一种基于动力学荧光的 Ca^{2 +}动员法, 用于识别 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗器和构调制器

这种基于细胞的测定的总体目标是识别和表征能够刺激或抑制 G 蛋白偶联受体介导的细胞内钙动员的分子。该方法可能是 G 蛋白偶联受体药物发现的有价值的检测方法，因为它可用于筛选修饰受体介导的细胞内钙小体的分子。该技术的主要优点是它允许在同一测定中鉴定具有激动性或拮抗性特性的分子。

该测定可能有助于发现作用于 G 蛋白偶联受体的新型候选药物，这些受体有望在许多人类疾病中发挥作用的治疗靶点。在细胞传代当天，用 100 微升 0.1% 明胶溶液包被底部透明的黑壁聚苯乙烯 96 孔板的每个孔，并在室温下孵育板两小时。当明胶凝固时，使用胰蛋白酶 EDTA 溶液将目标细胞从培养瓶底部提起，分离后将细胞重悬于 50 mL 锥形管中的新鲜生长培养基中。

计数后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜生长培养基中，至每毫升浓度的 1 倍 10 至 5 个活细胞。板准备好后，丢弃任何多余的明胶溶液，并在实验室纸巾上擦干板。然后用 200 微升 PBS 洗涤孔，并用每孔 200 微升细胞代替洗涤液，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。

第二天早上，轻敲板以丢弃孔中的生长培养基，并在纸巾上将板倒置擦干。然后用每孔 100 μL 上样染料溶液标记每个孔中的细胞，并在室温下避光孵育板 45 分钟。当细胞孵育时，每孔向趋化因子板中加入 75 μL CXCL12，向化合物板的每个孔中加入 50 μL 目标化合物。

接下来，打开荧光读板器的冷却器单元，然后打开读板器本身。让系统启动几分钟后，打开 Plate Reader 软件。要设置检测方案，请在设置选项卡下选择读取模式以及上样染料的适当激发和发射波长。

选择"与转移液混合"选项卡，以自动混合复合板中的化合物。在转移液选项卡中，从复合板的每个孔中设置 20 微升，以转移到测量板中，并将移液器吸头放置在液体表面以下 20 微升处。将吸液速度设置为每秒 50 微升，将分配速度设置为每秒 25 微升，然后单击传输流体的读取。

在第一个间隔期间，选择 60 个读数，读数间隔时间为 1 秒，在将化合物分配到测量板之前记录 10 个读数，之后完成 50 个读数。将第二个间隔设置为 30 秒和 18 次读取的读取间隔时间。为方案选择 3 次吸头清洗，将每个清洗步骤设置为包括适当的清洗液、1 次清洗周期、快速泵速和每次洗涤 5 次冲程。

使用暂停移液器功能包括 300 秒的移液器暂停，并使用与转移液混合设置，以允许在趋化因子板内自动混合 CXCL12 溶液。在随后的转移液选项卡中，从趋化因子板的每个孔中设置 25 微升，以转移到测量板，并将吸头放置在液体表面以下 20 微升处。将吸液速度设置为每秒 50 微升，将分液速度设置为每秒 25 微升。

使用传输液读取按钮将第一个间隔设置为包括 145 次读取，读取间隔时间为 1 秒。将第二个间隔设置为 6 秒和 20 次读取的读取间隔时间。再选择 3 个洗涤吸头循环。

然后单击 set stage temperature 并将设备温度设置为 37 摄氏度。在上样染料孵育结束时，丢弃测量板中的缓冲液，并在实验室组织上干燥板。用每孔 150 μL 的检测缓冲液洗涤细胞，两分钟后用 80 μL 的检测缓冲液代替缓冲液。

将测量板置于读取位置，复合板置于源 2 位置，趋化因子板置于源 3 位置，一盒黑色尖端置于源 1 位置。关闭设备并单击协议信号测试以确定板上的背景相对光单位和荧光变化。在弹出窗口中选择 test signal。

如果获得的背景值为 8， 000 到 10， 000 个相对光单位，请选择 update 并单击 save 以保存主协议。然后按 run 开始检测。在该图中，可以观察到与钙释放的剂量依赖性增加相关的荧光剂量依赖性增加。

CXCL12 诱导的荧光水平的增加允许根据添加趋化因子后的第一次测量与方案中的最终测量之间基线的最小和最大响应之间的差异生成剂量反应曲线。当使用缺乏相应功能性趋化因子受体 CXCR4 的细胞时，即使在高浓度下，CXCL12 也不会诱发荧光钙相关反应，这表明 CXCL12 诱发测量的受体特异性。这种基于细胞的测定的一个关键应用是鉴定小分子，与不抑制反应的对照非活性化合物相比，预孵育后剂量依赖性地抑制 CXCL12 诱导的细胞钙动员。

为了确定小分子的抑制效力，可以使用非线性回归为抑制分子生成剂量反应曲线。该测定可用于研究其他 G 蛋白偶联受体，无需或仅进行极少的进一步优化，以及在该实验中，当另一种趋化因子受体 CCR5 用其天然趋化因子激动剂 CCL5 刺激时，观察到荧光的剂量依赖性增加。一旦掌握，该技术可用于研究许多其他 G 蛋白偶联受体，这些受体在受体激活时通过动员细胞内钙离子发出信号。

观看此视频后，您应该对如何使用这种细胞检测来识别 CXCL4 趋化因子受体的激动剂和拮抗剂有很好的了解。