肺组织中循环肿瘤细胞可视化肺定植检测方法的建立

该方法有助于解答癌症转移领域中的关键问题，即肺部定植在实现癌症转移过程中的作用。该技术的主要优势在于，能够在癌症转移过程中对肺部早期外渗的癌细胞进行可视化观察。本次实验操作将由我实验室的博士研究生 Cheng-Han Yang 进行演示。

当肿瘤细胞培养达到70%至80%融合度时，用两毫升无菌PBS洗涤培养物两次，每次洗涤后弃去PBS，并向培养皿中加入一毫升0.5%胰蛋白酶-EDTA。立即吸除800微升上清液，将培养皿置于37摄氏度环境中30至60秒，直至大部分细胞从培养皿表面脱落。加入一毫升含10%FBS的新鲜培养基以终止消化反应，并使用1000微升移液器剧烈吹打细胞悬液，使其充分混匀。

将获得的单细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中，通过离心收集细胞。然后将肿瘤细胞沉淀重悬于1.5毫升含20%胎牛血清（FBS）的培养基中，在37摄氏度下翻转孵育2小时。孵育结束后，用台盼蓝染色排除法计数活细胞，并通过离心收集细胞。

将沉淀物重悬于1毫升无菌PBS中，进行第二次离心，然后将沉淀物重悬于500微升含有10% FBS和20微升CFSE的PBS中。在37摄氏度避光条件下孵育10分钟后，离心细胞，并将沉淀物重悬于4毫升含有1% FBS的培养基中，再进行一次离心。最后一次洗涤后，将细胞重悬于不含FBS的新鲜培养基中，浓度为每毫升5×10⁶个肿瘤细胞，并将细胞置于冰上。

接下来，将一只4至6周龄的雄性C57BL/6小鼠的尾巴加热5至10分钟，以扩张尾静脉，并使用配备26½号针头的1毫升注射器充分混匀细胞，直至获得单细胞悬液。小心地将200 µL细胞悬液吸入注射器中，将小鼠放入固定器内，然后将全部细胞悬液注入扩张的尾静脉管腔中。

在适当的注射后时间点，从腹部到胸部做一纵向皮肤及皮下组织切口，打开胸膜腔以暴露心脏和肺。使用无菌外科缝线结扎上、下腔静脉，防止灌注液反流，并用剪刀在左心室制造一个2至4毫米的裂口，以促进灌注液从肺部排出。然后用3毫升注射器将PBS注入右心室，同时持续吸引以移除流出的液体，直至肺组织颜色由红色变为完全苍白为止。

为确保肺灌注成功，需妥善固定上腔静脉和下腔静脉。肺组织收获后，将肺叶置于定制的六厘米培养皿中的肺支架上，并将肺固定在支架的网状表面。用 PBS 覆盖并润湿肺叶，然后将培养皿放置在共聚焦显微镜的成像载物台上。

选择5倍物镜，并将滤光轮旋转至NIBA位置。使用488纳米激光激发CFSE，以清晰观察肺叶内荧光蓝色标记的肿瘤细胞。将滤光轮旋转至R690，以每像素2微秒的扫描速度进行扫描，并优化高压增益和偏移水平。

然后以每像素10微秒的扫描速度，采集五幅12乘以512像素的荧光图像。采用上述所示染色方法，肿瘤细胞可被CFSE以剂量依赖的方式有效标记。在20微摩尔浓度下，每毫升含有六乘以10的5次方个Lewis肺癌细胞时，标记的荧光强度几乎达到平台期。

在收获前进行肺灌注（如上所述）可清除肺血管中非特异性截留的循环肿瘤细胞，从而为成像分析做好准备。荧光共聚焦显微镜可显示收获并灌注后的肺叶内存在定植的CFSE标记肿瘤细胞。使用合适的图像分析软件将荧光图像转换为黑白图像，有助于对肺部定植进行定量分析。

通过静脉注射表达纤连蛋白或表达乱序纤连蛋白的路易斯肺癌细胞，发现在注射后38小时和45小时收获的肺组织中，表达纤连蛋白的细胞数量显著减少，凸显了纤连蛋白在肺叶定植及肿瘤发展中的作用。在进行该操作时，需注意仔细灌注肺组织，以洗去未附着的细胞。该技术建立后，为癌症转移领域的研究人员探索循环肿瘤细胞在小鼠零重力模型中的肺部定植提供了重要途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何对肿瘤细胞悬液进行荧光标记，通过静脉接种使肿瘤细胞灌注小鼠肺部，并利用共聚焦荧光显微镜对转移的肿瘤细胞进行成像。