一种基于动力学荧光的 Ca²⁺ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

本细胞实验的总体目标是鉴定并表征能够刺激或抑制G蛋白偶联受体介导的细胞内钙离子动员的分子。该方法可作为G蛋白偶联受体药物发现中一种有价值的检测手段，因为它可用于筛选能够调节受体介导的细胞内钙信号分子的化合物。该技术的主要优势在于，可在同一实验体系中识别具有激动或拮抗特性的分子。

该检测方法可能有助于发现作用于G蛋白偶联受体的新型候选药物，这类受体是许多人类疾病中具有潜力的治疗靶点。在细胞传代当天，用100微升0.1%明胶溶液包被黑色壁透明底的聚苯乙烯96孔板的每个孔，并在室温下孵育两小时。在明胶凝固的同时，使用胰蛋白酶EDTA溶液将目标细胞从培养瓶底部消化下来，待细胞脱落后，将其重悬于50毫升锥形管中的新鲜培养基中。

计数后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，调整浓度至每毫升含1×10⁵个活细胞。当培养板准备就绪后，弃去多余的明胶溶液，并将培养板置于实验用纸巾上干燥。随后，用200 µL PBS洗涤各孔，并更换为每孔200 µL细胞悬液，在37°C、5%二氧化碳条件下过夜培养。

第二天早上，轻敲培养板以弃去各孔中的培养基，并将培养板倒置在纸巾上晾干。随后，每孔加入 100 微升染料加载液对细胞进行标记，并在室温下避光孵育 45 分钟。在细胞孵育的同时，向趋化因子板的每孔中加入 75 微升 CXCL12，向化合物板的每孔中加入 50 微升目标化合物。

接下来，先开启荧光酶标仪的制冷单元，然后开启酶标仪本身。待系统启动几分钟后，打开酶标仪软件。在“设置”选项卡中，选择读数模式以及与加载染料相对应的合适激发波长和发射波长，以建立检测方案。

选择“使用转移液体”选项卡，以实现化合物板中化合物的自动混合。在“转移液体”选项卡中，设置从化合物板的每个孔转移 20 微升至检测板，并将移液吸头位置置于液面以下 20 微升处。设定吸液速度为 50 微升每秒， dispense 速度为 25 微升每秒，然后点击“使用转移液体读取”。

在第一个时间段内，设置读取间隔时间为1秒，共读取60次，其中在化合物加入检测板之前记录10次读数，之后完成50次读数。第二个时间段设置读取间隔时间为30秒，共进行18次读数。为该实验方案选择三次吸头清洗，每次清洗步骤均需包含相应的清洗液、一个清洗循环、快速泵速以及每次清洗进行五次往复运动。

使用移液器暂停功能，设置移液器暂停时间为300秒，并启用转移液体时混合的设置，以实现趋化因子板内CXCL12溶液的自动混合。在随后的转移液体选项卡中，设置从趋化因子板的每个孔中转移25 µL至检测板，并将吸头置于液面以下20 µL处。设定吸液速度为50 µL/s，分配速度为25 µL/s。

使用“读取并转移液体”按钮，将第一个区间设置为包含145次读数，读数间隔时间为1秒。将第二个区间设置为读数间隔时间6秒，共20次读数。选择再进行三次洗针循环。

然后点击设置孵育温度，并将设备温度设为 37 摄氏度。染料孵育结束后，弃去检测板中的缓冲液，并将检测板在实验纸巾上干燥。用每孔 150 微升的检测缓冲液洗涤细胞，两分钟后更换为每孔 80 微升的检测缓冲液。

将测量板放入读取位置，化合物板放入源2位置，趋化因子板放入源3位置，一盒黑色吸头放入源1位置。关闭设备，点击“协议信号测试”以测定板上的背景相对光单位和荧光变异。在弹出窗口中选择“测试信号”。

如果获得的背景值为 8,000 至 10,000 相对光单位，则选择“更新”并点击“保存”以保存主方案。然后按下“运行”以开始检测。在此图中，可观察到荧光信号呈剂量依赖性增强，这与钙离子释放的剂量依赖性增加相对应。

CXCL12诱导的荧光信号强度逐渐增加，可基于趋化因子添加后第一次测量与实验方案最终测量之间相对于基线的最小和最大反应差值，绘制剂量-反应曲线。当使用缺乏相应功能性趋化因子受体CXCR4的细胞时，即使在高浓度下，CXCL12也无法引发任何与钙离子相关的荧光反应，这证明了CXCL12诱导信号检测的受体特异性。该细胞实验的一个关键应用是鉴定小分子化合物：与作为对照的无活性化合物（不抑制反应）相比，这些小分子在预孵育后能够以剂量依赖方式抑制细胞中CXCL12诱导的钙离子动员。

为了确定小分子的抑制效力，可以使用非线性回归分析为抑制性分子生成剂量-反应曲线。该检测方法也可用于研究其他G蛋白偶联受体，通常无需或仅需极少的进一步优化；例如，在本实验中，当另一种趋化因子受体CCR5被其天然趋化因子激动剂CCL5刺激时，观察到荧光信号呈剂量依赖性增强。一旦掌握该技术，便可用于研究多种其他通过受体激活后胞内钙离子动员进行信号传导的G蛋白偶联受体。

观看本视频后，您应充分了解如何利用该细胞检测方法鉴定 CXCL4 趋化因子受体的激动剂与拮抗剂。