Name: 人诱导多能干细胞的前脑型脑 Organoids 标准化和可再生性的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学习利用人诱导多能干细胞生成标准化前脑型脑类器官的方法，该技术可高效建立可重复的人类皮层组织模型，为研究早期大脑皮层发生机制及神经发育障碍提供可靠的体外三维培养系统。

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本工作由北莱茵-威斯特法伦州创新科学与研究部（青年研究组）以及ERA-NET NEURON、JTC 2015神经发育障碍项目STEM-MCD资助。

1. 诱导多能干细胞聚集体的生成
<ol>
	<li>从iPSC细胞集落中生成单细胞单层培养物
	<ol>
		<li>制备包被有基底膜提取物（BME）的6孔板。将BME在&#160;在4 °C下冰浴2-3小时，用预冷的DMEM/F12培养基（DMEM-F12；1:50稀释）稀释，每孔加入1 mL稀释后的BME溶液覆盖培养板，4 °C孵育过夜。</li>
		<li>吸弃培养基，用含0.5 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤至少2个6孔板孔中的完整iPSC集落，洗涤两次，随后在室温（RT）下用含0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS孵育4分钟。吸弃EDTA溶液，用5 mL DMEM-F12培养基轻轻冲洗培养皿底部，使集落脱落。将脱落的集落收集至15 mL离心管中，通过离心（1,200 × g，4分钟）形成细胞沉淀。 g 室温下（at RT）。 
		注意： 由商业来源的成纤维细胞重编程获得的iPSCs已成功应用10.</li>
		<li>吸弃上清液，加入500 µL细胞解离试剂，将iPSC集落于37 °C孵育6分钟。</li>
		<li>用1 mL移液器轻轻反复吹打细胞悬液数次，以将残留的细胞团块分散成单个细胞。</li>
		<li>向细胞悬液中加入 4 mL DMEM-F12，以稀释细胞解离试剂。</li>
		<li>以 1,200 x 转速离心细胞 g 室温下持续 4 分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于2 mL添加了5 µM Y-27632的iPSC培养基中，并接种至一孔BME包被的6孔板中。 
		注意： 使用指定的iPSC培养基 材料表 用于单细胞单层iPSC培养。</li>
		<li>第二天，将培养基更换为不含 Y-27632 的新鲜 iPSC 培养基。自此开始，每天更换培养基，持续培养细胞，直至 iPSC 达到 100% 汇合度。根据细胞系及起始孔的汇合程度，此过程通常需要 2 至 4 天。</li>
		<li>待细胞融合后，传代iPSCs。吸除培养基，向细胞中加入500 µL细胞解离试剂。</li>
		<li>在37 °C下孵育细胞5-10分钟。轻轻摇动培养板以使细胞脱落。</li>
		<li>用 2 mL DMEM-F12 洗涤细胞孔中的细胞，并收集至 15 mL 离心管中。再加入 DMEM-F12，使总体积达到 5 mL。</li>
		<li>以 1,200 x g 离心细胞 g 室温孵育4分钟，吸除上清液。</li>
		<li>以1:2至1:4的比例将细胞接种于添加了5 µM Y-27632的iPSC培养基中，置于基质胶（BME）包被的6孔板（每孔2 mL培养基）上。</li>
		<li>继续培养细胞 2-5 天，每天更换不含 Y-27632 的 iPSC 培养基。待细胞融合后，传代 iPSC（步骤 1.1.4–1.1.8）。 
		注意： 将iPSCs在指定的iPSC培养基中以单层形式培养至少传代2次 材料表 在用于生成iPSC细胞团之前，先让细胞适应培养条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当单层iPSC培养物达到70-90%融合度时，用于生成iPSC聚集体。 
	注意： 以单细胞形式适应培养条件的iPSC在解离和聚集体形成过程中不易受到导致细胞死亡的应激影响。单层iPSC培养物应呈现典型的多能性形态，无明显分化迹象。需定期检测培养物是否存在支原体污染。仅使用无支原体污染的iPSC培养物。
	<ol>
		<li>从6孔板的一个孔中吸出培养基，并向细胞中加入500 µL细胞解离试剂。</li>
		<li>在37 °C下孵育细胞5-10分钟。轻轻摇动培养板以使细胞脱落。</li>
		<li>用 2 mL DMEM-F12 洗涤孔中的细胞，并收集至 15 mL 离心管中。加入 DMEM-F12 至终体积为 10 mL。</li>
		<li>细胞计数时，取25 µL细胞悬液与25 µL台盼蓝混合，以标记死细胞。使用计数板对活细胞进行计数。</li>
		<li>从细胞悬液中收集足够数量的细胞（每个iPSC聚集体4,500个细胞）至15 mL离心管中。</li>
		<li>以 1,200 x g 离心细胞 g 室温孵育4分钟，吸除上清液。</li>
		<li>用适量添加了50 µM Y-27632的iPSC培养基重悬细胞，以获得每150 µL含4,500个活细胞的悬液。 
		注意： 使用高浓度的Y-27632（50 µM）对iPSCs的存活至关重要。</li>
		<li>在低吸附性96孔圆底板的每孔中加入150 µL，并置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2. 
		注意： 在生成iPSC聚集体时，需考虑在第20天至少需要6个类器官用于质量控制（见第5节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 诱导前部神经外胚层
<ol>
	<li>每天在组织培养显微镜下使用 4X 或 10X 物镜密切观察 iPSC 细胞团的形态变化。在第 1 天观察时，细胞团应具有清晰的边界。继续将 iPSC 细胞团在 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中进行培养。 
	注意： 每孔中存在一定数量的死亡细胞属于正常现象，不会影响类器官的生成。</li>
	<li>从第 2 天开始，每隔一天更换一次培养基：轻轻吸出约 2/3 的培养基，注意不要扰动底部的细胞团。随后加入额外的 100 µL 不含 Y-27632 的 iPSC 培养基。 
	注意： 在 4–6 天内，细胞团直径将达到 350–450 µm，并呈现光滑的边缘。</li>
	<li>在此阶段，使用剪去尖端的 100 µL 移液枪头将细胞团转移至低吸附性 6 cm 培养皿中（每皿最多 20 个细胞团），并置于皮层诱导培养基中。该培养基包含 DMEM-F12、N2 补充剂（1:200）、B27 补充剂（1:100）、葡萄糖（0.2 mg/mL）、环磷酸腺苷（cAMP；0.15 µg/mL）、0.5% 非必需氨基酸（NEAA）、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、肝素（10 µg/mL），以及化合物 LDN-193189（180 nM）、A83-01（500 nM）和 Wnt 反应抑制剂-1（IWR-1）（10 µg/mL）。在细胞团转移至 6 cm 培养皿后的第 3 天更换皮层诱导培养基。</li>
	<li>在皮层诱导过程中，使用 4X 物镜在组织培养显微镜下密切监测细胞团的形态变化。 
	注意： 在皮层诱导培养基中培养 4–5 天后，细胞团边缘表面应开始变亮，表明已启动神经外胚层分化。此时，可观察到假复层上皮的放射状结构形成。接下来进入第 3 节&#160;，将细胞团包埋于 BME 基质中。</li>
</ol>
3. 神经外胚层聚集体在基质支架中的包埋
<ol>
	<li>解冻 BME&#160;在 4 °C 冰浴中放置 2–3 小时。分装未稀释的 BME，用量需充足。</li>
	<li>准备用于包埋的塑料石蜡膜片。使用无菌剪刀将塑料石蜡膜裁剪成 4 cm × 4 cm 的小片，取一片覆盖在空的 100 µL 吸头盒（用于 100 µL 吸头）上，用戴着手套的手指轻压，使塑料石蜡膜片形成小凹陷（每个细胞聚集体需要 1 个凹陷）。用 70% 乙醇清洁塑料石蜡膜，并在密闭的无菌操作台内以紫外线照射 30 分钟（功率：15 瓦，波长：435 nm）。</li>
	<li>使用直径为1.5–2 mm的100 µL截头吸头，将每个细胞团块转移至塑料石蜡膜片的一个凹槽中。若两个细胞团块发生融合，则无需分离，应将其一同转移至同一凹槽内。</li>
	<li>使用未剪切的100 µL枪头轻轻吸除细胞聚集体周围的培养基。 
	注意： 注意不要将细胞团吸入枪头，以免损伤细胞团。</li>
	<li>向每个细胞聚集体中加入 40 µL 未稀释的 BME。</li>
	<li>使用未切割的100 µL枪头将每个细胞聚集体置于BME液滴中央。 
	注意： 务必小心，避免移液器吸头损伤正在发育的神经上皮。</li>
	<li>使用无菌镊子将塑料石蜡膜片小心转移至10 cm培养皿（或其他合适的细胞培养皿）中，将培养皿放入培养箱孵育15–20分钟，使BME凝固。</li>
	<li>同时，准备一个含有5 mL皮质诱导培养基的低吸附6 cm培养皿。</li>
	<li>BME 聚合后，从塑料石蜡膜片上取下含有细胞聚集体的液滴。用无菌镊子将塑料石蜡膜翻转，轻轻挤压细胞聚集体，使其落入已略微倾斜（约 30°）的低吸附 6 cm 培养皿中，直至液滴完全脱离塑料石蜡膜片。每个 6 cm 培养皿中最多转移 16 个细胞聚集体。</li>
	<li>继续在37 °C下孵育细胞聚集体。</li>
</ol>
4. 由神经外胚层聚集体生成前脑型类器官
<ol>
	<li>在基质胶（BME）基质中包埋后一天，将类器官培养皿置于细胞培养摇床的摇床上，设置倾斜角度为5°、转速为14 rpm，并将摇床放置于细胞培养箱中。</li>
	<li>每天观察类器官。包埋于BME基质后，均一的神经上皮环状结构将逐渐形成。</li>
	<li>当可见神经上皮环状结构时，更换为类器官分化培养基，该培养基包含DMEM-F12、N2添加剂（1:200）、B27添加剂（1:100）、葡萄糖（0.2 mg/mL）、cAMP（0.15 µg/mL）、0.5% NEAA、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和胰岛素（2.5 µg/mL）。</li>
	<li>每3–4天更换一次类器官分化培养基，直至达到所需的分化时间点，随后固定类器官（见第5节）。 
	注意：偶尔组织可能形成光学透明的芽状结构而无环状结构。尽管此情况并非理想状态，但并不影响皮层结构的发育。类器官可在类器官分化培养基中培养长达40天。对于延长培养期（40–100天），可在类器官分化培养基中添加1:50的BME以增加组织复杂性，并加入BDNF和GDNF以促进神经元的存活与成熟14,15。</li>
</ol>
5. 前脑类器官的固定与验证
<ol>
	<li>用于验证时，在第20天收集6个类器官。取其中3个类器官用于mRNA提取和PCR分析。使用开口为3–3.5 mm的截断1 mL移液枪头，将另外3个类器官转移至含有PBS的24孔板中，用于固定及后续的免疫细胞化学分析。</li>
	<li>用5 mL移液管小心吸去PBS并更换新鲜PBS，清洗类器官两次。在4%冷多聚甲醛（PFA，pH 7.4）中固定类器官15分钟。 
	注意： PFA为已知的人类致癌物，所有操作必须在化学通风橱中进行，并佩戴腈手套。建议佩戴护目镜。甲醛可导致角膜不可逆损伤。</li>
	<li>小心吸去PFA，用室温PBS洗涤三次，每次10分钟。</li>
	<li>将PBS替换为30%蔗糖溶液（质量/体积，以PBS配制），并将样本置于4 °C保存，使类器官充分脱水。样本可在进一步处理前于4 °C保存最多7天。</li>
	<li>固定后一天，通过加入台盼蓝（终浓度约1:50）对脱水类器官进行预染色，染色10分钟，以便在冷冻切片过程中可视化类器官。</li>
	<li>配制包埋介质：含10%蔗糖、7.5%明胶（质量/体积，以PBS配制），加热至75 °C直至完全溶解成液态。</li>
	<li>将30%蔗糖溶液替换为包埋介质，并将24孔板置于60 °C加热板上孵育15分钟，使类器官充分平衡。</li>
	<li>在包埋模具底部覆盖一层包埋介质，并将其置于冰上使其聚合固化。</li>
	<li>将类器官从24孔板转移至含有已固化包埋介质的模具中，顶部再加入适量包埋介质完全覆盖类器官，迅速将模具放入&#160;100%乙醇/干冰冷冻浴中（温度应介于-30至-50 °C），冷冻至少1分钟以实现速冻。</li>
	<li>用镊子将模具暂时放置于干冰上，可选择在-80 °C长期保存，或直接进行冷冻切片。</li>
	<li>将类器官以20 µm厚度进行冷冻切片，将切片按顺序收集于载玻片上，并记录各切片在载玻片上的排列顺序（连续切片收集）。切片在载玻片上干燥数小时后，可储存于-80 °C，或直接进行免疫细胞化学染色。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

脑类器官是研究人类大脑发育的有力工具 体外 因为它们提供了相关的物种背景以及组织环境中细胞复杂的三维排列。由此，它们填补了非人类动物模型与简化的人体二维单层细胞培养技术之间的空白。然而，其应用受到可重复性不足的限制9我们开发了一种前脑类器官培养方案，该方案通过结合诱导多能干细胞（iPSC）的自我组织能力及其对模式化因子的响应性，克服了样本间差异较大的问题。具体而言，将iPSC聚集成团以促进其自我组织，并随后抑制TGF-ß/SMAD信号通路，通过添加BMP抑制剂（LDN-193189）和TGF-β I型受体抑制剂（A83-01）诱导背侧皮层分化。此外，还应用了Wnt通路抑制剂（IWR）以防止后部化。与“内在”型脑类器官培养方案相比19，这些基于自组装且无外部控制的过程导致生成的脑类器官具有较高的异质性，并表现出显著的批次间差异（通过极化神经外胚层形成的效率来衡量）15），本文所述方案可从人iPSCs稳定地生成均一的前脑特异性类器官。
这些前脑型类器官可应用于多种研究领域，例如神经发育研究、包括基因功能研究在内的进化研究、疾病建模，以及潜在的药物筛选和治疗用途。然而，该方案最适合用于研究人类皮层发育的早期阶段。例如，我们曾利用前脑型类器官研究vRGC行为中的人类特异性特征。更具体而言，我们探讨了与一种严重形式的无脑回畸形（lissencephaly）相关的病理生理变化，该疾病是一种以皮层折叠几乎完全缺失为特征的人类皮层发育畸形。由于小鼠大脑天然为无脑回结构，因此仅能部分模拟该疾病。当将类器官系统应用于无脑回畸形患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）时，我们能够可靠地重现该疾病的人类特异性特征，并鉴定其潜在机制。具体而言，我们发现患者来源的类器官表现出显著的体积减小，这是由于vRGCs的细胞分裂方式由对称分裂转变为不对称分裂所致。这一转变与vRGCs微管网络结构的改变、生发区（VZ）微环境结构的破坏以及细胞黏附分子表达的异常相关，最终导致N-钙黏蛋白/β-连环蛋白（N-cadherin/β-catenin）信号通路的激活受损10值得注意的是：β-catenin 对 vRGC 分裂模式的依赖性调控被认为是人类特有的，因为在小鼠中过表达 β-catenin 会导致皮层切向扩张，进而引发皮层折叠20因此，我们的数据强调，前脑类器官系统是一种有前景的工具，可用于以可量化的方式研究人类早期皮层发育的特有特征。 体外.
未来面临的一个主要挑战是，在延长的培养时间内维持类器官的均一性，以获得更为成熟的神经元表型。这一目标可能通过以下一种或多种方式实现：将类器官培养于生物反应器系统中14，使用悬浮支架15，或在分化培养基中添加神经生长因子及神经元存活因子。最后，通过将前脑型类器官与具有不同区域特征的脑类器官融合，可能实现大脑复杂性的可控增加21,22。
综上所述，本文介绍的前脑类器官培养方案为体外生成早期皮层结构提供了一种易于应用且可靠的工具。in vitro 条件下可形成高度均一的早期皮层组织，且该方案适用于多种诱导多能干细胞系，能够稳定地生成个体特异性的皮层组织。因此，该体系特别适用于疾病建模等需要高度均一性和可重复性的研究应用。

人脑显然是最复杂的器官之一，负责所有人类的智力能力。因此，深入理解人类特有的大脑发育过程，是认识人类认知能力的关键前提。传统上，转基因动物被用作研究大脑发育的模式生物。这些模型为揭示大脑发育的基本原理提供了重要见解。目前我们已知，所有哺乳动物大脑发育的一个共同特征是前体细胞增殖、神经发生和神经元迁移的精确协调过程。然而，模式生物（如啮齿类动物）与人类的大脑之间存在显著的结构差异，尤其是在新皮层方面。目前提出的主要机制表明，灵长类动物皮层进化涉及干细胞和前体细胞增殖能力的增强，以及外侧放射状胶质细胞（oRGCs）的产生；而这类细胞在啮齿类动物中极为罕见1,2,3。
模拟人类大脑皮层发育的方法包括将多能干细胞（PSC）来源的端脑前体细胞及大脑皮层投射神经元以单层培养形式进行培养。这些标准化的分化方案可重现人类皮层发育的某些特征，例如皮层神经发生过程中典型的时间顺序4然而，这些方法在模拟器官发生过程中的发育事件（如空间模式形成和形态发生）方面仍存在不足。干细胞生物学领域的最新进展推动了源自多能干细胞（PSCs）的三维类器官培养技术的建立，该技术正在彻底改变相关研究领域 体外 人类器官发生。利用多能干细胞（PSCs）自我组装形成类器官结构的能力，已成功建立多种类器官，这些类器官反映了包括肾脏、肠道、眼睛和大脑在内的多种器官的关键结构和功能特性5此类类器官包含多种器官特异性的细胞亚型，这些细胞亚型聚集在一起，并在空间上以类似于发育中器官的方式进行组织排列。 体内5,6此外，利用单细胞RNA测序对细胞组成、谱系关系和基因调控网络的研究表明，人类脑类器官能够忠实地重现人类胎儿新皮层发育的主要特征，例如基因表达程序7,8然而，一个主要的缺点限制了它们的广泛应用，即批次间差异较大以及类器官之间的异质性9.
在此，我们提供了一种简单且标准化的前脑类器官培养体系的详细实验方案。该体系的关键特征在于能够高效且可重复地生成几乎完全具有背侧端脑身份的多能干细胞来源类器官。本方案基于我们近期研究中所采用的方法 细胞报告 纸10结合了iPSCs的自我组织能力与皮质神经上皮的选择性诱导，可在3周内稳定地生成均一的早期背侧端脑组织培养物. 该方案基于先前报道的SMAD信号通路和Wnt抑制策略，可引导多能干细胞向头端神经外胚层谱系分化11,12 结合基质包埋，可促进大而连续的神经上皮结构的形成13我们已成功将所述方法应用于多种iPSC细胞系，每个个体包含多个克隆。结果表明，该体系适用于对可重复性和均一性要求较高的下游应用，例如疾病建模。当将该方案应用于来自患有严重皮质畸形患者来源的iPSC时，我们能够重现该疾病的病理特征。 体外 并确定导致表型变化的新的分子机制10我们建议，所述类器官方案可用于弥合还原论的PSC来源皮质单层培养与 体内 研究，且代表了一种可靠且稳定的基于细胞的模型系统，可用于在体外模拟健康与疾病状态下的人类早期大脑皮层发育。

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>StemGent</td><td>130-106-274</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>1比100</td></tr><tr><td>基底膜提取物（例如Geltrex）</td><td>Gibco</td><td>A14132-02</td><td></td></tr><tr><td>环磷酸腺苷（cAMP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>0.15 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>细胞解离试剂（TrypLE Express）</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>计数室（例如Fuchs-Rosenthal）</td><td>Karl Hecht</td><td>40449001</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.3</td><td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM-F12 L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具（Tissue-Tek Cryomold）</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>0.5 mM&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td>10 ug/mL</td></tr><tr><td>WNT信号通路抑制剂（IWR-1）</td><td>Enzo Life Science</td><td>BML-WN103-0005</td><td>10 ug/mL</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td>2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>单层培养用iPSC培养基（Pluripro）</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>MK01</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMax）</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>1%</td></tr><tr><td>低吸附6 cm培养皿</td><td>Labomedic</td><td>2081646L</td><td></td></tr><tr><td>低吸附10 cm培养皿</td><td>Labomedic</td><td>2081646O</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-171</td><td>180 nM</td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>1比200</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4.00%</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>塑料石蜡膜（Parafilm）</td><td>BRAND GMBH + CO KG</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y-27632</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>SM02-100</td><td>5 &amp;micro;M 或 50 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>Corning Life Sciences</td><td>734-0451&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片（例如Superfrost Plus显微镜载玻片）</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>组织培养6孔板</td><td>Falcon</td><td>734-0019</td><td></td></tr><tr><td>组织培养24孔板</td><td>Falcon</td><td>734-0949</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附96孔脂质涂层板A-U96</td><td>Amsbio</td><td>AMS.51011610</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>Covance</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>Otx2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>ab9566</td><td></td></tr><tr><td>Emx1</td><td>Sigma</td><td>HPA006421</td><td></td></tr><tr><td>N-钙黏蛋白</td><td>BD</td><td>610921</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Life Tech</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化波形蛋白</td><td>Biozol</td><td>D076-3</td><td></td></tr><tr><td>Tpx2</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB500-179</td><td></td></tr><tr><td>乙酰化&amp;alpha;-微管蛋白&amp;nbsp;</td><td>NEB/CS</td><td>5335</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488抗小鼠</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488抗兔</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555抗小鼠</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555抗兔</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr></tbody></table>

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

人类大脑皮层高度扩展，具有复杂的结构和特定的功能区域，从而实现认知等高级脑功能。由于缺乏合适的模型系统，人类大脑皮层发育的研究受到限制。啮齿类动物研究结果向人类系统的转化受到物种差异的制约，而对人类原代组织的研究则因组织来源有限以及伦理问题而受阻。近年来人类多能干细胞（PSC）技术的发展包括建立了三维（3D）自组织的类器官培养系统，可在一定程度上模拟人类特有的脑发育过程in vitro。目前已有多种方案可用于生成全脑或特定脑区的类器官。本文所述方法为我们先前建立的、从诱导性多能干细胞（iPSC）生成均一且可重复的前脑型类器官的技术，该方法结合了PSC自组织的内在能力、向头端神经外胚层谱系的定向分化以及基质包埋以支持连续性神经上皮的形成。具体而言，该方案包括：（1）生成iPSC细胞聚集体，包括将iPSC克隆转化为融合的单层培养；（2）诱导形成头端神经外胚层；（3）将神经外胚层聚集体包埋于基质支架中；（4）从前脑神经外胚层聚集体生成前脑型类器官；以及（5）前脑型类器官的固定与验证。因此，该方案为in vitro生成标准化且可重复的iPSC来源皮层组织结构提供了一个易于应用的系统。

本文所述标准化的前脑类器官方案通常可在人源iPSC培养20天内，高效生成几乎完全为背侧皮层身份的高度均一的类器官培养物（方案概要见图1A）。建议在方案实施过程中设置多个质量控制节点，以判断是否继续实验，定义如下：“通过”（继续分化过程）和“不通过”（培养状态次优，建议终止该批次实验）（图1）。同时建议通过拍照和记录详细文档，对每个质量控制步骤进行充分记录。
生成前脑类器官的第一个关键步骤是使用高质量的iPSC细胞系进行起始培养。必须确保iPSC中不含较大量已分化的细胞。仅使用在起始种群中呈现为均一未分化细胞单层的iPSC培养物（图1B、C）。此外，必须严格按照规定的细胞数量进行iPSC聚集体的起始操作。首次对iPSC聚集体的详细检查应在第2天进行。此时，聚集体应已形成边缘光滑、结构致密的细胞芽（“通过”），而形态不规则或内部出现空腔的聚集体应予以弃用（“不通过”）（图1D、E）。下一个质量控制步骤应在方案的第10天进行。此时，细胞聚集体的外表面应呈现出光滑且光学透明的组织，表明神经外胚层已成功诱导（“通过”）；若缺乏此类组织，则提示神经诱导效果不理想（“不通过”）（图1F、G）。仅应将具有透明表面的聚集体（图1F）包埋至BME基质中。一旦包埋，皮质类器官将发育出连续的、环状神经上皮结构，并迅速扩张。在第15天和第20天通过检测类器官是否已形成极化神经外胚层来评估皮质诱导效率，如图1H、J所示（“通过”）。若类器官未形成此类神经上皮芽结构（如图1I、K所示的“不通过”情况），则需仔细回顾此前执行的质量控制步骤，以排查问题。若严格遵循本方案，可获得高度标准化的类器官批次（图2A、B），其在批次内及批次间极化神经外胚层形成的均一性可达≥90%（图2C）。导致极化神经外胚层形成效率不稳定的一个常见错误是增加iPSC聚集体的起始细胞数量，或使用低质量的iPSC培养物（如支原体污染的培养物或含有分化细胞的培养物）作为起始材料。
应在第20天对所生成类器官的端脑背侧身份进行详细验证。为此，应固定3个类器官并用于免疫荧光分析。分层的神经上皮环（图3A）表达神经干细胞标志物Sox2（图3B, D）、前脑标志物Pax6和Otx2（图3C, E）以及背侧皮层标志物Emx1（图3F）。这些皮层环的特征还包括N-钙黏蛋白和ZO-1在顶端的定位（图3G, H）、源自脑室区放射状胶质细胞（vRGC）的微管结构，该结构从结构的顶端延伸至基底端（图3I），以及位于顶端正在进行分裂的细胞，这些细胞对磷酸化波形蛋白（p-Vimentin，图3J）呈阳性染色。类器官结构内部可能出现细胞死亡现象。中心区域的凋亡属于正常现象，不会影响皮层组织的发育。此外，应使用另外3个类器官通过基因表达分析来评估该方案的一致性。前脑型类器官表达背侧前脑标志物（FoxG1、Otx2、Emx1），而中脑（FoxA2、Pax5）和后脑（HoxB2、HoxA4、HoxB4、HoxB6）标志物的表达则无法检测到（图3K）。
经过质量控制的类器官批次可用于多种应用，例如分析顶端放射状胶质细胞的分裂平面。为此，我们建议使用针对p-Vimentin和Tpx2的抗体进行双重染色（图3J）。p-Vimentin在有丝分裂期间被CDK1磷酸化，并定位于细胞核内，因此可标记所有处于有丝分裂阶段的细胞核16。Tpx2是一种微管相关蛋白，能够显示有丝分裂纺锤体以及在核间期迁移过程中的顶端突起17,18。利用这些标记物，原则上可分析vRGC分裂的三个方面：（I）细胞分裂是否发生在顶端侧；（II）分裂平面是垂直于顶端表面（提示对称分裂）、水平还是倾斜（提示不对称分裂）；（III）微管组织中心是否正常形成。
类器官还可进一步分化为更复杂、具有组织层次和分层结构的皮质组织。在第35 ± 2天的类器官中，皮质结构包含一个室管膜区（VZ）、内侧和外侧室下区（SVZ），以及类似皮质板（CP）的区域。在VZ以及内侧和外侧SVZ中，可识别出 ventricular radial glial cells（vRGCs）、中间前体细胞（IPs）以及类似于 outer radial glial cells（oRGCs）的细胞。此外，在类似皮质板的区域中可观察到初步形成的分层皮质结构：深层皮质神经元表达Tbr1和Ctip2，位于内部；上层皮质神经元表达Satb2，而Reelin表达细胞则位于外侧区域10。
<img alt="iPSC 细胞团分化；神经诱导至皮质类器官发育阶段示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：类器官培养方案的示意图及“可继续”与“不可继续”标准的图示。（A）方案的示意图。CI 培养基：皮质诱导培养基；CD 培养基：皮质分化培养基。（B–C）理想的90%汇合度的iPSC单层培养图像（B），以及出现分化现象因而不适宜使用的iPSC培养物（C）。（D–E）细胞聚集体在大小、细胞密度和表面形态上均理想的示例（D），以及两个“不可继续”的细胞聚集体示例：一个存在细胞稀疏和空腔（E，上部聚集体），另一个边缘不规则（E，下部聚集体），均为细胞聚集后两天的图像。（F–G）边缘透明且光滑的细胞聚集体（F），以及缺乏光学透明化的细胞聚集体（G）。黄色线框标示关注区域。（H–K）在第15天和第20天分别成像的、具有连续神经上皮样结构的优质类器官（H、J），以及未能形成径向有序神经外胚层结构的失败类器官（I、K）。比例尺：B–C 为 500 µm；D–K 为 200 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="类器官发育，光学图像 A-B，图表 C，比较iPSC神经上皮形成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：前脑型类器官培养方案的均一性与可重复性。（A-B）同一批次类器官在第15天（A）和第26天（B）的代表性明场图像。（C）第20天类器官的定量分析。统计显示在类器官外表面形成神经上皮的类器官数量，该结构在明场下表现为光学透明的表层组织，边界清晰，并可见放射状细胞结构（每种iPSC系n = 3，每次实验至少16个类器官）。比例尺，A-B：500 µm。误差棒表示±标准差（SD）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经类器官发育示意图；Sox2、Pax6 标记物；DAPI 染色；前脑、中脑分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：第 20 天前脑型类器官的验证。 （A-J）类器官的免疫细胞化学表征。类器官形成多个神经上皮环结构（A，DAPI 复染）。神经上皮环内分层排列的细胞表达神经干细胞标志物 Sox2（B, D）、前脑标志物 Pax6（C, D）和 Otx2（E），以及背侧前脑标志物 Emx1（F）。皮层环状结构在最顶端侧呈现清晰的黏附连接带，伴有 N-钙黏蛋白（G）和闭合小环蛋白 1（ZO-1；H）的聚集。室管膜放射状胶质细胞（RGCs）的微管网络（经乙酰化 α-微管蛋白，Ac-Tub 染色）从环结构的顶端延伸至基底端（I）。表达磷酸化波形蛋白（p-Vim）的增殖细胞位于顶端表面，有丝分裂纺锤体由 Tpx2 标记。右侧显示了垂直分裂面和水平分裂面的代表性高倍放大图像（J）。（K）在两个独立实验中，来自两条不同 iPSC 系的类器官在第 20 天时区域特异性转录因子的 RT-PCR 分析。FB：胎儿脑对照；AB：成人脑对照。比例尺：A-D 为 200 µm；E-I 为 10 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>表位</td>
			<td>稀释倍数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>1 - 300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Otx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emx1</td>
			<td>1 - 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>1 - 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Vimentin</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酰化 α-微管蛋白</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti ms</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 anti rb</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555 anti ms</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555 anti rb</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：第20天类器官质量控制所用抗体。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Otx2 正向</td>
			<td>tgcaggggttcttctgtgat </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Otx2 反向</td>
			<td>agggtcagagcaattgacca </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxG1 正向</td>
			<td>ccctcccatttctgtacgttt </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxG1 反向</td>
			<td>ctggcggctcttagagat </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emx1 正向</td>
			<td>agacgcaggtgaaggtgtgg </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emx1 反向</td>
			<td>caggcaggcaggctctcc </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxA2 正向</td>
			<td>ccaccaccaaccccacaaaatg </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxA2 反向</td>
			<td>tgcaacaccgtctccccaaagt </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax5 正向</td>
			<td>aggatgccgctgatggagtac </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax5 反向</td>
			<td>tggaggagtgaatcagcttgg </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HoxB2 正向</td>
			<td>tttagccgttcgcttagagg </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HoxB2 反向</td>
			<td>cggatagctggagacaggag </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HoxA4 正向</td>
			<td>ttcagcaaaatgccctctct </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HoxA4 反向</td>
			<td>taggccagctccacagttct </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HoxB4 正向</td>
			<td>acacccgctaacaaatgagg </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HoxB4 反向</td>
			<td>gcacgaaagatgagggagag </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HoxB6 正向</td>
			<td>gaactgaggagcggactcac </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HoxB6 反向</td>
			<td>ctgggatcagggagtcttca </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18s 正向</td>
			<td>ttccttggaccggcgcaag </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18s 反向</td>
			<td> gccgcatcgccggtcgg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：基因表达谱的引物及引物序列。

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in vitro。本文提供了从人类诱导多能干细胞高效生成均质背侧前脑型类脑器官的详细方法，包括关键的表征与验证步骤。

人类大脑皮层高度扩展，具有复杂的结构和特定的功能区域，从而实现认知等高级脑功能。

本实验的总体目标是从人类多能干细胞生成高度标准化且可重复的前脑类器官。该方法是研究新型发育机制的重要工具，尤其有助于解答与早期人类大脑皮层发生相关的关键科学问题。该技术的主要优势在于能够以标准化且高效的方式生成人脑皮层组织，且不同类器官之间以及不同批次类器官之间的差异较小。类器官技术可为研究人脑的发育、结构和功能提供重要信息，尤其适用于探索在低等物种脑模型中不存在的那些特征。为了生成多能干细胞聚集体，当干细胞培养达到70%至90%融合度时，向六孔培养板的一个孔中加入500 µL细胞解离试剂以使细胞脱离。经适应单层培养条件的诱导性多能干细胞是形成细胞聚集体的良好细胞类型，因为在解离和聚集体形成过程中，这类细胞较不易因应激而发生细胞死亡。在37摄氏度条件下轻轻敲击培养板5至10分钟，然后用2毫升DMEM/F-12培养基将细胞从孔底冲洗下来。将所得的细胞悬液转移至15毫升锥形管中，并用更多DMEM/F-12培养基将细胞悬液总体积补至10毫升。计数后，将每份多能干细胞聚集体含 4.5 × 10³ 个细胞转移至新的 15 毫升离心管中，通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于适量的多能干细胞培养基中，培养基中添加 50 µM ROCK 抑制剂，使细胞浓度达到每 150 µL 培养基含 4.5 × 10³ 个细胞。随后，将 150 µL 细胞悬液加入 96 孔低吸附 U 型底板的各个孔中，并将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。为监测前部神经外胚层诱导情况，每天应在低倍率下使用组织培养显微镜密切观察多能干细胞聚集体的形态变化。第1天应观察到边界清晰的细胞聚集体。第2天，小心吸出约三分之二的培养基，注意不要扰动各孔底部的细胞聚集体，并将弃去的培养基替换为100 µL新鲜的多能干细胞培养基。四到六天后，当细胞聚集体直径达到 350 至 450 微米，并呈现光滑边缘时，使用经改造的 100 微升移液枪头，将最多 20 个聚集体转移至一个六厘米的低吸附培养皿中，该培养皿内含有五毫升皮层诱导培养基。每三天更换一次新鲜的皮层诱导培养基，并在 4X 物镜下每天观察聚集体的形态变化。在皮层诱导培养基中培养四到五天后，细胞聚集体的边缘表面应开始变亮，表明神经外胚层分化，并出现假复层上皮的放射状结构组织。将神经外胚层聚集体包埋于基质支架中时，需先将基底膜提取物置于冰上解冻两至三小时。在提取物解冻过程中，使用无菌剪刀将塑料石蜡膜剪成每16个类器官对应一片4厘米×4厘米的正方形，将每片石蜡膜覆盖在空的100微升移液器吸头盒上。用戴着手套的指尖轻压石蜡膜，使其形成若干小凹陷，并用70%乙醇清洁石蜡膜表面。在密闭的无菌生物安全柜中经紫外线照射30分钟后，使用经改造的100微升移液枪头（开口直径为1.5至2毫米）将每个细胞聚集体转移至薄膜中的一个凹孔内。当所有聚集体均转移完毕后，使用未剪切的100微升移液枪头小心吸出每个凹孔中的培养基，并向每个细胞聚集体中加入40微升未稀释的基底膜提取物。操作过程中应避免剧烈操作或将类器官吸入移液枪头内，以免损伤正在发育的神经上皮结构。使用移液枪枪头将聚集体移至每滴液滴中央，用无菌镊子小心地将塑料石蜡膜片转移至一个10厘米的培养皿中。将培养皿放入培养箱中孵育15至20分钟。在提取物凝固的同时，向一个6厘米低吸附培养皿中加入5毫米新鲜皮层诱导培养基。孵育结束后，将石蜡膜片翻转，用无菌镊子轻轻将最多16个已聚合的液滴转移至每个六厘米培养皿中。然后将类器官聚集体放回细胞培养孵育箱。次日，将类器官培养皿转移至细胞培养孵育箱内的摇床上，以每分钟14转、五度倾斜角持续摇动，并每日进行倒置显微镜观察，直至聚集体达到目标分化阶段。第20天，使用经改造的、尖端开口为3至3.5毫升的一毫升移液器吸头，从聚集培养物中收集6个类器官。将其中3个类器官放入含有500微升PBS的24孔板的一个孔中，用5毫升移液器每次加入500微升新鲜PBS，洗涤类器官两次。第二次洗涤后，将类器官置于冰冷的4%多聚甲醛中固定15分钟，随后在室温PBS中洗涤三次，每次10分钟，最后在4摄氏度条件下于30%蔗糖溶液中过夜脱水。第二天，用1:50的台盼蓝稀释液对脱水的类器官进行预染色，持续10分钟，以便在冷冻切片过程中观察类器官；随后将蔗糖替换为新配制的包埋介质。将培养板置于60摄氏度的加热板上加热15分钟，使类器官在包埋介质中充分平衡。每个类器官对应一个包埋模具，用新鲜的包埋介质覆盖其底部。将模具置于冰上使包埋介质凝固，然后将类器官转移至包埋模具中，并加入新鲜包埋介质，直至完全覆盖每个类器官。然后将类器官置于100%乙醇与干冰配制的冷冻浴中速冻至少一分钟，随后使用冷冻切片机对每个类器官切取20 µm厚的切片，用于免疫细胞化学分析。为生成前脑型类器官，起始细胞群体中应仅使用呈现为未分化细胞均一单层的iPSC培养物。在第2天，细胞聚集体应已形成边缘光滑的致密细胞芽。第10天的细胞聚集体外表面应呈现光滑且光学透明的组织，表明神经外胚层已成功诱导。若严格按照本方案操作，将获得高度标准化的类器官批次，其批内和批间极化神经外胚层形成的均一性可达90%或更高。第20天类器官的免疫细胞化学分析显示，存在分层的神经上皮样结构，表达神经干细胞标志物Sox2、前脑标志物Pax6和Otx2，以及背侧皮层标志物Emx1。这些皮质样环状结构的特征还包括 N-钙黏蛋白和 ZO-1 在顶端的定位、由脑室区放射状胶质细胞衍生的微管结构，该微管从结构的顶端延伸至基底端，以及位于顶端且表达磷酸化波形蛋白的分裂细胞。为了分析顶端放射状胶质细胞的分裂平面，可对波形蛋白和 Tpx2 进行双重染色，Tpx2 是一种微管相关蛋白，可用于在核间期迁移过程中可视化有丝分裂纺锤体和顶端突起。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人多能干细胞中生成高度标准化且均一的前脑类器官。该技术利用一种以神经组织特异性方式排列的复杂三维细胞模型，有助于研究神经发育障碍中的人类特异性特征。掌握该技术后，这些皮质类器官可应用于多种研究，如神经发育、进化或基因功能研究，包括疾病建模以及潜在的药物筛选或治疗研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人诱导多能干细胞的前脑型脑 Organoids 标准化和可再生性的生成

该视频展示了一种利用诱导多能干细胞生成人脑类器官的方法。视频中展示了神经球如何形成神经外胚层，从而抑制其他胚层的形成。神经球被包埋在三维凝胶基质中，并形成神经上皮芽状结构。当在类器官培养基中孵育时，这些神经上皮芽进一步分化为特定的脑区，最终形成成熟的脑类器官。...

一种体外生成人脑类器官的方法

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。...

生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

本视频展示了将人类多能干细胞（hPSCs）转化为球形脑类器官的过程。通过使用特定的抑制剂，引导hPSCs向神经细胞谱系分化，形成神经外胚层样细胞集落。随后引入特殊的生长因子，促进这些细胞集落的自我组织与增殖，最终形成球形脑类器官。...

由人类多能干细胞生成球形体

本视频概述了利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成前脑类器官的过程，展示了从干细胞聚集体发育为模拟大脑皮层的复杂结构，并进一步分化为多种神经元类型的全过程。...

利用人诱导性多能干细胞生成前脑型脑类器官

模拟人类大脑发育一直受到神经上皮组织前所未有的复杂性的阻碍。本文介绍一种高效生成脑类器官的方法，用于解析人类大脑发育早期事件，并建立小头畸形模型。 体外 如上所述。...

生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。...

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。...

利用自制微型生物反应器由诱导性多能干细胞生成脑类器官

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

学习利用人诱导多能干细胞生成标准化前脑型脑类器官的方法，该技术可高效建立可重复的人类皮层组织模型，为研究早期大脑皮层发生机制及神经发育障碍提供可靠的体外三维培养系统。

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

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