A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy
2017年12月29日
This protocol describes a flexible, low-cost system for measuring mouse ambulation in an open field activity assay. We show that a 6-minute ambulation assay based on this system detects a decrease in voluntary movement in mdx mice, and accurately distinguishes improvement in a muscle-specific rescue of these animals.
该测定的总体目标是测量肌营养不良小鼠模型中的自愿行走。这种方法可以帮助回答肌肉萎缩症领域关于肌肉萎缩症小鼠模型中肌无力进展以及潜在疗法有效性的关键问题。该技术的主要优点是它提供了一种非侵入性且可重复的动物活动测量，可以轻松适应许多不同的研究环境。
在一天中的一致时间，在安静的温度受控的房间里，将摄像头放在活动室上方的金属丝网上，以便在整个场地上进行录制，并用消毒剂清洁活动室。在记录活动之前，让鼠标抓住数字测力计的杆，然后轻轻向后拉，直到杆被释放。记录每次试验的峰值张力（以牛顿为单位）。
在试验之间休息一分钟。握力测定后，立即将鼠标放入腔室并开始视频录制，让小鼠自由探索。6 分钟后停止录制，并将鼠标放回其固定架。
要对视频数据进行跟踪分析，请首先在相应的视频编辑软件中打开录制内容，并将速度设置为两倍。将抽取的视频导出为 mp4 文件格式以进行跟踪分析，然后在相应的视频分析程序中打开视频。要设置视频录制的校准，请使用线条工具沿暗室的一侧绘制一条线。
右键单击该行，选择 Calibrate measure（校准测量），然后输入腔室侧面的实际尺寸（以厘米为单位）。要开始半自动跟踪鼠标位置，请单击移动光标。从视频中的初始帧开始，右键单击要跟踪的点。
跟踪点将用蓝色圆圈标记。使用键盘上的向右箭头前进框架。跟踪点应根据尾部底座的位置自动移动。
如果跟踪位置未与给定帧中的目标点对齐，请手动将蓝色圆圈与跟踪位置对齐。跟踪整个视频后，保存视频和描摹叠加，然后选择 导出到电子表格 导出描摹的位置数据。与类似分析报告的结果一致，在测试前立即用运动方案攻击的抗肌萎缩蛋白无效 mdx 小鼠在 6 分钟的旷场测试中表现出比野生型动物显着更少的自主运动。
事实上，在握力挑战的轻微用力之后，mdx 小鼠通常在行走方案的前几分钟保持静止，并在 4 到 5 分钟时适度增加运动。然而，当比较野生型动物和 mdx 动物时，没有检测到行进距离的差异。用于肌营养不良蛋白表达的转基因 Mdx 小鼠与野生型动物没有区别，在总行进距离或观察到的任何模拟时间点上没有显着差异。
为了确定降低采样率的效果，测量了一分钟全帧速率视频传输的总距离，并与从数据集的下采样版本得出的距离测量值进行了比较。将帧速率降低一半会使测量距离减少原始计算距离的 5%。在此之后，测量距离的准确性急剧下降，尽管即使是高度抽取的数据集仍然非常接近动物的路径，这凸显了在评估动物活动时考虑帧速率和信号处理的重要性，并证明了在下采样视频数据中可以保留高空间分辨率。
观看此视频后，您应该对如何在旷野环境中记录和分析小鼠移动有很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，该分析可以在 15 到 30 分钟内完成。这种低成本和非侵入性的检测方法使研究人员能够检查肌肉萎缩症小鼠模型中的运动活动，并且可以作为进一步功能测量的信息丰富的第一步。
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概述
本方案描述了一种灵活且低成本的小鼠在开放场地活动实验中测量其行走行为的系统。该方法可对动物活动进行无创且可重复的测量，并可适用于多种研究环境。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肌营养不良症研究
- 行为分析
背景
- 该检测方法用于测量肌营养不良小鼠模型的自主行走能力。
- 它可解答有关肌肉无力进展的关键问题。
- 该技术旨在评估潜在治疗手段的有效性。
- 记录在受控环境中进行，以确保结果的一致性。
研究目的
- 测量 mdx 小鼠的自主运动能力。
- 评估肌肉特异性干预措施的影响。
- 为肌营养不良症的进展提供见解。
使用的方法
- 使用位于活动室上方的摄像机进行记录。
- 试验前用消毒剂清洁活动室。
- 让小鼠抓紧一根杆状物以测量最大张力。
- 通过持续6分钟的自主活动实验记录行为数据。
主要结果
- 该系统可检测到 mdx 小鼠自主运动的减少。
- 它能准确区分因肌肉特异性挽救所带来功能改善。
- 不同实验间结果具有可重复性。
- 该方法可适用于多种研究环境。
结论
- 该检测方法适用于研究小鼠的肌肉营养不良症。
- 它可提供有关潜在治疗方法有效性的宝贵数据。
- 该方法具有灵活性，可在多种研究环境中应用。
常见问题
行业重要性概述
在小鼠模型中测量自主行走能力可为肌营养不良症的运动功能提供具有转化意义的读数，与临床终点（如6分钟步行试验）直接对应。这种低成本、基于视频的检测方法能够对疾病进展和治疗反应进行可重复、非侵入性的评估，适用于临床前研究。通过检测抗肌萎缩蛋白缺失的mdx小鼠的活动能力缺陷以及通过utrophin表达实现的功能恢复，该方法可支持神经肌肉疾病药物研发中的靶点验证和作用机制的风险评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化杜氏肌营养不良模型中自主行走这一肌肉力量的功能性读数，验证治疗假设。
- 操作价值：通过在mdx小鼠与野生型及恢复型队列之间建立可重复的基因型-表型关联，实现生物学风险降低。
- 预测价值：通过区分能够使活动水平恢复正常至野生型水平的有效干预措施（例如，utrophin转基因），支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：利用标准化的开放场运动指标，准备经过验证的生物系统，用于后续化合物筛选。
- 可重复性：提供基于距离和时间的定量输出结果，适用于在不同实验室之间进行检测标准化。
- 可扩展性：依托免费的开源软件和易于获取的硬件，可在多种研究环境中重复使用该平台，无需依赖专用设备。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：模拟与患者相关的行走功能缺陷，实现从发现到临床前验证的转化连续性。
- 机制性风险排除：明确观察到的作用效应是源于肌肉特异性功能恢复，还是源于非特异性的活动变化。
- 基于风险的决策：通过将行走功能恢复与靶点结合及通路调控相关联，为“继续/终止”决策提供依据。
流程与工作流整合
该检测适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现过程，为肌营养不良模型中分子机制与表型结果之间提供功能性桥梁。
- 发现生物学：通过将遗传或药物干预与自主运动的可测量变化关联，支持假设验证。
- 筛选：通过可重复的基于视频的追踪，实现检测就绪，生成可用于化合物评估的定量行走终点指标。
- 分析：生成位置和时间数据流，使研究团队能够比较不同基因型、处理方式和时间点之间的运动活动。
- 转化研究：通过模拟临床行走评估，连接临床前研究的连续性，促进生物标志物对齐和预测建模。
- 企业级复用：建立一种可复用、低成本的行走测试能力，减少对专业核心设施的依赖。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低运动功能检测中机制上的模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过开源追踪技术和受控的环境条件，增强实验的标准化和可重复性。
- 战略价值：在保持数据质量的同时，无需依赖昂贵的运动追踪系统，从而提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于临床前模型中行走表型功能恢复的结果，支持进行风险调整后的推进决策。
实施注意事项
- 需要具备视频录制和开源追踪软件操作的基本专业知识（例如，手动逐帧对齐）。
- 依赖标准成像设备以及稳定的环境控制条件（光照、温度、一天中的时间）。
- 需要各团队严格遵循统一的操作规程，以确保不同实验地点和操作人员之间的可重复性。
- 需根据不同的实验箱尺寸、小鼠品系和活动水平进行适应性调整。
- 在帧率与测量准确性之间存在权衡，因降低采样率会减少距离计算的精度。
