Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

该程序的总体目标是从人类多能干细胞生成高度标准化和可重复的前脑型类器官。该方法是模拟新开发 NTZ 机制的强大工具。特别是，它可以帮助解决与早期人类皮层发生相关的关键问题。

该技术的主要优点是它允许标准化和省时地生成人类皮质组织，单个类器官和类器官批次之间的差异很小。类器官技术可以深入了解人脑的发育、结构和功能，尤其是那些在低等物种的大脑模型中没有的方面。为了产生多能干细胞聚集体，当干细胞培养物达到 70% 至 90% 汇合时，将 500 微升细胞解离试剂添加到 6 孔培养板的一个孔中以分离细胞。

适应单层培养条件的诱导多能干细胞是产生聚集体的良好细胞类型，因为它们在解离和聚集过程中不易发生应激诱导的细胞死亡。在 37 摄氏度下 5 到 10 分钟后，轻轻敲击板，并使用 2 毫升 DMEM/F-12 从孔底部洗涤细胞。将所得细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，并使用更多的 DMEM/F-12 培养基将细胞溶液的体积增加到 10 mL。

计数后，将每个多能干细胞聚集体的 4.5 倍 10 转移到新的 15 毫升试管中，然后通过离心收集细胞。我们将沉淀悬浮在适当体积的多能干细胞培养基中，补充有 50 微摩尔岩石抑制剂，以达到每 150 微升培养基浓度的 4.5 倍 10 至第三细胞。接下来，将 150 微升细胞添加到 96 孔低附着 U 形底板的各个孔中，并将板放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中。

为了监测前神经外胚层诱导，每天在低倍率下使用组织培养显微镜仔细观察多能干细胞聚集体的形态变化。第一天，应观察边界清晰的细胞聚集体。第二天，小心吸出大约三分之二的培养基，不要干扰每个孔底部的细胞聚集体，并用 100 微升新鲜多能干细胞培养基替换丢弃的培养基。

在 4 到 6 天后，当细胞聚集体直径达到 350 至 450 微米，并表现出光滑的边缘时，使用改良的 100 微升移液器吸头将多达 20 个聚集体转移到一个 6 厘米低的附着培养板中，该培养板含有 5 毫升皮质诱导培养基。每三天用新鲜培养基更换皮质诱导培养基，在 4X 目标下每天监测聚集体的形态。在皮质诱导培养基中 4 到 5 天后，细胞聚集体的边缘应在表面开始变亮，表明神经外胚层分化，并出现假复层上皮的放射状组织。

将神经外胚层聚集体嵌入基质支架中，在冰上解冻基底膜提取物 2 至 3 小时。当提取物解冻时，使用无菌剪刀将塑料石蜡薄膜切成每 16 个类器官一个 4 x 4 厘米的正方形，然后将每片薄膜放在一个空的 100 微升微量移液器吸头托盘上。用戴手套的指尖按压石蜡膜，使出现小凹痕，然后用 70% 乙醇清洁薄膜。

在密闭无菌生物安全柜中进行紫外线照射 30 分钟后，使用改良的 100 微升移液器吸头（开口为 1.5 至 2 毫米），将每个细胞聚集体转移到薄膜上的一个凹坑中。转移完所有聚集体后，使用未切割的 100 微升移液器吸头小心地从每个凹坑中吸出培养基，并向每个细胞聚集体中加入 40 微升未稀释的基底膜提取物。小心不要通过粗暴的作或吸入移液器吸头来损坏类器官，因为这会损坏发育中的神经上皮。

使用移液器吸头将聚集体定位到每滴的中间，并使用无菌镊子小心地将塑料石蜡薄膜片材转移到 10 厘米的培养皿中。将培养皿放入培养箱中 15 到 20 分钟。当提取物凝固时，将 5 毫米的新鲜皮质诱导培养基添加到一个 6 厘米低的附着培养皿中。

在孵育结束时，将石蜡薄膜片翻转过来，并使用无菌镊子轻轻地将多达 16 个聚合液滴挤入每个 6 厘米的培养皿中。然后将聚集体放回细胞培养箱中。第二天，将类器官培养皿转移到摇动的细胞培养摇床上，在细胞培养箱内以 14 rpm 的速度倾斜 5 度角，每天进行光学显微镜监测，直到聚集体达到感兴趣的分化阶段。

第 20 天，使用具有 3 至 3 毫升半开口的改良 1 毫升移液器吸头从聚集体培养物中收集 6 个类器官。将三个类器官放入含有 500 微升 PBS 的 24 孔板的一个孔中，并使用 5 毫升移液器用每次洗涤 500 微升新鲜 PBS 洗涤类器官两次。第二次洗涤后，将类器官固定在 4% 多聚甲醛的冷溶液中 15 分钟，然后在室温 PBS 中洗涤 3 次，每次 10 分钟，最后在 4 摄氏度的 30% 蔗糖溶液中脱水过夜。

第二天，用 1 至 50 台盼蓝稀释液对脱水的类器官预染 10 分钟，以便在冷冻切片过程中观察类器官，并用新鲜制备的包埋培养基替换蔗糖。在 60 摄氏度的加热垫上加热板 15 分钟，以平衡包埋培养基中的类器官，并用新鲜的包埋培养基覆盖每个类器官的一个包埋模具的底部。将模具放在冰上以固化包埋介质，将类器官转移到包埋模具中，并加入新的包埋介质，直到每个类器官被覆盖。

然后将类器官在 100% 乙醇干冰冷冻浴中休克冷冻至少一分钟，并使用低温恒温器获得每个类器官的 20 微米厚切片用于免疫细胞化学分析。要生成前脑型类器官，请仅使用在起始群体中表现为均质单层未分化细胞的 IPSC 培养物。第二天，聚集体应该形成具有光滑边缘的紧凑细胞芽。

第 10 天聚集体应在外表面显示光滑、光学光滑和光学半透明的组织，代表神经外胚层的诱导。如果严格遵循该方案，将生成高度标准化的类器官批次，这些批次在批次内和批次之间极化神经外胚层形成中表现出大于或等于 90% 的同质性。第 20 天类器官的免疫细胞化学分析揭示了表达神经干细胞标志物 Sox2、前脑标志物 Pax6 和 Otx2 以及背侧皮质标志物 Emx1 的分层神经上皮环。

这些皮质环的进一步特征是 N-钙粘蛋白和 ZO-1 的顶端定位，心室区放射状神经胶质细胞衍生的微管，从结构的顶端跨越到基底侧，以及位于顶端的分裂细胞，磷酸化波形蛋白染色呈阳性。为了分析顶端放射状神经胶质细胞的分裂平面波形蛋白和 Tpx2 双染色，可以进行一种微管相关蛋白，该蛋白可用于可视化有丝分裂纺锤体和动力学间核迁移期间的顶端过程。看完这个视频，你应该对如何从人类多能干细胞生成高度标准化和同质化的前脑型类器官有一个很好的了解。

该技术使用以神经组织特异性方式排列的复杂 3D 细胞模型，促进了对神经发育障碍的人类特异性方面的研究。一旦掌握了这项技术，这些皮质类器官就可以用于各种应用，例如神经发育、进化或基因功能研究，包括疾病建模和潜在的药物测试或治疗。