转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

本实验设计的总体目标是阐明 RNA 和 DNA 调控的主要层次，以揭示响应刺激或处理时发生的核心分子机制。该方法有助于回答多个不同生物学领域的关键问题，例如免疫应答以及药物处理的分子响应。该技术的主要优势在于能够随时间同步展示多层基因调控过程。

因此，对每种方法使用同一细胞池非常重要。总体而言，这三个实验方案首先需要将目标细胞在不同时间点进行处理。每次处理后，将细胞混合并均分为三组，分别用于每项检测。

本视频部分描述了使用 4sU 标记对最新产生的转录本进行标记和纯化的过程。每个实验方案最终都将制备出适用于测序的样品。首先，查阅目标细胞系所需的 4sU 浓度及孵育时间。

例如，在T细胞中使用200 µM的4sU处理一小时。处理后将细胞池分装至不同的培养皿中，每个培养皿对应一种方法和一个时间点。随后，将所需数量的4sU分装样品完全解冻，直接加入细胞培养基中，并按照要求孵育细胞。

接下来，将标记了4sU的细胞收集到聚丙烯管中。然后离心细胞。将沉淀以每毫升约三百万细胞的密度重悬于TRIzol中，并在室温下孵育5分钟。

现在使用Radle及其同事的方法制备30至80微克或更多的RNA。接下来，按以下顺序混合硫醇特异性生物素化反应：首先加入无核酸酶水，然后是10倍缓冲液，接着是RNA，最后加入生物素-HPDP。

然后，用移液器混匀并进行孵育。接着进行纯化步骤，以获得新转录的生物素标记RNA与未标记的预先存在的RNA的混合样本。接下来，将样本在65摄氏度下加热10分钟。

然后立即将样品置于冰上。待每个样品冷却后，加入100微升链霉亲和素磁珠，并在室温下旋转孵育15分钟。接着，使用磁力架分离结合有新转录RNA的磁珠，再用11微升无核酸酶的水洗脱RNA用于测序。

本部分介绍如何分离正在被翻译的 RNA。对这些转录本进行测序可分析动态的翻译组。结合 RNA 测序数据，该实验可实现 RNA 降解速率和翻译速率的计算。

首先将环己酰亚胺加入悬浮液中，通过倒置混匀。室温孵育1分钟后，离心细胞，弃去培养基，并用至少10毫升含环己酰亚胺的PBS洗涤细胞。接着吸除液体，每1000万细胞加入100微升哺乳动物细胞裂解缓冲液。

使用20至25号针头反复吹打混合物以裂解细胞。然后将细胞裂解液转移至预冷的1.50毫升离心管中，冰上孵育10分钟，期间定期轻柔颠倒混匀。10分钟后，离心裂解液，并将上清液转移至预冷的1.5毫升离心管中。

接下来，用无核酸酶的水将裂解液稀释至1到10倍，并在260纳米处测定吸光度。然后，将未稀释的裂解液分装成每份200微升，并根据每单位吸光度加入7.5单位的核酸酶进行处理。让核酸酶反应45分钟，随后加入15微升RNase抑制剂终止反应，或于-80摄氏度保存。

然后，使用商业试剂盒纯化RPF RNA，并使用试剂盒进行rRNA去除。接下来，对500纳克分离得到的RPF RNA进行PAGE纯化。在准备上样样品时，将样品及对照在95摄氏度下孵育5分钟以使其变性。

然后，在约75分钟内以180伏电压电泳运行样品，并评估结果。对于凝胶切片的收集，使用无菌的20号针头在0.5毫升离心管底部戳出小孔。接着，切取对应于28至30个碱基核苷酸区域的凝胶片段，并将其转移至已准备好的0.5毫升离心管中。

加入一份RNA对照样品和一份阴性对照样品以检测是否存在污染。接着，将小型带盖样本管放入较大的微量离心管中。然后，离心该组合装置以破碎凝胶，并将样本转移至1.5毫升离心管中。

接下来，向样品管中加入水、乙酸铵和SDS，在4°C条件下过夜反应以洗脱RNA。然后，使用商业试剂盒从小RNA构建cDNA文库，并对cDNA文库进行测序。ChIP-seq用于在整个基因组范围内定位目标转录因子的结合位点。

结合核糖体谱型分析数据及所有新转录本的检测结果，ChIP-seq 可揭示转录因子结合的实际效应。首先，使用甲醛对细胞样本进行交联，使其终浓度达到 1%。室温下轻柔振荡反应 10 分钟后，将甘氨酸浓度提高至 0.125 摩尔以终止反应。随后收集细胞，并用预冷的 PBS 洗涤三次，将细胞沉淀在 -80 摄氏度下冷冻保存。

随后，将细胞沉淀重悬于1毫升冰上预冷的细胞裂解缓冲液中，缓冲液需新鲜添加蛋白酶抑制剂，并将细胞在冰上孵育10分钟。10分钟后，离心收集细胞，吸除上清液，并重复加入裂解缓冲液及孵育步骤。接下来，使用超声处理将染色质剪切至200至1,000个碱基对之间。

然后，将染色质与抗体包被的磁珠偶联，并在50 µL洗脱缓冲液中洗脱蛋白-DNA复合物。接着，向样品中加入5 µL 40% RNase和洗脱缓冲液，孵育30分钟。随后，向样品中加入1单位蛋白酶K和20 µg糖原，孵育2小时。

接下来，将样品置于65摄氏度过夜，以逆转交联。第二天，将样品置于磁力架上至少30秒，然后收集含有目标DNA的上清液。随后，纯化DNA，使用定量PCR进行验证，并对DNA进行测序。

4sU标记可能会对细胞造成应激并导致细胞凋亡。通过Annexin V和7-AAD染色可鉴定凋亡和死亡细胞。在使用30分钟或60分钟处理对Th1细胞进行4sU标记后，细胞未发生死亡或凋亡。

在进行测序之前，始终使用标准检测方法检查RNA的完整性，因为这在处理RNA时至关重要。扩增后的文库具有健康的核苷酸片段范围。若存在过多的接头二聚体，则需通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进一步纯化。

模板过多或循环次数过多会导致核苷酸过载、产物弥散以及接头二聚体产物。染色质剪切的最佳效果出现在剪切后染色质的主要片段长度约为 1,000 个碱基对或略小于此值时。采用定量 PCR 检测抗体是否适用于染色质免疫沉淀测序。阴性对照引物针对的是目标细胞中不表达的基因。

在进行该实验操作时，重要的是要制定详细的实验设计方案，包括添加4sU以及针对每种方法收获细胞的具体时间安排。务必提前通过检测4sU对细胞活力和应激反应的影响，来验证最佳的4sU标记条件。总之，该方法使我们能够可视化细胞激活过程中可能发生的全部基因调控事件。

该方法也可用于原代免疫细胞及其对刺激物或药物的反应。