Name: 体内荧光记者对小鼠视交叉上细胞核生物钟基因表达的监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 了解利用荧光报告基因在小鼠视交叉上核中实时监测生物钟基因表达的方法。该技术可在明暗和持续黑暗条件下进行高时间分辨率的长期记录，有助于研究昼夜节律的神经机制。

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感谢张实验室成员提供的富有启发性的讨论，以及詹实验室成员提供的技术支持。本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）资助项目31500860（资助对象：C.Z.）、中国科技部973计划项目2012CB837700（资助对象：E.E.Z. 和 C.Z.）以及北京市政府资金的支持。E.E.Z. 受到中国“海外高层次青年人才引进计划”&#34;Recruitment Program of Global Youth Experts&#34;的支持。

本方案中的所有操作均经北京生命科学研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并符合中国政府的相关法规。
1. Cry1 荧光报告系统的构建
注意：以往利用生物发光系统进行的昼夜节律研究2,12,13，通常将昼夜节律启动子与不稳定的luciferase（dLuc）融合，以诱导dLuc的节律性表达。为了开发一种荧光报告系统，本研究将不稳定的luciferase替换为不稳定的荧光蛋白（dVenus），以实现dVenus的节律性表达。下文将描述P(Cry1)-dVenus报告系统的构建过程，该载体目前正在提交至Addgene，即将对学术研究开放使用。
<ol>
	<li>扩增小鼠功能性的 Cry1 启动子（Cry1 基因的 +328 至 -1208 bp 区域，转录起始位点定义为“-1”）。使用 PCR 酶（KOD Plus Neo）、引物 F1 和 R1（见表 2）、小鼠基因组作为模板，并按照制造商的 PCR 方案扩增 Cry1 启动子 DNA 片段。</li>
	<li>扩增 Cry1 基因的内含子 336，该区域对 Cry1 的生物钟功能至关重要14。使用 PCR 酶、引物 F2 和 R2、小鼠基因组作为模板，并按照制造商的 PCR 方案扩增内含子 336 DNA 片段。</li>
	<li>扩增 Venus。使用 PCR 酶、引物 F3 和 R3、pVENUS-N1 质粒作为模板，并按照制造商的 PCR 方案扩增 Venus DNA 片段。</li>
	<li>扩增 NLS-D2 DNA 片段。使用 PCR 酶、引物 F4 和 R4、pcDNA3.3-d2eGFP 质粒作为模板，并按照制造商的 PCR 方案扩增 NLS-D2 DNA 片段。</li>
	<li>合成 DNA 片段 1 作为外显子 1。</li>
	<li>合成 DNA 片段 2 作为内含子 336 与 Venus DNA 片段之间的连接序列。</li>
	<li>用 MluI 和 EcoRI 酶切割 pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA 载体质粒。使用凝胶回收试剂盒纯化较大的 DNA 片段。按照制造商的方案操作。</li>
	<li>使用 Gibson 组装混合液及其标准方案，将所有 DNA 片段组装在一起，构建 pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA 报告载体。按照制造商的方案操作。</li>
</ol>
2. 腺相关病毒的制备15
<ol>
	<li>准备以下质粒DNA储备液：31.25 µg pRV1、31.25 µg pH21、125 µg pFdelta6，以及62.5 µg pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA。</li>
	<li>准备五块15 cm培养皿的293T细胞，待细胞融合度达到90%时进行后续操作。</li>
	<li>按照转染试剂说明书将质粒转染至293T细胞中。每块培养皿使用6.25 µg pRV1、6.25 µg pH21、25 µg pFdelta6、12.5 µg pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA，以及120 µL转染试剂。</li>
	<li>转染72小时后，用移液枪将细胞从每块培养皿中吹打下来，收集至两个50 mL离心管中。</li>
	<li>在800 × g条件下离心10分钟以沉淀细胞，弃去上清液。每管加入20 mL磷酸盐缓冲液（PBS），重悬细胞后再次在800 × g条件下离心10分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于150 mM NaCl和20 mM Tris溶液（pH 8.0）中，每管使用25 mL溶液。向每管中加入1.25 mL新配制的10%脱氧胆酸钠溶液（溶于dH2O中）。加入苯并核酸酶（benzonase nuclease），使其终浓度为每毫升50单位，充分混匀。37 °C孵育1小时。</li>
	<li>在3000 × g条件下离心15分钟以去除细胞碎片。进一步通过0.45 μm针头滤器过滤混合液，确保所有碎片被清除；此步骤有助于防止肝素柱堵塞。</li>
	<li>使用蠕动泵安装肝素柱，设定流速为1 mL/min，并确保柱内无气泡产生。</li>
	<li>用10 mL的150 mM NaCl、20 mM Tris溶液（pH 8.0）平衡肝素柱。将含有病毒的溶液分别加入各柱中。用20 mL的100 mM NaCl、20 mM Tris溶液（pH 8.0）洗涤柱子。然后使用5 mL注射器依次用1 mL的200 mM NaCl、20 mM Tris溶液（pH 8.0）和1 mL的300 mM NaCl、20 mM Tris溶液（pH 8.0）进行洗涤。</li>
	<li>使用5 mL注射器依次以3 mL的400 mM NaCl、20 mM Tris溶液（pH 8.0），随后4 mL的450 mM NaCl、20 mM Tris溶液（pH 8.0），最后3 mL的500 mM NaCl、20 mM Tris溶液（pH 8.0）洗脱病毒。收集洗脱产物。</li>
	<li>为浓缩重组腺相关病毒（rAAV），将洗脱产物每次4 mL加载至截分子量为100,000的离心过滤装置中。在室温下以2000 × g离心5分钟，弃去滤过液。</li>
	<li>当所有洗脱产物均通过离心过滤装置后，加入4 mL PBS，离心浓缩至约250 μL。从离心过滤装置中取出rAAV（病毒滴度约为2–8 × 1012 病毒颗粒/mL），分装后于-80 °C保存备用。此阶段病毒可保存数月。</li>
</ol>
3. 成年小鼠视交叉上核的rAAV注射与光纤植入
<ol>
	<li>向视交叉上核注射携带昼夜荧光报告基因的重组腺相关病毒
	<ol>
		<li>加入5 µL rAAV（病毒滴度约为2 - 8 x 1012 每毫升病毒颗粒数）注入微量注射器中。</li>
		<li>用戊巴比妥钠（80 mg/kg）经腹腔注射麻醉成年小鼠（2至5月龄，C57BL/6背景），通过脚趾夹捏无反应判断麻醉深度是否足够。</li>
		<li>使用剪刀去除小鼠头部的毛发，然后将小鼠固定于立体定位仪中。通过循环热水毯或其他加热装置为麻醉动物提供热源。 
		注意：也可使用脱毛膏或电动理发剪去除毛发。</li>
		<li>用适当的消毒剂清洁手术部位。例如，可使用无菌水、酒精和碘、聚维酮碘等。&#160;或使用稀释的氯己定进行交替擦洗，重复至少3次。&#160;覆盖手术区域。</li>
		<li>&#160;使用剪刀在头皮上做切口以暴露颅骨。</li>
		<li>调整立体定位仪，使前囟和后囟处于同一水平面；在同一水平面上标记前囟的两个对称点。</li>
		<li>使用浸有4% H的无菌棉签2O2/2用O腐蚀脑部骨膜。然后使用干净且无菌的棉签清除并擦干颅骨表面。</li>
		<li>使用微型钻头，在冠状缝前0.46 mm、外侧0.25 mm处钻一个直径约1 mm的孔。</li>
		<li>fi使用无菌棉拭子蘸取生理盐水，清除脑组织暴露表面的骨碎片。</li>
		<li>将微量注射器插入脑内，确保微量注射器尖端位于前囟后方0.46 mm、外侧0.25 mm，深度为颅骨表面下5.7 mm。</li>
		<li>注射 500 nL rAAV（50 nL/min）-1) 注入SCN，在注射完成后将微量注射器留置10分钟，以确保rAAV充分扩散。</li>
		<li>缓慢撤出微量注射器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将光纤插入视交叉上核区域。
	<ol>
		<li>使用光纤刀切割一段17 mm长的光纤，确保光纤两端切面光滑。</li>
		<li>将光纤插入陶瓷插芯中，并使用甲基乙基酮过氧化物（AB胶）将光纤固定在陶瓷插芯上，确保光纤表面与陶瓷插芯表面齐平。</li>
		<li>使用冷灭菌溶液或环氧乙烷清洁光纤。</li>
		<li>在rAAV注射后（步骤3.1.11），将含有陶瓷套管的光纤插入视交叉上核（SCN）。</li>
		<li>使用牙科树脂将陶瓷插芯和光纤固定在颅骨上，并使其干燥。</li>
		<li>用指甲油背面涂抹牙科树脂表面。重复3.1.2中所述步骤。&#160;至3.2.5步骤，省略rAAV的实际注射以作对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理
	<ol>
		<li>为小鼠提供术后镇痛药物，例如按2 mg/kg体重剂量皮下注射布托啡诺，每日两次。</li>
		<li>将小鼠置于恢复笼中，直至其从麻醉状态中苏醒。</li>
		<li>在12小时光照/12小时黑暗循环条件下（笼底光照强度约100勒克斯）单只饲养小鼠，自由供应食物和水 随意摄取应预留八天时间以保证充分恢复，并确保荧光报告基因的表达达到最佳状态。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体内 荧光信号监测与数据采集
<ol>
	<li>手术后第8天，将小鼠头部的光纤与荧光信号监测器连接例如., 基因观察仪）。检测对照小鼠SCN中的荧光信号，以确定背景信号水平。使用荧光信号监测仪进行该信号的观察与测量。</li>
	<li>以与对照小鼠相同的操作评估实验小鼠的荧光信号。将虽注射了病毒载体但仅显示背景信号的小鼠排除在分析之外，因为这很可能表明光纤尖端未命中视交叉上核（SCN）。完成初步操作后，将小鼠放回原代饲养笼中继续饲养3周，以使荧光信号稳定。</li>
	<li>3 周后，将小鼠连接至荧光信号监测器。每 10 分钟测量一次荧光信号，每次持续 15 秒，采样频率为 100 Hz。在测量过程中，小鼠可在笼内自由活动，并可自由获取食物和水。 随意摄取使用约 100 lux 的光照强度照射笼底，光纤尖端的激光功率控制在 15 - 20 µW 之间。</li>
	<li>所有记录完成后，用4%多聚甲醛灌注小鼠，取出大脑并切片，以检查光纤植入位置。若光纤尖端未正确植入视交叉上核（SCN），则将该小鼠排除在分析之外。</li>
</ol>
5. 数据分析与展示
<ol>
	<li>每10分钟测量一次荧光信号，持续15秒，采样频率为100 Hz，共获得1500个数据点。这1500个数据点的平均值即为任意给定时间点的荧光信号强度。将多个时间点的平均值随时间进行绘图，可得到信号-时间曲线，该曲线对应于自由活动小鼠下丘脑视交叉上核（SCN）中在对照光照条件下Cry1的转录节律。</li>
</ol>

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<li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abrupt+shift+in+the+day%2Fnight+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li>
<li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Circadian+Entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

与……相比 离体 方法，例如脑片培养4,5，逆转录聚合酶链式反应16，以及 原位 杂交17，这需要杀死动物， 体内 记录方法使研究者能够在活体动物中研究昼夜节律基因的表达。因此，该技术能够评估不同物理扰动的影响（例如睡眠剥夺、压力、食物摄入 等等。) 对神经昼夜节律钟的影响。与之相反， 体内 生物发光7,8,10 只能在恒定黑暗条件下起作用的方法，其荧光 体内 记录方法可在光照条件下应用——这一技术优势在于光照信号能够重新同步SCN昼夜节律钟18尽管通过该方法能够检测到相...

在哺乳动物中，视交叉上核（SCN）调控全身的昼夜节律，以协调个体对体外环境变化的反应例如光照、温度、胁迫 等等。)1核心生物钟组分包括 Per1-3, Cry1-2, 时钟，以及 Bmal1，并在调控每个细胞的昼夜节律钟中发挥核心作用。SCN中的每个细胞都含有转录激活因子CLOCK/BMAL1，该因子以异源二聚体形式发挥作用，诱导PER和CRY的表达。随后，PER/CRY复合物抑制CLOCK/BMAL1的功能，形成一个约需24小时完成的转录-翻译负反馈环路。2,3.
以往关于视交叉上核（SCN）的研究主要采用ex vivo SCN脑片培养方法4,5,6。尽管该方法提供了有价值的信息，但其局限性阻碍了我们获取有关其他脑核对SCN影响的数据，以及外源性刺激（例如，光）对位于这一关键区域细胞的作用。2001年，Hitoshi Okamura的研究团队首次利用生物发光系统在自由活动的小鼠中对SCN内的昼夜节律钟基因表达进行in vivo监测7。Ken-ichi Honma的研究团队在过去几年中进一步发展了SCN内生物发光的in vivo记录系统8,9,10。这些研究共同使研究人员能够在恒定黑暗条件下或光脉冲后监测昼夜节律钟。然而，由于生物发光信号过于微弱，无法在明暗循环期间实现连续监测，加之光是SCN介导昼夜节律钟同步化所需的主要信号11，因此对克服生物发光记录局限性的实验方法的需求日益增加。本报告描述了一种基于荧光的系统，该系统被构建用于在自由活动的小鼠中对SCN的昼夜节律钟进行in vivo监测。这种易于使用的方法可在明暗循环期间实现连续监测，允许对SCN中昼夜节律钟基因的转录进行长期、实时且高时间分辨率的观察。

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>试剂</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>质粒</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>质粒</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>质粒</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>试剂</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td>试剂</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap 肝素柱</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 离心滤管</td><td>EMD Millipore</td><td>&amp;nbsp;UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>苯甲酸核酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>试剂</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>每批次需新鲜配制</td></tr><tr><td>小鼠立体定位仪</td><td>B&amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>设备</td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>试剂</td></tr><tr><td>小鼠立体定位仪</td><td>B&amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>设备</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>试剂</td></tr><tr><td>光纤</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0.39 NA，&amp;Oslash;200 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>微量注射泵</td><td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>陶瓷套管</td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230&amp;thinsp;&amp;mu;m 内径，2.5 mm 外径</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>设备</td></tr></tbody></table>

体内 利用荧光报告基因监测小鼠视交叉上核中昼夜节律钟基因的表达

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

该技术结合了光纤介导的荧光记录与基于重组腺相关病毒的基因报告系统的精确递送。这一新颖且易于使用的方法 体内 开发了荧光监测系统以记录钟控基因的转录节律， Cry1，位于自由活动小鼠的视交叉上核（SCN）中。为此，需进行以下操作： Cry1 转录荧光报告系统被设计并包装至腺相关病毒中。纯化浓缩后的病毒被注射到小鼠视交叉上核（SCN），随后植入光纤并固定于脑表面。动物被放回其原饲养笼中，并给予1个月的术后恢复期，以确保报告基因充分表达。随后通过光纤在自由活动的小鼠中记录荧光信号 体内 我们机构构建的监测系统。对于 体内 记录系统采用488 nm激光器，并耦合一个1×4光束分束器，将光均分为四束功率相等的激光激发输出。该装置使我们能够同时记录四只动物的信号。每一路发射的荧光信号均通过光电倍增管和数据采集卡进行收集。与先前的生物发光相比 在体 昼夜节律时钟记录技术，这种荧光 体内 记录系统可记录光周期期间昼夜节律钟基因的表达。

Cry1 荧光报告系统的设计如图1A所示。采用上述方法，将500 nL的rAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2成功注射到成年小鼠的视交叉上核（SCN）中，并观察到强烈的Venus表达信号（图1B、1C）。在12小时光照/12小时黑暗（LD）和持续黑暗（DD）条件下记录的荧光信号（图2）均显示出显著的昼夜节律。最后，在长光周期和短光周期条件下也记录了荧光信号（图3）。
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这种新开发的基于荧光的技术能够对自由活动小鼠的视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因的转录进行长期、实时且高时间分辨率的监测。

该技术结合了基于光学纤维的荧光记录与基于重组腺相关病毒的基因递送，实现精确的基因操作……

该方法可实现对自由活动小鼠体内昼夜节律基因表达进行实时、高时间分辨率的监测。该技术的主要优势在于，其可在明-暗周期和全暗条件下均有效工作，而这两种条件对于昼夜节律研究至关重要。使用光纤刀切割一段长度为17毫米的光纤。确保光纤的每一端都光滑平整。将光纤插入陶瓷插芯中，并使用甲基乙基酮过氧化物将光纤固定在陶瓷插芯上。确保光纤表面与陶瓷插芯表面齐平。用浸有75%乙醇的棉签清洁光纤，并保持其清洁直至准备插入。首先将五微升重组AAV吸入微量注射器中，开始注射操作。然后，按照机构批准的方案麻醉成年小鼠，通过无趾夹反应判断麻醉深度是否足够。接着，使用剪刀去除小鼠头部的毛发。随后，将小鼠头部固定于立体定位仪中。在头皮上做切口后，暴露颅骨。调整立体定位仪，使前囟和后囟处于同一水平面。然后用浸有4%过氧化氢和水的棉签腐蚀脑部骨膜。用干净的棉签擦拭，清除并干燥颅骨表面。使用立体定位仪臂，确定手术部位，位于前囟后方0.46毫米、外侧0.25毫米处。然后使用微型钻在此处钻一个直径约1毫米的孔。使用含有生理盐水的透明棉签清除脑组织暴露表面的骨碎片。接着，将微量注射器插入脑内，深度为距颅骨表面 5.7 毫米。以每分钟 50 纳升的速度向视交叉上核（SCN）注射 500 纳升的重组 AAV。注射后将微量注射器留在原位10分钟，以确保重组AAV完全扩散。10分钟后，缓慢撤出微量注射器。在注射重组AAV后立即插入含有光纤的陶瓷套管至视交叉上核（SCN）中。然后使用牙科树脂将陶瓷插芯和光纤固定在颅骨上，并静置使其干燥。干燥后，用黑色指甲油涂抹牙科树脂表面。将小鼠放入预热的恢复笼中，并在小鼠从麻醉状态恢复期间进行监测。当动物恢复胸卧位后，可进行单只饲养，并放回具有12小时光照-黑暗循环的饲养室。术后第8天，检测假手术对照小鼠SCN中的荧光信号，以确定背景信号水平。首先，将小鼠头部的光纤与荧光信号监测器连接。将软件设置为每10分钟以100赫兹的频率测量荧光信号15秒。记录假注射小鼠的信号。重复该过程以评估注射重组AAV隐花色素报告病毒小鼠的荧光信号。排除那些接受了病毒载体但仅显示背景信号的小鼠，因为这很可能表明光纤尖端未对准视交叉上核（SCN）。完成这些初步检测后，将小鼠放回其原饲养笼中再饲养三周，以使荧光信号趋于稳定。实验结束时，检查固定脑组织中光纤的植入位置。若视神经纤维尖端未正确植入视交叉上核（SCN），则应将该小鼠排除在分析之外。采用上述方法，成功向成年小鼠的视交叉上核（SCN）注射了500纳升含有隐花色素基因报告系统的病毒。病毒注射后第8天观察到强烈的Venus表达。此放大图像显示了SCN中高水平的venus表达。此处展示的是假手术动物在光照开启和关闭期间SCN的背景荧光。该动物在明暗周期和全黑暗条件下均未表现出可检测到的节律。该图像显示了在12小时光照-12小时黑暗条件下，七天内cryp

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体内荧光记者对小鼠视交叉上细胞核生物钟基因表达的监测

本文报道了制备包含成年小鼠下丘脑视交叉上核（SCN）的脑切片的方法，以及在器官型培养条件下快速培养SCN组织的技术。此外，还描述了利用动态荧光素酶报告技术检测振荡性生物钟基因蛋白表达的方法。...

下丘脑视交叉上核钟基因活性的脑片制备、器官型组织培养及荧光素酶记录

昼夜节律钟在单个细胞内发挥作用，即具有细胞自主性。本文描述了利用非侵入性的、基于荧光素酶的实时生物发光技术构建细胞自主性节律钟模型的方法。报告基因细胞为研究昼夜节律生物学提供了易于操作且功能明确的模型系统。...

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转染发光生物钟报告基因的拟南芥原生质体中昼夜表型的快速分析

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外...

平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

一个 体外 利用生物发光检测法测定乳腺上皮细胞中细胞昼夜节律。该方法采用哺乳动物细胞报告质粒，其在特定启动子调控下表达不稳定型荧光素酶。 PERIOD 2...

体外 生物发光检测法用于表征乳腺上皮细胞中的昼夜节律

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使用自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪（ALLIGATOR）灵活检测生物发光报告基因

本实验方案的目的是建立 离体果蝇...

单细胞分辨率荧光活体成像 果蝇 幼虫脑组织培养中的生物钟

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实时生物发光成像监测小鼠神经发生过程中Notch信号动态变化

昼夜节律存在于大多数生物体中，可调控生物过程的时间组织。3D类器官最近已成为一种生理相关性较强的模型系统 体外 模型。本方案描述了使用生物发光报告基因在类器官中观察昼夜节律的方法，从而实现 体外...

利用生物发光报告系统监测类器官中的昼夜节律振荡

本研究介绍了基于化学遗传学和紫光的策略，以实现可靠的白天昼夜节律相位移动。...

使用化学遗传学与光谱学方法诱导白天昼夜节律相位偏移

了解利用荧光报告基因在小鼠视交叉上核中实时监测生物钟基因表达的方法。该技术可在明暗和持续黑暗条件下进行高时间分辨率的长期记录，有助于研究昼夜节律的神经机制。

体内利用荧光报告基因监测小鼠视交叉上核中昼夜节律钟基因的表达

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