Name: 转录因子结合、转录、翻译和营业额的实时分析在细胞激活过程中显示全球事件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 了解转录因子结合、转录、翻译和RNA周转的实时分析方法，使用ChIP-seq、4sU-seq和核糖体分析技术。该方法可同时追踪细胞激活过程中多层基因调控的动态变化，为免疫反应和药物分子机制研究提供全面视角。

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我们感谢Lars Dölken在建立原代T细胞4sU标记方面的建议；感谢Elisabeth Graf和Thomas Schwarzmayr在文库构建和测序过程中提供的关键帮助；感谢Dirk Eick和Andrew Flatley提供RNAPII和T细胞抗体；感谢N. Henriette Uhlenhaut和Franziska Greulich在ChIP-seq文库制备方面的帮助；Caroline C. Friedel的研究得到了德国研究基金会（DFG）项目FR2938/7-1和CRC 1123（Z2）的资助；Elke Glasmacher的研究得到了德国研究基金会（DFG）项目GL 870/1-1以及德国糖尿病研究中心（DZD）、慕尼黑亥姆霍兹中心的资助。

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<li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+advances%2C+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li>
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<li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li>
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<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li>
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<li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription%2C+Splicing%2C+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li>
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<li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302(2013).</li>
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<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis%2C+processing+and+decay+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
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<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
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<li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li>
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<li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533(2016).</li>
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<li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li>
<li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

要充分理解细胞在特定刺激或处理下的适应过程，必须分析基因调控的整个过程。在不同时间点结合使用总RNA测序（total RNA-seq）、4-硫尿苷测序（4sU-seq）、核糖体谱分析（ribosome profiling）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），可实现对基因调控主要过程随时间变化的全面分析。为设计实验方案并确定最佳时间点，需要对生物学过程有深入的理解。
由于研究基因调控的方法正在迅速发展，这些实验方案可适应快速的变化。然而，它们仍是研究各类细胞中基本基因调控机制的最重要方法。本文将讨论使用这些方法时需要注意的一些潜在问题和关键事项。
细胞：细胞必须具有高活性，若使用原代分离细胞，则需保证细胞群体的纯度（例如，通过FACS分析检测原代T细胞）。即使是轻微应激的细胞也可能影响这些高度敏感的测序方法的结果，降低新转录或新翻译RNA的产量，并在测序结果中产生非预期的应激反应信号。本方案中提及的用于沉淀细胞的离心速度已针对原代T细胞进行优化，因此请根据具体细胞类型调整离心速度。
4sU 对细胞生理学的影响： 除了上述用于验证添加 4sU 后对细胞生理学影响最小化的选项外，还可以进行进一步和/或额外的分析，尤其是在细胞数量有限的情况下。可通过简单计数标记和未标记的细胞来验证细胞倍增时间，以检测对细胞增殖的影响。也可通过核仁素和细胞核的免疫荧光染色分析细胞形态，检测是否诱导了核仁应激。为进一步验证 4sU 的影响，可通过将标记的总 RNA 与未标记的总 RNA 的测序读数进行比对，测量全局基因表达的改变情况。
细胞数量： 对于 体外 生成的T细胞，我们建议至少从上述指出的细胞数量开始 Table 2根据细胞类型选择每种方法所需的适当细胞数量。由于T细胞的细胞质和RNA含量较其他细胞少，因此其他细胞所需数量可能更少。对于ChIP-seq，细胞数量很大程度上取决于所用抗体以及目标蛋白在细胞中的表达水平。对于组蛋白或RNA聚合酶II（RNAPII）的ChIP，可使用较少细胞，而当检测转录因子时，尤其是低表达水平的转录因子，需增加细胞数量。
4sU标记与RNA生物素化： 使用贴壁细胞时，4sU标记可按照Rädle et al.19&#160;所述方法进行。由于细胞对4sU的摄取非常迅速，因此可直接将其加入悬浮细胞、贴壁细胞或半贴壁细胞的培养基中。
建议使用 60 - 80 µg RNA 开始生物素标记。然而，也可使用更少的 RNA 量，尽管我们未测试低于 30 µg 的情况。在沉淀 RNA 时，若沉淀物难以观察，可加入共沉淀剂（例如，GlycoBlue）。Duffy et al. 还表明，甲基硫代磺酸盐活化的生物素（MTS-biotin）与 4sU 标记的 RNA 反应效率高于 HPDP-biotin31。因此，可考虑改用 MTS-biotin，特别是对于尿苷残基较少的小 RNA 回收而言（参见 Duffy et al. 提及的生物素标记方案；见“4sU 标记 RNA 的纯化”，实验步骤）。
为了回收新转录的RNA，可以使用磁性磁珠或自行选择的RNA纯化磁珠。务必注意，这些试剂盒可能针对特定RNA进行纯化，也可能不进行纯化。例如，如果您关注的是miRNA，请考虑使用专门用于miRNA捕获和测序的试剂盒。
新转录RNA的定量：为了准确量化新转录的RNA，应使用合适的荧光计进行测量（参见材料表）。在4sU标记1小时内，新转录的RNA约占总RNA的1 - 4%。标记1小时的活化T细胞中新转录的RNA中，约有90 - 94%为rRNA11。
核糖体谱分析：在建立该方法时，我们发现使用比原始方案建议量高1.5倍的核酸酶可确保充分消化。目前尚未有关于增加核酸酶用量产生不良影响的报道。由于核糖体保护片段（RPFs）在被核糖体蛋白结合时很难发生过度消化，因此可略微增加核酸酶用量，以滴定出最佳的消化效果。
如果在步骤 4.4.2 中回收的 RPF RNA 少于 500 ng，则重复核糖体 RNA 耗竭步骤，并使用 RNA Clean &amp;#38; Concentrator-5 柱合并纯化的 RPF。或者，在凝胶上（步骤 4.5.3）并排加载两个相同的样品，并在从凝胶中洗脱 RNA 时（步骤 4.5.6）合并凝胶切片。
我们建议在凝胶上尽可能紧贴28和30 nt条带切取RPFs。这有助于去除来自rRNA和tRNA的不需要的片段，避免这些片段进入文库并降低RPFs的测序读长数。
在凝胶纯化过程中，还建议避免紫外线照射。紫外线可能导致RNA片段产生切口以及嘧啶二聚体，最终严重影响文库构建和测序结果。
文库制备与数据测序： 核糖体谱分析（ribosome profiling）方案可用于构建适用于测序的 cDNA 文库。通过 4sU 标记生成的样品可直接用于文库制备，并可配合任何合适的 RNA 测序试剂盒使用。由于新转录的 RNA（尤其是在使用短时间标记时）可能尚未发生多聚腺苷酸化，因此不应进行多聚(A)选择。相反，我们强烈建议进行核糖体 RNA（rRNA）耗竭，以避免降低实际样品的测序深度。在使用 T 细胞时，我们起始使用 400 ng 新转录 RNA 和总 RNA（具体用量取决于所用试剂盒，参见材料部分），进行 rRNA 耗竭处理，并减少 PCR 扩增循环次数，以最小化 PCR 偏倚。文库制备可使用更少的起始材料，但需根据文库复杂性优化 PCR 循环数。
对于 ChIP-seq，市面上也有多种文库构建试剂盒可供选择。在我们的实验中，从 2 ng ChIP DNA 起始进行文库构建效果良好（参见材料部分关于试剂盒选择的建议）。测序时务必检查索引的颜色平衡。我们建议 4sU-seq、总 RNA-seq 和 ChIP-seq 样本的测序深度均达到 ≥40 × 106 条读长，核糖体谱分析样本则建议 ≥80 × 106 条读长。测序深度取决于样本类型及后续的生物信息学分析，应谨慎评估。若需分析内含子区域的读长以研究共转录剪接，应选择 100 bp 双端测序。
测序偏差：测序已成为确定转录、翻译或转录因子结合全局变化的金标准。近年来，现有方法已被推向极限，或开发出新技术以对起始量极低的RNA进行测序。这需要对cDNA进行扩增，从而引入噪声或偏差。最近开发了唯一分子标识符（UMIs），用于实验性识别由PCR引入的重复序列。最近研究表明，UMIs仅能轻微提升差异基因表达分析的测序效能和降低假阳性发现率32。尽管如此，建议在构建所有测序文库时使用唯一分子标识符（UMIs）以控制文库复杂性，尤其是在起始RNA量较低且需要较多PCR循环次数的情况下。
缓冲液与贮存液：用于 4sU-seq 和核糖体谱分析的所有缓冲液必须在严格无 RNase 的条件下配制，并使用无核酸酶的水。建议购买预先制备好的无核酸酶 NaCl、Tris-HCl、EDTA、柠檬酸钠和水。为确保无核酸酶环境，可使用 RNase 去污染溶液清洁移液器或实验台面。ChIP-seq 所用的所有缓冲液至少应为无 DNase 的，可在室温下保存。使用前应立即加入蛋白酶抑制剂，以及可选的磷酸酶抑制剂，并置于冰上保存。
生物信息学：所有测序数据（即，ChIP-seq、RNA-seq 和核糖体谱分析）的分析包括质量控制（例如，使用 FastQC，http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）、接头序列修剪（例如，使用 cutadapt20），随后将序列比对至所研究细胞的参考基因组。对于 RNA-seq 数据（包括总 RNA-seq 和 4sU-seq）以及核糖体谱分析数据，需使用可处理剪接的 RNA-seq 比对工具，例如 ContextMap 221。对于 ChIP-seq 数据的非剪接比对，使用 BWA-MEM22 即可。在使用程序（例如 featureCounts23）确定每个基因的读段数后，可采用 RPKM 模型（每百万比对片段中每千碱基外显子的读段数）1 计算基因表达量。从 ChIP-seq 数据中进行峰识别时，可选用多种程序，例如 MACS24 或 GEM25。进一步的下游分析可在 R26 中进行，特别是利用 Bioconductor 项目提供的工具27。
这里，整合4sU标记的RNA水平、总RNA水平以及核糖体谱分析所获得的翻译活性数据时，主要挑战在于标准化。解决该问题的经典方法是使用看家基因的表达水平进行标准化。为降低个别看家基因因随机波动带来的噪声，建议不单独使用少数几个看家基因，而是采用一组较大量看家基因的中位表达水平进行标准化。 例如 的 &#62;Eisenberg 和 Levanon 汇编的 3,000 个持家基因28. 通过4sU-RNA与总RNA比值计算RNA降解速率时，标准化基于中位数降解速率进行（例如（假设RNA半衰期为5小时）29然而，由于该假设基于管家基因无整体变化的前提，我们建议采用不依赖标准化的分析方法。 例如基于相关性的聚类分析不同数据类型的时间序列，以鉴定在细胞激活过程中转录和翻译行为 distinct 的基因群组。关于不同数据类型生物信息学整合的详细描述，我们参考原始发表文献。11.
降解速率分析与数据整合： 一篇近期发表的论文33比较了通过多重基因控制（MGC）方法与全局性方法测定的半衰期，结果表明，与其他方法（例如，使用药物普遍抑制转录）相比，MGC测得的半衰期与代谢标记方法获得的结果相关性最佳。然而，应当指出，不同半衰期计算方法之间可能存在差异，且已有相关报道15,34。我们已尽可能排除了因长时间4sU暴露所引发的应激反应带来的多数问题和差异。因此，排除4sU标记所引入的应激反应至关重要。为进一步验证降解速率，我们推荐使用MGC方法。
此外，此处生成的数据集也可用于更综合的数据分析（例如，长链非编码RNA的调控）35,36。

近年来，RNA测序（RNA-seq）已成为分析细胞或生物体内所有表达RNA的标准工具1然而，要全面理解细胞在特定刺激或药物作用下适应的整个过程，必须完整确定从mRNA转录到加工、降解及翻译等所有潜在的分子事件。由于总RNA水平的变化受到多种因素影响，总RNA测序难以准确检测RNA转录的短期变化。 例如 RNA半衰期与转录活性，其作为反映细胞对环境影响适应性的模板具有局限性2,3事实上，已开发出多种新的测序技术，可实现对基因调控过程中各个步骤的分析。4&#160;当以正确方式组合时，本方案描述了如何结合一些较易实施的测序技术，以比较的方式追踪 mRNA 关键调控层次的变化。为分析转录活性，已有多种方法被提出，例如基因表达的帽子分析（Cap-analysis of gene expression, CAGE）5，原位延伸转录本测序（native elongation transcript sequencing, NET-seq）6，以及全基因组核内转录运行分析（GRO-seq）7,8，以及溴尿苷测序（Bru-seq）和4-硫尿苷测序（4sU-seq），这些方法利用可掺入新转录RNA中的代谢物9,10，仅举几例而言。尽管CAGE能够鉴定精确的转录起始位点，NET-seq和GRO-seq可提供关于转录方向的更准确信息，而4sU-seq（即本文所描述的方法）仅检测新转录的RNA。然而，4sU-seq具有高度敏感性，可在不同时间窗口中应用，以在快速变化的细胞中定量测量转录活性，以及在数分钟内发生的mRNA加工过程的定量变化9,11,12此外，4sU-seq 与 RNA-seq 联用可理想地用于计算基因的 RNA 降解速率9mRNA的转录由RNA聚合酶II（RNAPII）执行，而RNAPII又受到多种因素的影响，例如转录因子、组蛋白修饰以及通用激活因子/抑制因子，这些因子甚至可能成为转录复合物的一部分。为了检测某一因子结合在多少基因/启动子/增强子区域，已开发出染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术，由于存在大量商业化的抗体，该技术现已成为此目的的标准方法13然而，尽管 ChIP-seq 能够明确提供调控因子结合位置的信息，却无法反映其结合是否确实导致了转录水平的变化14因此，将 ChIP-seq 与 4sU-seq 联合使用是回答此类生物学问题的理想组合。基因表达的调控也可能发生在后续阶段，因为 mRNA 水平与蛋白质水平并不一定相关15,16，表明在翻译或翻译后水平上可能存在显著调控，具体取决于上下文。2011年，核糖体谱分析首次与RNA测序相结合，现已成为量化蛋白质快速变化的首选方法，因为质谱技术仍存在一定的灵敏度限制。17确实，通过这些方法获得的翻译速率已被证明能够相对较好地估计蛋白质水平的变化（至少在长期变化的测量中），并能对翻译过程提供更为详细的观察。 例如 起始端和可变翻译阅读框的确定17四种方法的联合使用可用于稳态条件、不同细胞类型之间，或对快速变化的细胞进行时间序列实验11该应用可提供转录因子结合变化对RNA转录、加工及翻译影响的全基因组范围概览。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;4sU标记&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-硫代尿苷（100 mg）</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>在无菌 H2O/PBS 中配制 50 mM 储存液；储存于 &amp;ndash;20&amp;deg;C，分装为 50–500 份 &amp;micro;l；切勿再次冷冻。</td></tr><tr><td>1.5 ml 安全锁扣管</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>可选</td></tr><tr><td>1.5 ml 螺口聚丙烯管</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>与二甲基甲酰胺兼容</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>与二甲基甲酰胺兼容</td></tr><tr><td>2.0 ml 螺口聚丙烯管</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>与二甲基甲酰胺兼容</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>与二甲基甲酰胺兼容</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>我们建议使用这些磁性微珠。分装后于4℃保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>警告 &amp;ndash; 危害健康</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>以无核酸酶的 H2O 配制 100 mM DTT 溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；务必现配现用</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>默克</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP（50 mg）</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>通过将 50 mg Biotin-HPDP 溶解于 50 ml DMF 中，配制 1 mg/ml 储存液。轻微加热可促进溶解。4 ℃ 保存&amp;deg;C 分装成每份 1 ml。DMF 可溶解某些塑料材料。我们建议使用玻璃移液管将 DMF 从其原装玻璃瓶转移至 50 ml Falcon 管中。</td></tr><tr><td>高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>默克</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>储存液</td></tr><tr><td>无核酸酶的EDTA（500 mM），pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>储备液</td></tr><tr><td>无核酸酶的 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>储存液</td></tr><tr><td>无核酸酶 Tris Cl (1 M)，pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>储存液</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 管（2.0 ml）</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>步骤1.3.4中使用</td></tr><tr><td>聚丙烯 15&amp;nbsp;毫升离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>或同等规格；需耐受高达 15,000 &amp;times; g</td></tr><tr><td>QIAzol 裂解试剂（200 ml）</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>使用此类或同等的TRI试剂进行RNA提取，警告 &amp;ndash; 腐蚀性且危害健康！确保立即可获取苯酚解毒剂（PEG-甲醇）</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>在步骤 1.4.11 中使用该试剂盒定量 RNA 量</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>可选；包含缓冲液 RLT</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>使用无核酸酶水配制 1.6 M 储存液</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Macs链霉亲和素试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>4°C 保存&amp;deg;C，包括 &amp;micro;步骤 1.4.6 中使用的 Macs 柱（室温保存）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞活力与应激检测&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V 凋亡检测试剂盒 I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>可选</td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>可选</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>可选</td></tr><tr><td>p-eIF2α (Ser51)</td><td>细胞信号传导</td><td>9721</td><td>可选</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>可选</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU 洗涤缓冲液</td><td></td><td>室温保存</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20，溶于无核酸酶的 H₂O 中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>生物素化缓冲液（10×）</td><td></td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA，溶于无核酸酶水中；分装为1 ml每管；4℃保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA 沉淀缓冲液</td><td></td><td>室温保存</td><td>1.2 M NaCl，0.8 M 柠檬酸钠溶于无核酸酶水中。需在无核酸酶条件下预先配制。置于 50 ml 离心管中，室温保存。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer 仪器</td><td>安捷伦</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano 试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>5067-1511</td><td>使用该试剂盒在步骤 1.3.10 中验证 RNA 完整性</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>可选</td></tr><tr><td>紫外/可见光分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NanoDrop 1000</td><td>或同等物。在步骤 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 中使用</td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>或能够达到13,000的同等设备&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td>高速转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管接头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷藏台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>或同等物</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>或同等物。</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>一个支架可容纳 8 个 &amp;micro;Macs 柱</td></tr><tr><td>超精细尺度</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>或同等物</td></tr><tr><td>E-Gel iBase 电源系统</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>用于RNA凝胶；或同等用途。</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% 琼脂糖预制凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>用于RNA凝胶；或同等用途。</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁铁-1 每个</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>可选</td></tr><tr><td>TruSeq 定向总RNA文库制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>或等效试剂。对于T细胞，我们使用400 ng 4sU和总RNA，PCR扩增循环数为11次。该试剂盒包含rRNA去除步骤。</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>使用 Nanodrop 或同等仪器测定 RNA 浓度</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;核糖体谱分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile 试剂盒（哺乳动物或酵母）</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116（酵母）</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile 试剂盒（哺乳动物或酵母）</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126（哺乳动物）</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪-25 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪-5 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA 去除试剂盒（人/小鼠/大鼠）</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 或 MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>（高灵敏度DNA试剂盒）</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-4626</td><td>4sU-seq 已需要</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;所有其他耗材和设备均列于用户指南中&lt;/strong&gt;</td><td>!!!</td><td></td><td>仔细阅读用户指南，并提前订购所需的耗材（请注意某些耗材如凝胶的交付时间较长）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;染色质免疫沉淀&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>普通实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % 甲醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28908</td><td>加入至终浓度为 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>普通实验室供应商</td><td></td><td>务必新鲜配制</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>通用实验耗材供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>我们建议使用这些磁性微珠。分装后于4℃保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ChIP文库制备试剂盒</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>或使用您选择的试剂盒</td></tr><tr><td>DNA低吸附微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>在步骤 4.3.1 中使用这些与蛋白 G 偶联的超顺磁性微珠；使用前恢复至室温</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>普通实验室供应商</td><td></td><td>配制2M的储存液</td></tr><tr><td>糖原</td><td>罗氏</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>在步骤 4.2.4 中使用该试剂盒（或同等产品）纯化染色质。</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂（PhosStop）</td><td>罗氏</td><td>4906837001</td><td>将新鲜的加入缓冲液中，并置于冰上保存</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂（cOmplete，无EDTA）</td><td>罗氏</td><td>11873580001</td><td>将新鲜的缓冲液加入并置于冰上保存</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>在步骤 4.6.4 中使用该试剂盒在 Qubit 荧光计上定量 DNA 数量</td></tr><tr><td>Rnase，无DNase</td><td>罗氏</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精子（超声处理至约100 bp）</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体（尽可能使用 ChIP 级别）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗RNA聚合酶II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>抗组蛋白 H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>或目标抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>结合/封闭缓冲液</td><td></td><td>室温保存</td><td>含 0.5% BSA 和 0.5% Tween 20 的 PBS</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液</td><td></td><td>室温保存</td><td>5 mM Pipes [pH 8.0]、85 mM KCl 和 0.5% NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP 缓冲液</td><td></td><td>室温保存</td><td>0.01% SDS；1.1% Triton X-100；1.2&amp;nbsp;毫摩尔 EDTA；16.7&amp;nbsp;mM Tris-HCl，pH 8.1；16.7&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>洗脱缓冲液</td><td></td><td>室温保存，最长6个月</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，5 mM EDTA (pH 8.0)，300 mM NaCl 和 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>细胞核裂解缓冲液</td><td></td><td>室温保存</td><td>50 mM Tris [pH 8.0]，10 mM EDTA 和 1% SDS</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液 I</td><td></td><td>室温保存</td><td>0.1 % SDS；1 % Triton X-100；2 mM EDTA；20 mM Tris-HCl pH 8.1；150 mM NaCl</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液 II</td><td></td><td>室温保存</td><td>0.1 % SDS；1 % Triton X-100；2&amp;nbsp;毫摩尔/升 EDTA；20&amp;nbsp;mM Tris-HCl pH 8.1；500&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液 III</td><td></td><td>室温保存</td><td>0.25&amp;nbsp;M LiCl；1% NP-40；1&amp;nbsp;毫摩尔 EDTA；10&amp;nbsp;mM Tris-HCl，pH 8.1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer 仪器</td><td>安捷伦</td><td>G2939BA</td><td>使用该仪器进行电泳分析</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX 微管 1.5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>或适用于您超声破碎仪的专用管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor 超声破碎仪或任意选择的超声破碎仪</td><td></td><td></td><td>使用Bioruptor对T细胞进行超声处理：20 - 25个循环（高功率下30秒开启，30秒关闭），分装于两支1.5 ml Bioruptor微管中，每管500 &amp;micro;每管</td></tr><tr><td>用于离心管的磁力架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>使用此荧光计对微量 RNA/DNA 进行定量</td></tr></tbody></table>

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

细胞在激活后会迅速改变其功能程序，从而改变基因表达谱。例如，在细胞分化、形态发生和功能刺激（如免疫细胞的激活）过程中，或在暴露于局部环境中的药物和其他因素后，基因表达会发生巨大变化。根据刺激类型和细胞类型的不同，这些变化可能迅速发生，并涉及基因调控的任何可能层面。揭示响应细胞对特定类型刺激/药物的所有分子过程，是分子生物学中最困难的任务之一。本文描述了一种能够同时分析多层基因调控的实验方案。我们特别比较了转录因子结合（染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq））、从头转录（4-硫尿苷测序（4sU-seq））、mRNA加工与降解以及翻译（核糖体谱分析）。通过结合这些方法，可以全面展示全基因组范围内的详细作用过程。
在分析快速适应或动态变化的系统时，尤其推荐对新转录的RNA进行测序，因为该方法能够反映在4sU暴露期间所有基因的转录活性（无论其表达上调或下调）。结合使用全RNA测序（total RNA-seq）与核糖体谱分析（ribosome profiling），还可用于计算RNA的周转率和翻译速率。对高通量测序结果进行生物信息学分析，可提供多种数据解析与解读手段。所获得的数据还能够追踪共转录及可变剪接等过程，此处仅列举部分可能的应用结果。
此处描述的联合方法可应用于不同的模式生物或细胞类型，包括原代细胞。此外，我们为所使用每种方法提供了详细的实验方案，包括质量控制步骤，并讨论了可能遇到的问题和注意事项。

4sU标记：验证最佳条件 4sU标记条件（凋亡、核应激、胞质应激）、时间及浓度： 高水平的4sU可抑制rRNA的生成与加工，并诱导细胞质及细胞核应激30因此，应检测目标细胞在4sU作用下是否产生应激反应以及是否发生凋亡。建议通过蛋白质印迹（Western blot）分析检测p53的累积，以反映核内应激；检测磷酸化EIF2a水平的升高，以显示胞质应激；并通过荧光激活细胞分选（FACS）分析检测细胞凋亡。可使用高浓度及长时间的4sU处理，或使用毒胡萝卜素（thapsigargin）、亚砷酸盐（arsenite）等药物诱导细胞应激。为诱导细胞凋亡或细胞死亡，细胞可用BH3I-1（500 ng/µL）或在5分钟内孵育 95 °C （热休克）。采用Annexin V/7-AAD染色法检测凋亡细胞（Annexin V）和死亡细胞（7-AAD）。标记 体外 生成初始 Th1 细胞 0.5 小时 500 µM 4sU（终浓度）或 1 小时 200 µM 4sU 既不诱导细胞应激迹象，也不诱导细胞凋亡（图1但可导致足够的4sU掺入。
RNA标记时间也可缩短（≤5 min），这将导致与较长标记时间相比，短寿命的内含子序列增加。为可视化共转录剪接速率，4sU标记时间不应超过30 min。有关4sU标记的更多细节，请参见Rädle 等.19
质量控制：在处理 RNA 时，RNA 的完整性至关重要。可在生物素化后通过电泳分析检测 4sU 标记 RNA 的质量（参见材料表）。建议对步骤 2.2.2 中分离得到的 RNA 进行验证，尤其是在将其用于总 RNA 测序时。RNA 完整性数值（RIN）应 ≥8，以确保 RNA 完整性满足后续实验要求（图 3）。
电泳分析也可用于验证新转录的RNA。需要注意的是，新转录的RNA所含成熟rRNA显著少于总RNA，其典型的rRNA条带也相应较弱。
核糖体谱分析：cDNA文库的PCR扩增： cDNA扩增（步骤4.9.1）是确保获得良好测序结果的关键步骤。通过电泳分析扩增后的文库。良好的扩增文库样本在140 - 160 bp处呈现一个主峰（图4A）。应避免出现过量的接头二聚体（图4B），此类样本需根据制造商说明书采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化程序进一步纯化（PCR产物的PAGE纯化）。过多的模板或过多的PCR循环次数可能导致过度扩增，表现为出现高于预期分子量的条带、弥散的PCR产物以及接头二聚体产物（图4C）。对于大多数样本，使用1 - 5 µL环化cDNA并进行9轮PCR扩增，通常即可获得足量的正确PCR产物。
ChIP：染色质剪切： 每种细胞类型的最优剪切条件均需进行调整。确定剪切条件（例如，循环次数，高功率或低功率）预先设定好。出于检测目的，应使用相同数量的细胞和相同体积，因为较低的细胞密度会提高剪切效率。应尽量避免染色质剪切过度或不足。过大的染色质片段可能因堵塞而显著影响ChIP结果，而剪切过度则可能破坏目标蛋白上的表位，导致抗体结合效率降低。在本实验中，当剪切后染色质的主要片段大小约为1,000 bp或略低时，获得了最佳结果（图 5A).
通过 qPCR 验证 ChIP：在开始 ChIP 实验之前，建议通过 ChIP-qPCR 检测所用抗体是否适用于 ChIP（如有可能，应使用经 ChIP 验证级别的抗体）。在开始文库构建之前，需通过 qPCR 验证用于测序的 ChIP 效果（参见步骤 5.6.5）。设计可结合目标蛋白已知结合位点的引物。如果目标蛋白在基因内的精确结合位点未知，可使用多对引物扫描该基因及其相关调控元件。对于 Th1 细胞中经刺激后转录上调的 Ifng 基因的 RNAPII ChIP，可使用 Ifng 和 actin 引物作为阳性对照。Sox9 和 insulin 可作为阴性对照，因为这些基因在 Th1 细胞中不表达（图 5B）。注意不要使用通常用于 mRNA qPCR 的跨外显子引物。也可使用 IgG 对照以验证所用抗体的特异性。免疫沉淀的 DNA 可使用合适的荧光计进行定量（参见材料表）。IgG 对照非特异性结合的 DNA 量应显著低于目标抗体结合的 DNA 量。
重复实验：生物学显著性的证明 强烈建议所有方法的动能实验均从同一细胞池开始进行，以确保所有未处理和已处理样本中的细胞具有相同的特性图2）。然而，建议为每种方法的主要时间点取少量等分试样，以便将样本与生物学重复进行比较（例如，通过qPCR、FACS分析）。这可粗略估计两个重复样本的处理是否具有可重复性，从而决定是否进行测序。重复样本的验证应通过生物信息学分析进行。结果的可重复性可通过重复样本间FPKM值的相关性进行评估，并使用散点图进行可视化图6).
<img alt="细胞凋亡和蛋白质表达研究中的流式细胞术结果和蛋白质印迹分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：在不干扰细胞生理状态的前提下验证最佳 4sU 标记条件（引自 Davari et al.11） 
(A) 通过 FACS 分析检测细胞凋亡：体外 生成的 Th0 细胞分别用不同浓度的 4sU（括号中所示）处理 0.5 h、1 h 和 2 h。采用 BH3I-1 处理以 Annexin V 检测诱导的凋亡，热激处理（95 °C 下 5 min）用于诱导细胞死亡，并通过 7-AAD 检测。(B) 经 4sU 处理并活化的 T 细胞中 p53 的蛋白质印迹分析：除 0.5 h 时间点使用 500 µM 4sU 标记外，其余样品均使用 200 µM 4sU 标记，并在指定的活化时间进行标记。(C) 在活化的 Th1 细胞中，采用与 (B) 相同的标记条件对磷酸化-EIF2a 和总 EIF2a 进行蛋白质印迹分析。Thapsigargin 作为阳性对照。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="经细胞处理后结合测序方法的示意图：4sU-seq、核糖体谱分析、ChIP-seq 的时间点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于追踪全基因组动态变化的动力学实验设计示意图 
该示意图展示了将 4sU-seq、总 RNA-seq、核糖体谱分析（Ribosome Profiling）和 ChIP-seq 相结合，以研究细胞处理后全基因组变化的实验设计。收集细胞并预留所需数量的细胞作为未处理对照组。对剩余细胞进行处理，并根据每种方法和时间点进行分样。按照描述，使用 4sU 对未处理/处理的细胞进行标记以用于 4sU-seq。各方法对应的时间点和样本数量取决于所研究的具体生物学问题。针对每个时间点和每种方法采集样本，并依照本实验方案中对应的部分进行操作。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="RNA电泳凝胶示意图；总RNA、生物素标记、28S、18S rRNA条带分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：4sU标记RNA的质量控制 
对活化的Th1细胞提取的总RNA和生物素化RNA使用Bioanalyzer进行分析。图中显示了18S rRNA和28S rRNA条带，仪器给出RNA完整性数值（RIN）以评估RNA完整性。为确保RNA完整性，RIN应≥8。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电泳图谱比较；DNA分析；优质样本、接头二聚体、过量扩增样本；bp与FU对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：核糖体分析文库的Bioanalyzer检测图谱 
(A) 优质文库：样本在预期大小范围（140 - 160 bp）处出现明显峰，无需进一步纯化。(B) 该样本中接头二聚体扩增产物（120 bp）相对于目标产物（140 - 160 bp）过多，此文库需进一步纯化。(C) 过量扩增样本：可见高于预期的分子量峰及弥散的PCR扩增子（箭头所示）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="琼脂糖凝胶电泳图与柱状图；DNA激活实验，蛋白质表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：染色质剪切后的最佳片段大小及通过qPCR验证的ChIP结果 
(A) 琼脂糖凝胶图像显示了三个样品经超声波剪切25个循环后所得染色质的最优片段大小，染色质提取与纯化步骤如本实验方案前文所述。(B) 总RNA聚合酶II（RNAPII）ChIP（抗RNA聚合酶II抗体，8WG16，ab817）的qPCR结果以输入DNA百分比表示。Ifng 和 actin 引物作为阳性对照，而 Sox9 与 Insulin 为阴性对照（这两个基因在活化的Th1细胞中不表达）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示RNA相关性分析的散点图，FPKM值，cor=0.94，线性趋势线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：生物学重复样本的比较（来自Davari et al. 11 的图） 
该代表性散点图比较了刺激活化的Th1细胞4小时后新转录RNA（4sU）的重复样本之间的表达值（FPKM）。绿色线表示相等的FPKM值，每个图中均标示出秩相关系数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标记持续时间（分钟）</td>
			<td>推荐的 4sU 浓度（µM）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：推荐的4sU浓度（来自Rädle， 等.19) 
不同标记时间下推荐的4sU浓度范围如图所示。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>方法</td>
			<td>细胞数量</td>
			<td>RNA 量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4sU 标记</td>
			<td>≥2 x 107</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>核糖体谱分析</td>
			<td>≥2 x107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥2 x 107 - 3 x 107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：所需原代T细胞的数量 
每种方法所需的原代T细胞最低数量。若使用其他细胞类型，所需数量可能更少。

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total RNA-seq）和核糖体谱分析在细胞系和原代细胞中的联合应用。该方法能够追踪转录因子结合、从头转录、RNA加工、降解及翻译随时间发生的变化，并展示活化细胞和/或快速变化细胞中整体事件的动态过程。

细胞激活后会迅速改变其功能程序，从而改变基因表达谱。在细胞分化、形态发生、功能刺激（如免疫细胞激活）或暴露于药物及局部环境其他因素后，基因表达会发生巨大变化。根据刺激类型和细胞种类的不同，这些变化可迅速发生在基因调控的任何可能层面。展示细胞对特定刺激或药物响应时所涉及的全部分子过程，是分子生物学中最艰巨的任务之一。本文介绍了一种可同时分析多层级基因调控的实验方案。我们特别比较了转录因子结合（染色质免疫沉淀测序，ChIP-seq）、从头转录（4-硫代尿苷测序，4sU-seq）、mRNA 加工与降解以及翻译过程（核糖体谱分析）。通过整合这些方法，可以全面、全基因组地描绘基因调控的动态过程。在分析快速适应或变化的系统时，尤其推荐对新转录的RNA进行测序，因为该方法能够反映在4sU标记期间所有基因的转录活性（无论其表达上调或下调）。结合总RNA测序与核糖体谱分析，还可进一步计算RNA的降解速率和翻译效率。对高通量测序结果进行生物信息学分析，可实现多种数据解析与解读方式。所获得的数据还可用于追踪共转录事件及可变剪接等过程。本文所述的整合策略可应用于多种模式生物或细胞类型，包括原代细胞。此外，我们还提供了每种方法的详细实验流程，包括质量控制步骤，并讨论了潜在的问题与注意事项。

本实验设计的总体目标是阐明 RNA 和 DNA 调控的主要层次，以揭示响应刺激或处理时发生的核心分子机制。该方法有助于回答多个不同生物学领域的关键问题，例如免疫应答以及药物处理的分子响应。该技术的主要优势在于能够随时间同步展示多层基因调控过程。因此，对每种方法使用同一细胞池非常重要。总体而言，这三个实验方案首先需要将目标细胞在不同时间点进行处理。每次处理后，将细胞混合并均分为三组，分别用于每项检测。本视频部分描述了使用 4sU 标记对最新产生的转录本进行标记和纯化的过程。每个实验方案最终都将制备出适用于测序的样品。首先，查阅目标细胞系所需的 4sU 浓度及孵育时间。例如，在T细胞中使用200 µM的4sU处理一小时。处理后将细胞池分装至不同的培养皿中，每个培养皿对应一种方法和一个时间点。随后，将所需数量的4sU分装样品完全解冻，直接加入细胞培养基中，并按照要求孵育细胞。接下来，将标记了4sU的细胞收集到聚丙烯管中。然后离心细胞。将沉淀以每毫升约三百万细胞的密度重悬于TRIzol中，并在室温下孵育5分钟。现在使用Radle及其同事的方法制备30至80微克或更多的RNA。接下来，按以下顺序混合硫醇特异性生物素化反应：首先加入无核酸酶水，然后是10倍缓冲液，接着是RNA，最后加入生物素-HPDP。然后，用移液器混匀并进行孵育。接着进行纯化步骤，以获得新转录的生物素标记RNA与未标记的预先存在的RNA的混合样本。接下来，将样本在65摄氏度下加热10分钟。然后立即将样品置于冰上。待每个样品冷却后，加入100微升链霉亲和素磁珠，并在室温下旋转孵育15分钟。接着，使用磁力架分离结合有新转录RNA的磁珠，再用11微升无核酸酶的水洗脱RNA用于测序。本部分介绍如何分离正在被翻译的 RNA。对这些转录本进行测序可分析动态的翻译组。结合 RNA 测序数据，该实验可实现 RNA 降解速率和翻译速率的计算。首先将环己酰亚胺加入悬浮液中，通过倒置混匀。室温孵育1分钟后，离心细胞，弃去培养基，并用至少10毫升含环己酰亚胺的PBS洗涤细胞。接着吸除液体，每1000万细胞加入100微升哺乳动物细胞裂解缓冲液。使用20至25号针头反复吹打混合物以裂解细胞。然后将细胞裂解液转移至预冷的1.50毫升离心管中，冰上孵育10分钟，期间定期轻柔颠倒混匀。10分钟后，离心裂解液，并将上清液转移至预冷的1.5毫升离心管中。接下来，用无核酸酶的水将裂解液稀释至1到10倍，并在260纳米处测定吸光度。然后，将未稀释的裂解液分装成每份200微升，并根据每单位吸光度加入7.5单位的核酸酶进行处理。让核酸酶反应45分钟，随后加入15微升RNase抑制剂终止反应，或于-80摄氏度保存。然后，使用商业试剂盒纯化RPF RNA，并使用试剂盒进行rRNA去除。接下来，对500纳克分离得到的RPF RNA进行PAGE纯化。在准备上样样品时，将样品及对照在95摄氏度下孵育5分钟以使其变性。然后，在约75分钟内以180伏电压电泳运行样品，并评估结果。对于凝胶切片的收集，使用无菌的20号针头在0.5毫升离心管底部戳出小孔。接着，切取对应于28至30个碱基核苷酸区域的凝胶片段，并将其转移至已准备好的0.5毫升离心管中。加入一份RNA对照样品和一份阴性对照样品以检测是否存在污染。接着，将小型带盖样本管放入较大的微量离心管中。然后，离心该组合装置以破碎凝胶，并将样本转移至1.5毫升离心管中。接下来，向样品管中加入水、乙酸铵和SDS，在4°C条件下过夜反应以洗脱RNA。然后，使用商业试剂盒从小RNA构建cDNA文库，并对cDNA文库进行测序。ChIP-seq用于在整个基因组范围内定位目标转录因子的结合位点。结合核糖体谱型分析数据及所有新转录本的检测结果，ChIP-seq 可揭示转录因子结合的实际效应。首先，使用甲醛对细胞样本进行交联，使其终浓度达到 1%。室温下轻柔振荡反应 10 分钟后，将甘氨酸浓度提高至 0.125 摩尔以终止反应。随后收集细胞，并用预冷的 PBS 洗涤三次，将细胞沉淀在 -80 摄氏度下冷冻保存。随后，将细胞沉淀重悬于1毫升冰上预冷的细胞裂解缓冲液中，缓冲液需新鲜添加蛋白酶抑制剂，并将细胞在冰上孵育10分钟。10分钟后，离心收集细胞，吸除上清液，并重复加入裂解缓冲液及孵育步骤。接下来，使用超声处理将染色质剪切至200至1,000个碱基对之间。然后，将染色质与抗体包被的磁珠偶联，并在50 µL洗脱缓冲液中洗脱蛋白-DNA复合物。接着，向样品中加入5 µL 40% RNase和洗脱缓冲液，孵育30分钟。随后，向样品中加入1单位蛋白酶K和20 µg糖原，孵育2小时。接下来，将样品置于65摄氏度过夜，以逆转交联。第二天，将样品置于磁力架上至少30秒，然后收集含有目标DNA的上清液。随后，纯化DNA，使用定量PCR进行验证，并对DNA进行测序。4sU标记可能会对细胞造成应激并导致细胞凋亡。通过Annexin V和7-AAD染色可鉴定凋亡和死亡细胞。在使用30分钟或60分钟处理对Th1细胞进行4sU标记后，细胞未发生死亡或凋亡。在进行测序之前，始终使用标准检测方法检查RNA的完整性，因为这在处理RNA时至关重要。扩增后的文库具有健康的核苷酸片段范围。若存在过多的接头二聚体，则需通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进一步纯化。模板过多或循环次数过多会导致核苷酸过载、产物弥散以及接头二聚体产物。染色质剪切的最佳效果出现在剪切后染色质的主要片段长度约为 1,000 个碱基对或略小于此值时。采用定量 PCR 检测抗体是否适用于染色质免疫沉淀测序。阴性对照引物针对的是目标细胞中不表达的基因。在进行该实验操作时，重要的是要制定详细的实验设计方案，包括添加4sU以及针对每种方法收获细胞的具体时间安排。务必提前通过检测4sU对细胞活力和应激反应的影响，来验证最佳的4sU标记条件。总之，该方法使我们能够可视化细胞激活过程中可能发生的全部基因调控事件。该方法也可用于原代免疫细胞及其对刺激物或药物的反应。

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科研

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Genetics

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