Name: Zika 病毒特定诊断表位发现 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 了解利用高密度肽微阵列技术鉴定寨卡病毒特异性诊断表位的方法。该技术可检测血清中的IgM和IgG抗体，为临床医生提供感染时间线，并可应用于其他已知蛋白质序列的病原体诊断。

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本项目目前获得美国国家儿童健康与人类发展研究所（NIDCRR44 DE024456）的小企业创新研究（SBIR）行政补充资助。该资助源自NIDCR关于HIV的U01 DE017855资助项目，旨在开发一种用于HIV的确认性即时诊断检测方法。我们衷心感谢德国海德堡PEPperPRINT公司的Silke Weisenburger在技术方面提供的协助与大力支持。同时，我们感谢纽约大学朗格尼医学中心提供LI-COR Odyssey成像系统。

这些数据来自纽约大学牙医学院开展的一项正在进行的研究，已获得纽约大学医学院机构审查委员会（IRB # H10-01894）的批准。本研究使用的临床样本为去标识化的样本，此前已用于诊断，并获得了纽约州卫生部沃兹沃思中心（位于纽约州奥尔巴尼）的使用许可。
1. 将寨卡病毒高密度肽微阵列芯片安装至特定孵育托盘中
<ol>
	<li>使用无粉手套仅触碰载玻片边缘进行操作。载玻片尺寸为 75.4 mm × 25.0 mm，厚度为 1 mm。将载玻片放入孵育盘中，确保微阵列表面朝上。</li>
	<li>将密封垫的光面朝下，覆盖在微阵列表面。为确保位置准确，需使密封垫上的螺孔与底板上的螺孔对齐重合。</li>
	<li>将孵育盘上部置于密封垫上，形成微阵列反应室。</li>
	<li>用手以对角交替顺序依次均匀拧紧螺钉，起始于左上方，随后为右下方，逐个旋紧以固定载玻片。盖上孵育盘的盖子。</li>
</ol>
2. 背景相互作用检测：用二抗染色微阵列
注意：使用移液器将溶液（标准缓冲液和封闭缓冲液、稀释的二抗）滴加到芯片室的角落。
<ol>
	<li>将微阵列置于标准缓冲液（1×磷酸盐缓冲液（PBS），0.05% Tween 20，pH 7.4，经0.45 µm滤膜过滤）中孵育，每张微阵列总体积为2,000 µL，在室温（RT）下以140 rpm转速于摇床上孵育15分钟。</li>
	<li>用移液器从微阵列腔室的角落吸除标准缓冲液。在空的载片架中放入空白载片，以防止微阵列载片破损。</li>
	<li>用封闭缓冲液（每张微阵列总体积为2,000 µL）在室温（RT）下以140 rpm转速于摇床上封闭微阵列60分钟。</li>
	<li>用移液器从微阵列腔室的角落吸除封闭缓冲液。</li>
	<li>将微阵列与二抗（抗人IgM荧光染料偶联抗体）在染色缓冲液（标准缓冲液中含10%封闭缓冲液）中按1:5,000稀释后孵育，每张微阵列总体积为2,000 µL，在室温（RT）避光条件下以140 rpm转速于摇床上孵育30分钟。</li>
	<li>用移液器从微阵列腔室的角落吸除二抗溶液。</li>
	<li>用标准缓冲液洗涤微阵列3次，每次1分钟，每次洗涤使用2,000 µL缓冲液，在室温下以140 rpm转速于摇床上进行。每次洗涤后，用移液器从微阵列腔室的角落吸除标准缓冲液。</li>
	<li>将载片浸入新配制的浸洗缓冲液（1 mM Tris，pH 7.4）中两次，每次浸洗总体积为200 mL。</li>
	<li>小心吸除载片表面多余的液体，从载片顶部到底部进行操作，避免接触载片表面，轻柔干燥约1分钟。随后将载片放入微阵列扫描仪中进行分析。</li>
</ol>
3. 将微阵列暴露于宿主血清中
注意：由于血清样本可能具有传染性，该步骤必须在实验室安全条件下于生物安全二级（BSL-2）环境中进行，并在II级生物安全柜（BSC）内操作。
<ol>
	<li>在56 °C下灭活血清样本30分钟，并在4 °C下以16,000 rcf离心5分钟13。 
	注意：使用移液器将溶液（染色液、标准缓冲液和稀释后的血清）从微阵列腔室的角落加入。</li>
	<li>用染色缓冲液稀释血清样本，起始稀释比例为1:1,000（总体积为2,000 μL/微阵列）。稀释后保存于4 °C，待用。</li>
	<li>将微阵列在室温下置于染色缓冲液中孵育15分钟，置于140 rpm的旋转摇床上（总体积为2,000 μL/微阵列）。</li>
	<li>用移液器从微阵列腔室的角落吸出染色缓冲液以去除。</li>
	<li>将微阵列与稀释后的血清样本在4 °C下孵育过夜，置于140 rpm的旋转摇床上（总体积为2,000 μL/微阵列）。</li>
	<li>用移液器从微阵列腔室的角落吸出稀释后的血清样本以去除。</li>
	<li>用标准缓冲液清洗微阵列3次，每次1分钟（每次使用2,000 μL/微阵列，室温下置于140 rpm的旋转摇床上）。每次清洗后，用移液器从微阵列腔室的角落吸出标准缓冲液。</li>
</ol>
4. 使用二抗和标记对照抗体进行染色
注意：使用移液器将溶液（标准缓冲液、稀释的二抗和标记抗体）滴加到微阵列腔室的角落。
<ol>
	<li>用染色缓冲液稀释二抗。 
	注意：使用荧光染料标记的抗人IgM抗体或抗人IgG抗体，按1:5,000稀释（每张微阵列总体积为2,000 µL）加入染色缓冲液中。</li>
	<li>将对照标记抗体（单克隆荧光染料标记抗HA抗体）按1:1,000稀释（每张微阵列总体积为2,000 µL）加入染色缓冲液中，并与先前用染色缓冲液稀释的二抗混合。</li>
	<li>在室温避光条件下，于140 rpm的振荡器上孵育30分钟。</li>
	<li>用移液器从微阵列腔室的角落吸出已稀释的二抗和标记抗体混合液。</li>
	<li>用标准缓冲液洗涤3次（每张微阵列每次总体积为2,000 µL），每次在140 rpm振荡器上洗涤1分钟。每次洗涤后，用移液器从微阵列腔室的角落吸出标准缓冲液。</li>
</ol>
5. 芯片扫描
<ol>
	<li>将载玻片浸入新配制的浸渍缓冲液（1 mM Tris，pH 7.4）中两次（总体积为 200 mL）。</li>
	<li>小心干燥微阵列，时间约为 1 分钟，从载玻片顶部到底部极其轻柔地抽吸液体，避免接触载玻片表面。</li>
	<li>按照扫描仪的说明对微阵列进行扫描。将载玻片放置在扫描仪上时，确保打印面朝上。</li>
	<li>创建一个新项目并选择扫描区域。设置扫描仪参数如下：分辨率为 21 µm，700 nm 和 800 nm 两个通道的强度均为 7.0，扫描质量为中等，偏移量为 0.8。</li>
	<li>获取扫描原始图像，并将其保存为 16 位灰度 TIFF 文件格式。</li>
</ol>
6. 使用特定软件进行微阵列分析
<ol>
	<li>打开原始图像（TIFF 图像）。打开阵列网格文件。</li>
	<li>使用计算机的鼠标或键盘方向键将阵列网格与扫描图像对齐。</li>
	<li>在特定软件中选择 &#34;定量分析选中区域&#34;，该操作将生成一个读出文件，其中包含每个点的信号强度、背景值以及对应的肽序列。 
	注意：此输出文件也可导入电子表格程序，用于进一步分析和绘图。</li>
</ol>
7. 微阵列储存
<ol>
	<li>将微阵列在无氧氮气或氩气环境中密封，避光保存于 4 °C。</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
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<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
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<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们设计了一项实验方案，利用包含寨卡病毒全蛋白序列（法属波利尼西亚株）的高密度肽微阵列。该微阵列通过点样3,423种不同的重叠线性肽制备而成，每种肽段长度为15个氨基酸，相邻肽段在序列上仅有一个氨基酸残基的差异。即，14个残基重叠）。尽管可以打印较短的重叠片段，但较长的重叠片段可使表位定位更加精确。每种多肽均打印两次以提高可靠性。
实验开始前，必须先用二抗对微阵列进行预染色，以检测可能存在的背景信号，并将其与样本特异性信号区分开来。使用特定的封闭缓冲液也至关重要，因为其他封闭剂（如牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉）可能导致信号强度降低。一份经验证含有ZIKV IgM抗体的血清样本最初以1:1,000稀释度与微阵列孵育，但未检测到信号。随后将稀释度降低至1:500，结果在与样本中IgM抗体发生反应的肽段上观察到微弱信号。当经验证的寨卡病毒（Zika）血清样本稀释至1:250时，获得了最佳结果。为避免背景信号增强，未再使用更高浓度的血清样本进行重复测试。操作微阵列时需格外小心，以防刮伤其表面。因此，稀释后的血清和标准缓冲液等溶液应从微阵列反应室的角落加入和移除。另一个...

基于临床症状诊断寨卡病毒（ZIKV）感染具有挑战性，因为其传播媒介、地理分布和症状与登革病毒和基孔肯雅病毒感染相似1。鉴于孕妇在妊娠期间感染ZIKV可能导致不良妊娠结局，区分这三种病毒尤为重要。尽管现有的分子诊断检测具有特异性，但仅在急性感染期相对较短的时间内对血液或唾液样本有效2,3。因此，在感染初期之后，血清学检测对于诊断至关重要4。
开发针对寨卡病毒（ZIKV）的特异性血清学检测方法面临两个挑战：第一，目前尚不清楚人类免疫系统所识别的寨卡病毒抗原；第二，黄病毒属中保守的氨基酸序列会引发抗体交叉反应。我们的目标是发现可用于诊断的ZIKV特异性多肽。已有多种方法被用于筛选覆盖整个蛋白质的多肽文库，包括噬菌体、细菌和酵母表面展示技术5,6,7,8,9,10。我们的策略是采用高密度多肽微阵列，该技术可实现快速、低成本的高通量血清学筛查11,12，随后可将鉴定出的多肽用于改进现有的ZIKV感染血清学检测方法。
该方案利用高密度肽微阵列技术，实现寨卡病毒特异性诊断肽的发现图1）。高密度肽微阵列采用肽激光打印技术制备。基于法属波利尼西亚毒株（GenBank: KJ776791.2）的ZIKV全长蛋白序列，共包含3,423个氨基酸残基，以每段15个线性氨基酸残基为单位，相邻肽段间重叠14个氨基酸残基，重复打印于标准玻片上，共形成6,846个肽点。除Zika病毒全长蛋白序列肽段外，该微阵列还包含流感病毒血凝素（Influenza hemagglutinin） （HA）肽作为内参对照。
使用来自瓦兹沃思中心（纽约州奥尔巴尼）的经验证为寨卡病毒阳性的血清样本，以鉴定特异性的免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）反应性肽段。将微阵列与样本在4℃孵育过夜后，用荧光染料标记的二抗（抗人IgM或抗人IgG）进行染色，并在微阵列扫描仪上进行分析。斑点信号强度的定量及肽段注释采用微阵列制造商提供的专用软件完成。

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP 定制多肽微阵列</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>定制多肽微阵列：我们的微阵列包含完整的寨卡病毒蛋白序列</td></tr><tr><td>PEPperCHIP 孵育槽 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>PEPperCHIP 染色试剂盒（680 nm）（抗 HA，DyLight 标记）</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide 分析仪</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>14 天免费 Windows 许可证</td></tr><tr><td>Rockland 封闭缓冲液</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>抗人 IgM（μ 链）DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>抗人 IgG Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey 成像系统</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床设备</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 数字微孔板摇床</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

寨卡病毒特异性诊断表位发现

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

高密度肽微阵列可在单个标准显微镜载玻片上同时筛选六千多种以上的肽。该方法可用于药物发现、治疗靶点鉴定以及诊断技术的开发。本文介绍了一种利用高密度肽微阵列发现特异性寨卡病毒（ZIKV）诊断肽的实验方案。将经确认感染寨卡病毒（ZIKV）的人血清样本与高密度肽微阵列共同孵育，该微阵列包含由整个ZIKV蛋白序列转化而来的3,423种独特的15个线性氨基酸（aa）残基肽段，相邻肽段间具有14个氨基酸残基的重叠，并以双份形式点样。在同一微阵列上使用不同的二抗进行染色，检测到可与血清中存在的免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）抗体结合的肽段。这些肽段被选中用于后续验证实验。本方案中，我们详细描述了高密度肽微阵列的设计、处理及分析策略。

使用所述方案获得的结果如图2 和图3所示。在使用二抗抗人IgM对微阵列进行预染色时，未观察到背景相互作用（数据未显示）。使用抗人IgM偶联物染色后，多个区域的绿色荧光强度高于背景，表明这些肽段与宿主血清样本中的IgM发生了结合（图2）。IgG检测（红色荧光信号）仅显示出少数几个肽段（图2）。
由同一微阵列制造商提供的专用软件在扫描后对微阵列进行分析。生成的读出文件包含每个点的信号强度、背景值以及对应的肽序列。通过绘制从原始值中减去背景后获得的绿色前景中位数值，可将对IgM有强烈反应的每种肽的点荧光强度可视化（图3）。...

在本实验方案中，我们描述了一种利用高密度肽微阵列发现寨卡病毒特异性诊断肽的技术。该方案可 readily 适用于其他新发传染病的研究。

高密度多肽微阵列可在单个标准显微镜载玻片上同时筛选六千多种多肽。该方法可应用于……

本实验的总体目标是鉴定可用于检测寨卡病毒抗体诊断检测中的寨卡病毒特异性肽段。这一点至关重要，因为病毒在感染后约10天内即从血液中消失，而抗体则可持续存在数年。该方法利用包含整个寨卡病毒蛋白质组的微阵列，鉴定能够捕获感染者血清样本中IgM或IgG抗体的抗原和表位肽段。同时检测早期抗体IgM和晚期抗体IgG的主要优势在于为临床医生提供感染的时间线，这一点在孕妇中尤为重要。尽管本方案揭示了寨卡病毒感染的原因，但若已知病原体的蛋白质序列，则可通过使用针对该病原体的特异性微阵列，将此方法应用于其他病原体的检测。使用无粉手套捏住玻片边缘进行操作。玻片尺寸为75.4毫米 × 25.0毫米，厚度为1毫米。将玻片放入孵育托盘中，确保微阵列表面朝上。在空的载片架中放入空白载片，以防止微阵列载片破裂。将密封条的光面朝下，覆盖在微阵列打印面上。为确保位置准确，需使密封条的螺丝孔与底板的螺丝孔对齐重叠。将托盘上部放在密封垫上，形成一个微阵列反应室。通过手动以对角顺序依次均匀拧紧螺钉，将载玻片固定在托盘中。从左上角开始，逐步进行到右下角。将盖子盖在孵育托盘上。操作微阵列时需小心谨慎，以避免划伤微阵列表面。溶液应从微阵列腔室的角落加入，随后也从角落移除。干燥微阵列对于获得良好的扫描图像也非常重要。将微阵列置于旋转摇床上，每张微阵列加入2,000 µL标准缓冲液，在室温下以140 rpm孵育15分钟。用移液器从微阵列腔室的角落吸除标准缓冲液，然后在室温下以140 rpm的转速于旋转摇床上用封闭缓冲液封闭微阵列60分钟。用移液器从微阵列腔室的角落吸出封闭缓冲液。将抗人IgM荧光染料标记的二抗用染色缓冲液按1:5,000比例稀释后加入微阵列中。然后将微阵列置于室温避光条件下，在140 rpm的振荡器上孵育30分钟。使用移液器从微阵列腔室的角落吸取并移除二抗。在室温下，将微阵列置于摇床上，以每微阵列2000 µL标准缓冲液、140 rpm振荡洗涤1分钟。使用已展示的技术移除标准缓冲液，并重复洗涤两次。接下来，将玻片浸入200毫升 freshly prepared dipping buffer 中两次。通过从玻片顶部到底部小心抽吸多余液体（避免接触玻片表面），仔细干燥微阵列约一分钟。随后按照本视频稍后演示的方法，在微阵列扫描仪中分析玻片。将血清样本在 56 摄氏度灭活 30 分钟。然后在 4 摄氏度下以 16,000 RCF 离心 5 分钟。样本使用前需在 4 摄氏度保存。然后将微阵列置于染色缓冲液中，在室温下于140 rpm的旋转摇床上孵育15分钟。用移液器从微阵列腔室的角落吸除染色缓冲液。从1:1,000的稀释度开始，用血清样本和染色缓冲液进行稀释。将稀释后的样品在4°C下于旋转摇床上以140 rpm的速度与微阵列共同孵育过夜。使用演示的技术移除稀释的血清样品。然后按照之前的方法洗涤微阵列三次。将二抗用染色缓冲液稀释。使用1:5,000稀释度的荧光素标记抗人IgM抗体或荧光素标记抗人IgG抗体。然后将对照标记抗体以1:1000的稀释度加入染色缓冲液中，再与稀释后的二抗混合。在避光、室温条件下，于140 rpm的振荡摇床上与微阵列共同孵育30分钟。使用移液器从微阵列腔室的角落吸除稀释的二抗和标记抗体混合物。随后用标准缓冲液洗涤微阵列三次。每次洗涤在140 rpm的摇床上进行，持续1分钟。最后，按前述方法从微阵列腔室中移除洗涤缓冲液。进行微阵列扫描时，将芯片浸入200毫升新鲜配制的浸渍缓冲液中，重复两次。通过从上至下小心抽吸玻片表面的液体来干燥微阵列，约干燥一分钟，注意不要触碰玻片表面。根据扫描仪的说明对微阵列进行扫描。将玻片放置于扫描仪上时，确保打印面朝上。创建一个新项目并选择扫描区域。将扫描仪参数设置为分辨率21微米，700和800纳米通道的强度均为7.0，扫描质量为中等，偏移量为0.8。获取扫描图像并以16位灰度TIF文件格式保存。为了分析数据，首先打开原始图像，然后打开阵列网格文件。使用计算机的鼠标或键盘方向键将阵列网格与扫描图像对齐。在特定软件中选择定量分析功能，该功能将生成一个读出文件，其中包含每个点的信号强度、背景值以及对应的肽序列。最后，将微阵列密封后置于避光环境中，在四摄氏度下以无氧氮气或氩气保存。此处显示的是将微阵列与稀释1:250的特异性寨卡病毒血清样本孵育后，使用抗人IgG染色所获得的原始荧光图像。HA对照肽段位于微阵列的四周。在放大图中显示了与IgG强烈反应的肽段。类似地，此处还展示了一张原始荧光图像，该图显示了将特定的寨卡病毒血清样本以1:250稀释后孵育，再用抗人IgM染色微阵列的结果。同样，HA对照肽位于微阵列的四周。在放大图中显示了与IgM强烈反应的肽段。此处展示的是寨卡病毒表位共识序列，该序列与宿主血清样本中的IgM发生反应。表位共识序列中的肽段以红色标出，荧光强度最高的肽段以粗体标记。观看本视频后，您应能够充分理解如何处理高密度肽微阵列。一旦掌握该技术，若操作得当，可在24小时内完成。在进行该实验操作时，重要的是要注意小心处理芯片，避免划伤芯片表面。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）或表面等离子共振结合实验，以确定所鉴定出的肽段是否特异性地与寨卡病毒抗体结合，而不与其他黄病毒属抗体结合。该技术建立后，将为诊断学领域的研究人员利用血清和唾液样本发现诊断性肽段提供新的途径。请注意，处理寨卡病毒等传染性病原体可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，应始终采取热灭活血清样本、在生物安全二级（Biosafety Level 2）设施中操作等预防措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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了解利用高密度肽微阵列技术鉴定寨卡病毒特异性诊断表位的方法。该技术可检测血清中的IgM和IgG抗体，为临床医生提供感染时间线，并可应用于其他已知蛋白质序列的病原体诊断。

寨卡病毒特异性诊断表位发现

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