监测及抗真菌药物敏感性检测方法 白色念珠菌 生物膜

我们开发了一种高密度微阵列平台，该平台由名为CaBChip的白色念珠菌（C.

Candida albicans 生物膜芯片（CaBChip）用于高通量抗真菌药物筛选

来源：Kurz, D. L., 等。用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台。J. Vis. Exp.

一种用于生物膜形成过程中实时成像与压力追踪的微流控装置

本视频展示了以下内容的开发过程 体内 用于研究生物膜形成的鼠类模型 白色念珠菌 在皮下组织中。该实验涉及植入...

Candida albicans 在小鼠体内的生物膜形成模型

本视频介绍了一种利用显微镜培养并定性分析真菌菌丝上细菌生物膜的方法。细菌生物膜常在真菌表面形成，涉及多种细菌与真菌的相互作用过程，例如代谢协作、竞争或捕食。...

一种用于制备样本以观察菌丝上生物膜形成细菌的方法

本文讨论了在模拟多孔介质的微流控装置中研究生物膜形成的实验方案。该微流控装置包含一组微柱阵列，并在此装置中研究了荧光假单胞菌（Pseudomonas...

微流控芯片中微柱结构内生物膜流束形成的实验方案

我们介绍了一种在小鼠皮下模型中建立Candida...

Candida albicans 在小鼠皮下模型中于医学相关异物表面的生物膜形成及其生物发光成像检测

本方法学论文的目的是介绍一种微流控系统的使用，用于构建包含人类龈上牙菌斑中常见菌种的多物种生物膜。 文中重点阐述了描述生物膜结构、生物膜活性的方法，以及一种用于培养依赖性或培养非依赖性分析的生物膜收获技术。...

高通量技术的应用 体外 用于构建口腔多物种生物膜的微流控系统

本方案描述了一种在真菌菌丝上培养并利用共聚焦显微镜和电子显微镜对细菌生物膜进行定性分析的新方法。...

一种利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法

我们描述了一种用于在流动条件下实时成像真菌生物膜形成的流动装置的组装、操作和清洗方法。同时，我们还提供并讨论了用于分析所获取图像的定量算法。...

利用双相循环流动系统对真菌生物膜发育进行实时成像与定量分析

观察和量化内部特征 白色念珠菌...

澄清与成像 白色念珠菌 生物膜

了解全自动微流控装置实时可视化白色念珠菌生物膜形成的方法。该技术可评估抗真菌药物效果及基因突变株，为开发新型抗真菌疗法提供高通量筛选平台。

生物膜形成的可视化白色念珠菌使用自动化微流控装置

探索更多视频

生物膜形成的可视化 白色念珠菌 使用自动化微流控装置

探索更多视频

生物膜形成的可视化白色念珠菌使用自动化微流控装置