肺定植法在肺部组织循环肿瘤细胞可视化中的建立

需要一个动物模型来破译循环肿瘤细胞 (CTCs) 在肿瘤转移过程中促进肺定植的作用。在这里, 我们建立并成功地进行了体内检测, 专门测试了高分子纤维连接蛋白 (polyFN) 组装对 CTCs 肺定植的要求。

这种方法可以帮助回答癌症转移领域关于肺定植在完成癌症转移中的作用的关键问题。该技术的主要优点是在癌症转移期间可以在肺部看到早期外渗的癌细胞。演示该程序的是我实验室的博士生 Cheng-Han Yang。

当肿瘤细胞培养物达到 70% 至 80% 汇合时，每次洗涤用 2 毫升无菌 PBS 洗涤培养物两次，并向培养皿中加入 1 毫升 0.5% 胰蛋白酶-EDTA。立即取出 800 μL 上清液，将培养皿置于 37 摄氏度下 30 至 60 秒，直到大多数细胞从平板上分离。加入 1 毫升新鲜培养基，补充 10% FBS 以终止反应，并使用 1000 微升移液管剧烈混合细胞溶液。

将所得单细胞悬液转移到 1.5 ml 微量离心管中，并通过离心收集细胞。然后将肿瘤细胞沉淀重悬于 1.5 毫升补充有 20% FBS 的培养基中，并在 37 摄氏度下将细胞端面旋转 2 小时。在孵育结束时，通过台盼蓝排除对活细胞进行计数，并通过离心收集它们。

将沉淀重悬于 1 毫升无菌 PBS 中进行第二次离心，并将沉淀重悬于 500 微升补充有 10% FBS 和 20 微毫升 CFSE 的 PBS 中。在 37 摄氏度下避光 10 分钟后，离心细胞，并将沉淀重悬于 4 毫升补充有 1% FBS 的培养基中，以进行另一次离心。最后一次洗涤后，将细胞重悬至每毫升不含 FBS 浓度的新鲜培养基中 10 至 6 个肿瘤细胞的 5 倍，并将细胞置于冰上。

接下来，将 4 到 6 周龄的雄性 C570 Black Six 小鼠的尾巴加热 5 到 10 分钟以扩张尾静脉，并使用配备 26 号半针头的 1 毫升注射器彻底混合细胞，直到获得单细胞悬液。小心地在注射器中加入 200 μL 细胞，并将鼠标放在限制器中。然后将整个体积的细胞注射到扩张的尾静脉的管腔中。

在适当的注射后时间点，从腹部到胸部做一个纵向皮肤和皮下组织切口，打开胸膜腔，露出心脏和肺。使用无菌手术缝合线，结扎上腔静脉和下腔静脉，以防止充注液回流，并使用剪刀在左心室形成 2 至 4 毫米的裂缝，以促进灌注液从肺部排出。然后使用 3 毫升注射器将 PBS 注射到右心室，并使用连续抽吸去除排出的溶液，直到肺部从微红色变为完全苍白。

注意正确固定上腔静脉和下腔静脉，以成功进行肺灌注。收获肺后，将肺叶放入 6 厘米培养皿中的定制肺支架中，并将肺固定在支架的网状结构上。用 PBS 覆盖并润湿裂片，然后将培养皿放在共聚焦显微镜的成像台上。

选择 5 倍物镜，然后将滤光轮旋转到 NIBA。使用 488 纳米激光，激发 CFSE，以清晰地看到肺叶内荧光蓝色标记的肿瘤细胞。将滤光片转盘旋转到 R690，以每像素 2 微秒的扫描速度进行扫描，并优化高电压增益和偏移水平。

然后，以每像素 10 微秒的扫描速度捕获 5 张 12 x 5 张 12 像素的荧光图像。使用刚刚证明的染色方法，肿瘤细胞以剂量依赖性方式用 CFSE 有效标记。随着标记的荧光强度，在 20 微摩尔浓度下，每毫升几乎达到 6 乘以 10 至第 5 个 Lewis 肺癌细胞的平台期。

正如刚刚证明的那样，收获前的肺灌注在成像分析之前清除了非特异性切碎的循环肿瘤细胞的肺血管系统。荧光共聚焦显微镜检查显示收获和灌注肺叶内存在定植的 CFSE 标记的肿瘤细胞。使用适当的图像分析软件程序将荧光图像转换为黑白图像，有助于定量肺定植。

静脉内递送表达纤连蛋白或加扰的纤连蛋白表达 Lewis 肺癌细胞表明，注射后 38 小时和 45 小时收获的肺组织中表达纤连蛋白的细胞数量显着降低，强调了纤连蛋白在肺叶定植和肿瘤发展中的作用。在尝试此程序时，重要的是要记住小心地灌注肺部，以便可以冲走未附着的细胞。该技术开发后，为癌症转移领域的研究人员在小鼠零克模型中通过循环肿瘤细胞探索肺定植铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何荧光标记肿瘤细胞悬液、静脉接种肿瘤细胞、灌注小鼠肺以及使用共聚焦荧光显微镜对转移的肿瘤细胞进行成像有一个很好的了解。