Name: 小鼠后脑作为研究胚胎神经再生的模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 了解小鼠胚胎后脑作为研究神经发生的哺乳动物模型，通过整体器官和组织切片分析揭示神经发育机制。该方法利用免疫标记和成像技术，为发育神经生物学研究提供重要工具。

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我们感谢 Vasiliki Chantzara 进行定时交配实验，以及伦敦大学学院眼科研究所生物资源中心工作人员在小鼠饲养方面提供的支持。本研究由 Wellcome Trust 研究员奖（项目编号：095623/Z/11/Z）资助，授予 CR。

所有动物实验均按照英国政府内政部和当地伦理指南的规定进行。
1. 步骤与时间安排概要
<ol>
	<li>使用适合回答所研究生物学问题的小鼠品系进行定时交配，以获得胚胎第 9.5 至 13.5 天（e9.5–e13.5）的妊娠小鼠；需要 12–15 天。</li>
	<li>可选：配制 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）/5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）溶液并进行注射（方案第 2 节）；根据所需的 EdU/BrdU 标记时长，需在胚胎分离前一日或当日耗时约 1 小时。</li>
	<li>进行胚胎分离及后脑解剖（方案第 3 节）；每个胚胎约需 10 分钟。</li>
	<li>进行整体免疫荧光标记（方案第 4 节）；需要 3 天。</li>
	<li>使用振动切片机进行切片，并进行漂浮切片免疫荧光标记（方案第 4 节）；需要 2 天。</li>
	<li>使用冷冻切片机进行切片，并对冷冻切片进行免疫荧光标记（方案第 5 节）；需要 2 天。</li>
</ol>
2. 向妊娠雌鼠注射 BrdU 或 EdU（可选）
<ol>
	<li>将 BrdU 或 EdU 溶解于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度分别为 10 mg/mL 和 1 mg/mL。 
	注意：BrdU 和 EdU 具有毒性；操作时需佩戴适当的防护装备。</li>
	<li>称量怀孕小鼠体重，并计算应注射的 BrdU 或 EdU 溶液体积，以达到 100 mg/kg 的 BrdU 或 5 mg/kg 的 EdU 剂量。</li>
	<li>根据所需的标记时间，于胚胎采集前 1 小时或 1 天，通过腹腔注射途径给予 BrdU 或 EdU 溶液。 
	注：标记 1 小时可显示后脑处于 S 期的细胞；标记 1 天可显示后脑神经前体细胞（NPC）的子代细胞。</li>
</ol>
3. 从 e9.5 - e13.5 小鼠胚胎中分离后脑
<ol>
	<li>在所需妊娠阶段，使用伦理批准的程序处死一只经定时妊娠的雌性小鼠（例如，颈椎脱位）。使用锋利的剪刀切开腹腔，并小心取出子宫。将含有胚胎的子宫置于含有20 mL冰浴PBS的60 mm塑料培养皿中。 
	注意：无需无菌操作。</li>
	<li>使用解剖显微镜进行后续所有解剖操作。用5号钟表镊撕开子宫肌壁以暴露胚胎，切断脐带释放每个胚胎，并去除卵黄囊。</li>
	<li>使用带有宽口径开口的无菌巴斯德吸管，将每个胚胎转移至盛有冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）的洁净塑料培养皿中。</li>
	<li>使用55号钟表镊，切断头部（图1E).</li>
	<li>可选择保留一小块组织（例如, &#188; 用于基因组DNA提取及后续基因分型的卵黄囊或约2 mm尾尖组织。</li>
	<li>使用55号钟表匠镊子，沿后脑神经上皮下方平行位置切除包含后脑的组织，以将其与面部及前脑组织分离（图1F).</li>
	<li>将后脑和尾部头部组织背侧朝上放置，并识别第4th 脑室，其表面覆盖有一层薄薄的组织（顶板）。使用55号钟表镊小心刺穿顶板。图1G）并用镊子剥离多余组织，沿中脑中线向前（头侧）移动，然后沿后部后脑和脊髓向后（尾侧）移动（图 1G）；此时应以敞书状准备使脑干暴露图1H).</li>
	<li>为整体免疫标记准备小鼠后脑（方案1）。
	<ol>
		<li>使用55号钟表镊，用镊子小心剥离附着在小脑皮层侧的残留头部间充质组织及任何脑膜组织图1I）。移除中脑和脊髓组织（图1J) 以仅保留后脑组织（图1K). 
		注意：在胚胎发育第9.5天（e9.5）或第10.5天（e10.5）时不应执行此步骤，因为操作可能损伤后脑神经上皮；此外，由于此阶段后脑神经上皮已足够薄，抗体可有效渗透用于免疫标记，因此去除软脑膜并非必要。然而，从胚胎发育第11.5天（e11.5）开始，软脑膜组织逐渐致密，此时应执行此步骤以增强抗体向后脑神经上皮的渗透。解剖操作应在冰冻的PBS中进行（每个后脑使用新鲜的洁净PBS），以便于操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为振动切片机和冷冻切片准备脑干（选项2）
	<ol>
		<li>使用55号钟表镊，去除中脑和脊髓组织（图1J). 
		注意：用于切片的后脑无需去除间充质和软脑膜（如下所示） 图1I).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将后脑组织从塑料培养皿转移至圆底2 mL离心管中，使用巴斯德吸管吸除全部PBS，于4 °C下固定2 h&#176;在新鲜解冻的含4% w/v多聚甲醛的PBS溶液中，于C条件下轻柔振荡固定。 
	注意：甲醛具有毒性；请佩戴适当的防护装备。</li>
	<li>用 PBS 清洗小鼠后脑 3 次。4 ℃ 保存 &#176;在 PBS 中于 4°C 下保存，若免疫标记将在 2-3 天内开始；若需长期保存于 -20°C，则先用 50% 甲醇/50% PBS 处理 5 分钟，再转移至 100% 甲醇中&#176;C.</li>
</ol>
4. 全胚胎免疫荧光染色
<ol>
	<li>如果需要，将后脑在 PBS 中按甲醇浓度递减的系列稀释液中重新水化（例如，75% 甲醇，50% 甲醇，25% 甲醇）中，室温（RT）下各孵育 5 分钟，然后转移至 PBS。 
	注意：需要使用梯度甲醇系列对后脑进行温和再水化，以确保组织的适当保存。</li>
	<li>在 4℃ 下对后脑进行 30 分钟的透化处理 &#176;在含0.1% Triton X-100的PBS（PBT）中轻柔振荡孵育。</li>
	<li>在 4 ℃ 下孵育后脑 1 小时 &#176;在含10%热灭活山羊血清的PBT中，轻轻振荡孵育。 
	注意：使用与二抗宿主物种相同的血清。对于山羊来源的一抗，应使用无血清蛋白封闭液孵育，例如含5%牛血清白蛋白的PBS溶液或合适的商用替代品（参见 材料表）。这将减少使用山羊来源的抗体作为一抗时经常出现的非特异性染色。</li>
	<li>4°C 下孵育后脑过夜 &#176;在含1%热灭活血清和一抗的PBT中轻轻振荡孵育例如，兔抗磷酸化组蛋白H3 [pHH3]（1:400稀释） 
	注意：对于山羊来源的一抗，使用不含血清的PBT。</li>
	<li>在4℃下洗涤后脑 &#176;每次用 PBT 洗涤 5 次，每次 1 小时。</li>
	<li>4℃下孵育后脑过夜 &#176;在含适当荧光素偶联二抗的 PBT 中例如，山羊抗兔 Alexa Fluor 488）按1:200比例溶于PBT中，用于标记所用的一抗。自此步骤起，将小脑组织避光保存，以防止荧光染料发生光漂白。 
	注意：对于山羊来源的一抗，应使用抗山羊 Fab 片段的二抗以减少非特异性染色。</li>
	<li>在4℃下洗涤后脑 &#176;每次用 PBT 洗涤 5 次，每次 1 小时。</li>
	<li>在 PBS 中加入 4% 多聚甲醛，将后脑固定 15 分钟（室温），以长期保存抗体结合能力。用 PBS 简短漂洗两次。</li>
	<li>用两层黑色电工胶带覆盖载玻片，然后从叠层胶带中剪下一个足够容纳一个后脑的小方孔，形成一个口袋。</li>
	<li>用巴斯德吸管将每个后脑转移至载玻片凹槽中，吸除多余液体，加入适量抗荧光淬灭剂，再缓慢盖上盖玻片，避免产生气泡。用指甲油在盖玻片周围密封并将其固定于载玻片上。将载玻片置于4℃避光保存。 &#176;在避光条件下直至图像采集（第7步实验步骤）。</li>
</ol>
5. 振动切片与游离切片免疫荧光
<ol>
	<li>如有需要，按照步骤 4.1 所述，用甲醇对小脑组织进行再水化处理。</li>
	<li>将小脑组织包埋于溶于蒸馏水的 3% w/v 熔融琼脂糖中。 
	注意：包埋前需将熔融琼脂糖短暂冷却至约 55°C，以避免高温对小脑组织造成损伤。</li>
	<li>使用振动切片机将小脑组织切成厚度为 70 µm 的横切面。用画笔将每一片新切的组织转移至含有冰冻 PBS 的 24 孔板的一个孔中。</li>
	<li>按照步骤 4.2–4.7 所述对漂浮切片进行标记，但作如下修改：在 4 °C 下用 PBT 洗涤漂浮切片，每次 15 分钟，共洗 3 次；将二抗孵育时间缩短至 2 小时，并在室温下进行二抗孵育。</li>
	<li>可选：在按照步骤 5.4 完成其他表位的抗体标记后，根据制造商说明书使用 EdU 标记试剂盒检测 EdU+ 核。将漂浮切片在避光条件下于 37 °C 下孵育于反应混合液中 30 分钟。在 4 °C 下用 PBT 洗涤小脑切片，每次 15 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>可选：在按照步骤 5.4 完成其他表位的标记后，按如下步骤检测 BrdU+ 核。
	<ol>
		<li>在避光条件下，将漂浮切片于 37 °C 下在 2 N 盐酸中孵育 30 分钟。</li>
		<li>在室温避光条件下，将漂浮切片在 pH 8.5 的 0.1 M 硼酸钠缓冲液中孵育两次，每次 5 分钟，以中和盐酸。</li>
		<li>在 4 °C 下用 PBS 快速洗涤漂浮切片 3 次。</li>
		<li>按照步骤 5.4 所述进行 BrdU 的免疫荧光标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将漂浮切片在含 10 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的 PBS 中于室温孵育 2 分钟，以对细胞核进行复染。</li>
	<li>将漂浮切片在 4% 甲醛中室温后固定 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 快速洗涤漂浮切片。用画笔小心地将切片转移至玻璃显微镜载玻片上。用吸水纸或纸巾吸去切片周围的多余 PBS。</li>
	<li>使用含 80% 甘油的 PBS 封片，缓慢加盖盖玻片以避免产生气泡。将载玻片置于 4 °C 避光保存，直至进行图像采集（步骤 7）。</li>
</ol>
6. 冷冻切片与冷冻切片免疫荧光标记
<ol>
	<li>如有需要，按照步骤 4.1 所述，用甲醇对小脑进行再水化处理。</li>
	<li>将小脑在含 30% w/v 蔗糖的 PBS 中孵育，以在冷冻前对小脑进行冷冻保护。 
	注意：当小脑沉入管底时即表示已准备好冷冻，e9.5-10.5 胚胎的小脑通常需要 ≤ 2 小时，e11.5-13.5 胚胎的小脑则需 3-6 小时。</li>
	<li>将小脑浸入光学切割温度包埋剂（OCT）中，并将装有小脑的 OCT 模具迅速转移至置于干冰上冷却至 -40 °C 至 -50 °C 的异戊烷中进行快速冷冻。 
	注意：冷冻包埋后的小脑可短期储存在 -20 °C，长期储存则应置于 -80 °C，直至切片。</li>
	<li>使用恒冷箱切片机切割厚度为 10 µm 的小脑横切面，并转移至带有静电粘附性的载玻片上。 
	注意：小脑冷冻切片可短期储存在 -20 °C，长期储存则应置于 -80 °C，直至染色标记。</li>
	<li>将载玻片在室温下孵育 15 分钟，使切片充分干燥贴附。用 PBS 洗涤冷冻切片以溶解 OCT，并使用 PAP 笔在切片周围标记疏水屏障。重复步骤 5.4-5.8。</li>
	<li>使用聚乙烯醇基封片剂替代甘油，重复步骤 5.10。</li>
</ol>
7. 图像采集
<ol>
	<li>使用配备适用于水介质封片样本的物镜以及适用于免疫标记所用荧光染料的光学滤光片的落射荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜对样本进行成像。</li>
	<li>要对整个后脑或后脑切片进行成像，请使用10倍放大倍率的物镜（例如, 图2B）；为可视化用于定量分析的后脑区域，使用40倍放大倍数（例如, 图 2D）为了观察单个细胞，使用 63 倍放大倍数的物镜（例如, 图2C).</li>
</ol>
8. 替代方法
<ol>
	<li>在步骤 3.8 之后，将未固定的后脑进行匀浆处理，以制备单细胞悬液用于 流式细胞术 应用15.</li>
	<li>继步骤 3.8 后，将未固定的后脑组织匀浆，以从单细胞悬液中提取 RNA 用于 RT-qPCR (例如, 16). 
	注意：确保所有试剂和设备在整个过程中保持无菌且无RNase，以防止RNA降解。</li>
	<li>在步骤3.8之后，将未固定的后脑组织匀浆以分离神经前体细胞并进行扩增培养 体外 作为 神经球 用于分析后脑神经前体细胞行为17. 
	注意：确保所有试剂和设备均保持无菌，以防止神经球培养物受到细菌或真菌污染。</li>
</ol>

<ol><li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li>
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</ol>

所有作者均无竞争利益或利益冲突。

本方案描述了如何利用小鼠胚胎后脑作为模型来研究发育性神经发生机制。通过多种不同的免疫标记方法，可在组织切片或整个器官的全装标本上观察后脑神经前体细胞（NPCs）并对其数量进行定量。由于后脑易于解剖且具有扁平的解剖结构，因此可通过“摊开书本”式制备方法对其进行成像，从而获取有关整个器官范围内神经发生模式的信息。
我们进一步表明，在后脑的漂浮切片或冷冻切片中，可以轻松观察到神经前体细胞（NPC）的形态以及与细胞周期相关的NPC定位。这两种特征可用于定义新的前体细胞群体，此前已在哺乳动物端脑中采用过此类方法20。例如，早期形成的Sox2+神经上皮细胞和Pax6+顶端放射状胶质细胞存在于后脑中21,22，但后脑缺乏Tbr2+基底前体细胞3。
本文所述方案还可通过荧光标记，用于活体成像和/或固定组织中的谱系示踪，以观察特定NPC亚群的行为。例如，可通过研究携带他莫昔芬诱导型Sox1-iCreERT2转基因和Rosa26tdTomato报告基因小鼠的后脑来实现该方法23。
除了增进对小鼠神经发生过程的了解外，研究后脑还可能揭示在不同物种间广泛存在的共同神经发生机制，因为后脑是一个高度保守的脑区，其在各脊椎动物物种之间的相似性预计高于前脑。
由于后脑神经发生的时间窗口相对较短，比前脑神经发生更短暂23，因此在比较胚胎时必须确保其发育阶段匹配。为避免实验偏差，应在分离胚胎后脑之前，计数并记录胚胎的体节对数。后脑组织本身较为脆弱，因此在从头部间充质和脑膜中分离后脑组织时，应小心操作镊子；在解剖珍贵胚胎之前，建议先进行数次“练习操作”。此外，应使用宽口巴斯德移液管而非镊子将后脑组织从一个离心管转移至另一个离心管，以避免损伤（可通过使用洁净剪刀剪去移液管尖端来扩大其开口）。最后，尽管较少见，EdU/BrdU掺入S期神经前体细胞的程度可能存在差异，尤其是在较短（即，1小时）的脉冲标记期间。为提高标记效率，应在将溶液装入注射器前确保EdU/BrdU充分溶解，并小心注射至腹腔内。若注射不当，例如意外皮下注射，会导致EdU/BrdU溶液丢失或滞留，无法进入循环系统。

在哺乳动物胚胎发育过程中，神经前体细胞（NPC）在不断扩展的神经上皮的室带（VZ）和室下带（SVZ）中分裂，以产生新的神经元，这一过程称为“神经发生”。目前对前脑中新生神经元及其NPC前体细胞的生成已有广泛研究1，而对其他脑区中这一过程的了解则相对较少。
前脑是一个复杂且高度折叠的结构，通常在组织切片后通过组织学方法进行研究，这使得全面理解整个器官中的神经发生模式变得具有挑战性。此外，前脑神经发生的研究结果未必能预测其他脑区或脊髓中的神经发生行为。例如，信号分子在中枢神经系统的不同区域可能引发不同的反应，这一点在睫状神经营养因子和白血病抑制因子的作用中已有观察：这两种因子可促进侧神经节隆起中神经前体细胞（NPCs）的自我更新，但却促使脊髓前体细胞向分化方向发展2。此外，在发育中的前脑中存在一类特定的NPC亚群，对大脑皮层的扩展具有重要贡献1，而这类细胞在后脑和脊髓中并不存在3。反之，脊髓和后脑也可能含有皮层中所没有的其他NPC亚型。
小鼠胚胎的后脑是哺乳动物大脑中进化上最古老的区域，能够生成小脑和脑干。尽管该区域在不同物种间具有高度保守性，但关于后脑神经发生的研究仍相对较少，包括神经前体细胞（NPC）亚型及其调控机制。目前小鼠后脑的大部分研究集中在由Hox基因驱动的组织分段过程4，以及有丝分裂后神经元的模式形成5。此外，后脑也被用作研究发育性血管生成机制的模型6。
与小鼠后脑不同，斑马鱼后脑已被广泛用于在脊椎动物模式生物中追踪神经前体细胞（NPC）的分化及谱系进展例如,7,8）。鸡胚后脑还被用于研究脊椎动物发育过程中的神经发生（例如,9,10）。类似于斑马鱼的后脑11，可对鸡胚后脑进行活体成像，以随时间研究神经嵴前体细胞的行为及其调控机制12. 由于哺乳动物在发育过程中不具备相应的条件，目前尚无法对其开展类似的活体成像纵向观察 在子宫内 此外，通过电穿孔等技术可轻松实现对自由游动的斑马鱼胚胎或鸡胚胎的靶向操作 在卵内 (例如,13，但这些技术也更具挑战性 在子宫内.
然而，小鼠胚胎的后脑非常适合用于定义调控神经发生的分子和细胞机制。首先，在许多情况下，对小鼠后脑的研究所提供的信息比通过研究低等脊椎动物所获得的信息更贴近人类发育过程。此外，目前已拥有大量基因修饰小鼠品系，可用于小鼠神经前体细胞（NPCs）的命运图谱分析，或通过相关基因的组成型或条件型突变等位基因来改变调控机制。最后，最近研究表明，体外（ex vivo）对后脑室下区前体细胞进行显微注射，至少可实现对后脑NPC动力学的短暂观察14。然而，目前对于在完整器官背景下后脑NPC的空间-时间组织及其行为仍知之甚少。
本文展示了一种简单快速的方法，利用后脑作为强大的模型，在整体组织制备和组织切片中分析哺乳动物神经前体细胞（NPC）的行为。我们进一步提供了免疫标记技术的实验方案，用于研究不同的神经发生参数，并对后脑样本进行后续分子应用处理，例如定量逆转录（qRT）-PCR。

<table><tbody><tr><td>圆底试剂管，2.0 ml（Safe-Lock）</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td>也可从其他商业供应商处获取</td></tr><tr><td>塑料细胞培养皿，60 mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>150288</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>150628</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Copan</td><td>200C</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>Dumont 镊子，5 号</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 钟表匠镊子，型号 55</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>29G 针头/注射器</td><td>BD</td><td>BD Micro-Fine +1ml</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化组蛋白H3一抗</td><td>默克密理博</td><td>06-570</td><td>山羊，稀释比例 1:400</td></tr><tr><td>抗BrdU一抗</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>大鼠，稀释比例 1:400</td></tr><tr><td>抗Ki67一抗</td><td>BD 生物科学</td><td>550609</td><td>小鼠，稀释比例 1:400</td></tr><tr><td>抗RC2一抗</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>RC2</td><td>小鼠（IgM），稀释比例 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11029</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 标记的山羊抗兔二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11037</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgM 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A21042</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11001</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 标记的山羊抗大鼠二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11007</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>使用浓度为10 &amp;mu;克每毫升</td></tr><tr><td>5-乙炔基-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷（EdU）</td><td>Sigma</td><td>900584</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;acute;-脱氧尿苷（BrdU）</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 成像试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10086</td><td></td></tr><tr><td>热灭活山羊血清</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 蛋白封闭液（无血清）</td><td>安捷伦</td><td>X0909</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>四硼酸钠</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>超级PAP笔液体阻断剂</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade 抗荧光淬灭试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S-2828</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>10337700</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Millipore</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Scigen</td><td>4583</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10675112</td><td>也可从其他商业供应商处获取</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10316380</td><td>也可从其他商业供应商处获得</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>631-0912</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>VWR</td><td>620-0858</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>立体显微镜，Leica MZ16</td><td>Leica</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜&amp;nbsp; LSM710</td><td>蔡司</td><td>不适用</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠后脑作为研究胚胎期神经发生的模型

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

小鼠胚胎前脑是研究哺乳动物发育过程中神经发生最常用的体系。然而，高度折叠的前脑神经上皮不适合进行整体染色分析，以观察整个器官范围内的神经发生模式。此外，前脑神经发生的机制并不一定能够预测脑内其他区域的神经发生情况；例如，这是由于存在前脑特异性的前体细胞亚型。小鼠后脑为研究胚胎期神经发生提供了另一种模型，该模型既适用于整体染色分析，也可制备组织切片以观察神经前体细胞在时空上的分布与行为。此外，后脑易于分离，可用于其他后续实验，如细胞分离或分子生物学分析。由于小鼠后脑可广泛应用于目前已有的大量细胞谱系报告基因小鼠品系和基因突变小鼠品系中，因此它为研究哺乳动物发育过程中神经发生的细胞与分子机制提供了一个强有力的模型。本文介绍一种简单快速的方法，利用小鼠胚胎后脑在整体染色样本和组织切片中分析哺乳动物神经前体细胞（NPC）的行为。

本部分展示了通过整体染色和组织切片分析研究小鼠胚胎后脑神经发生的可获得结果示例。
我们通过使用有丝分裂标志物pHH3抗体对显微解剖的后脑进行整体免疫标记，展示了VZ区正在分裂的NPCs（图2B - D）。我们以高倍放大显示pHH3+ NPCs，以突出有丝分裂的不同阶段（图2C）。我们已证实，该标记方法适用于后脑发育多个连续阶段，可用于观察该器官中NPC有丝分裂的时间进程（图2D）。
我们发现，在EdU注射后1小时，对脑干的横向振动切片进行免疫标记成像，可显示有丝分裂NPCs的分裂方向（图3B）、增殖前体细胞的假复层间期核迁移模式18（图3B，D）以及整个室管膜区（VZ）的结构（图3B - D）。需要注意的是，有丝分裂期的pHH3+ NPCs仅存在于脑室表面，而不在更基底的位置（图3C），这与前脑中更为特化的NPCs的基底分裂模式形成对比19。
我们还展示了如何利用 BrdU 或 EdU 标记循环中的神经前体细胞（NPC）及其分化后代，以评估 NPC 的谱系进展（图 4）。在小鼠后脑横断冷冻切片中，于注射 BrdU 后 1 天进行 BrdU 和 Ki67 的免疫标记，可显示神经上皮中循环 NPC 的数量与分布位置（图 4A、B）；通过计算所有 BrdU+ 细胞中 Ki67+ BrdU+ 细胞所占的百分比，可确定具有自我更新能力的 NPC 数量（图 4A、C）。
最后，我们展示了利用振动切片机切取的后脑组织切片进行免疫标记的示例，以检测神经特异性中间丝蛋白巢蛋白（nestin）中的RC2抗原，从而可视化神经前体细胞（NPC）的终足（图5B）及其突起（图5C）。相较于薄的冰冻切片，振动切片机切片更有利于观察高度分支的NPC以及整体的神经上皮结构。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg" /> 
图1e11.5小鼠胚胎后脑解剖的关键步骤 (A - D后脑微解剖示意图。A) 沿红色虚线切断，移除尾部头部组织。B) 沿中线（垂直红色线条）向头侧和尾侧方向刺穿并撕除顶板，再向侧方分离，以暴露后脑神经上皮。C将镊子插入神经上皮与脑膜之间，将神经上皮从脑膜上剥离，随后沿红色虚线用镊子剪断组织，去除中脑和脊髓组织。D该操作可获得一个扁平化的后脑。E-K) 小脑微解剖过程关键阶段的图像采集。E) 通过沿虚线切断，将胚胎去头。F) 脑桥和4th 脑室，由顶板包裹，沿虚线切断后从头部摘除并分离。G4）th 脑室向上定向，在顶板上刺入一个小孔（星号）。沿中线前后方向小心剥离组织，扩大孔洞（箭头），以暴露后脑。将后脑软脑膜面朝下放置，使其自然展开成书本打开状的制备标本H；黑色箭头指示后脑神经组织）。如果需要对后脑进行整体免疫标记，可用镊子轻轻剥离后脑神经上皮与周围脑膜组织，以去除软脑膜I）。去除多余的中脑（mb）和脊髓（sc）组织（虚线所示在 J) 以分离后脑（K。比例尺： 500 &#181;m 对于 (E), 300 &#181;m 对于 (F - K). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg" /> 
图 2：全组织免疫标记可用于定量后脑中神经前体细胞的有丝分裂。（A）示意图显示后脑室管膜层中处于有丝分裂的神经前体细胞（NPC）的正面成像。en face：V，室管膜侧（后脑腹侧）；P，软脑膜侧（后脑背侧）。（B）e10.5 期后脑经全组织免疫标记有丝分裂标志物 pHH3（红色）后的共聚焦显微镜拼接图像 z 层扫描。白色方框表示（D）第二张图中放大显示的区域。（C）在所有有丝分裂的 NPC 中，可区分前期（白色箭头）和后期（黑色箭头）的有丝分裂图像。（D）e9.5 至 e13.5 期间全组织 pHH3 标记的时间进程。比例尺：（B）中为 500 µm；（C）中为 20 µm；（D）中为 100 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg" /> 
图3：在后脑前部生发区中循环的神经前体细胞（NPCs）。（A）示意图显示有丝分裂期（绿色）和S期（红色）神经前体细胞（NPCs）分别位于后脑室管膜表面及室周区域的位置。右侧为后脑虚拟横截面的高倍放大图。黑色箭头指示已退出细胞周期的NPC子代细胞向分化区迁移的方向。（B）对接受1小时EdU脉冲标记的胚胎e11.0后脑漂浮切片进行共聚焦z轴层扫成像；通过pHH3和EdU免疫标记分别显示处于有丝分裂期（绿色）和S期（红色）的NPCs。后脑表面以虚线标示；V，室管膜侧；P，软脑膜侧。白色方框所示区域在插图中以更高倍数展示；箭头指示处于后期的NPC分裂面相对于室管膜表面的方向。（C）单独显示pHH3免疫标记的通道。有丝分裂期的NPCs由青色箭头标示；缺乏基底分裂的现象由Δ符号标示。（D）单独显示EdU标记的通道。EdU+ NPCs由于其核的间期迁移而呈现假复层分布。可测量NPCs自室管膜表面迁移的距离，如代表性橙色线条所示。比例尺：（B - D）中为100 µm；（B）插图中为10 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg" /> 
图4：联合使用 BrdU 与 Ki67 标记以确定后脑神经前体细胞（NPC）的自我更新能力。（A）经1天BrdU脉冲标记后，e10.5后脑冰冻切片经Ki67（绿色）和BrdU（红色）免疫标记的共聚焦z轴层扫图像。室带中BrdU与Ki67双阳性细胞为已掺入BrdU且仍处于细胞周期中的NPC，其存在由Ki67标记指示。双标记细胞占总BrdU+细胞群的比例代表了自我更新NPC的百分比。（B、C）分别单独显示Ki67（B）和BrdU（C）免疫标记的单通道图像。在（A、C）中由青色箭头指示的BrdU+细胞不表达Ki67，提示其可能已退出细胞周期。后脑边界以虚线标示；V，后脑室管膜侧；P，后脑软脑膜侧。比例尺：50 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg" /> 
图5：Nestin 免疫标记显示 NPC 的突起和末端足。 （A–C）针对 RC2 的免疫荧光染色，该抗体识别神经中间丝蛋白 nestin 上的表位，展示了后脑神经上皮中 NPC 的形态结构。（A）对 e11.5 期后脑漂浮切片进行 RC2 免疫标记后获得的共聚焦 z 轴层扫图像；方框区域在（B、B'；顶端/室管膜区域）和（C、C'；基底区域）中以更高倍数展示。虚线表示后脑表面；V 表示室管膜侧，P 表示软脑膜侧。（B、C）为（A）中方框区域的共聚焦 z 轴层扫图像；单个光学切片分别在（B'、C'）中展示。（B'）中箭头指示锚定于室管膜表面的 NPC 顶端末端足。（C'）中白色和黑色箭头分别指示单个及束状的 NPC 突起。比例尺：100 µm（A）；25 µm（B, C）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文展示了如何利用小鼠胚胎后脑作为模型，通过完整器官和组织切片制备来研究发育性神经发生。

小鼠胚胎前脑是研究哺乳动物发育过程中神经发生最常用的体系。然而，其高度折叠的……

本实验的总体目标是在小鼠胚胎后脑发育过程中，实现对整个器官及其组织学的分析。该方法可用于研究哺乳动物模型生物后脑中的神经发生过程。发育中的小鼠后脑是研究神经前体细胞活动的理想模型，因其结构扁平，便于观察整个器官内的神经发生模式。在所需妊娠阶段，采用伦理批准的方法对配孕雌性小鼠实施安乐死，开始本实验操作。使用锋利的剪刀剪开腹腔，小心取出子宫。将含有胚胎的子宫置于一个含有20毫升冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）的60毫米塑料培养皿中。使用解剖显微镜进行后续所有解剖操作。用5号钟表镊撕开子宫肌层，暴露胚胎。切断脐带释放每个胚胎，并移除卵黄囊。将每个胚胎转移至含有冰冷 PBS 的干净塑料培养皿后，使用 55 号钟表匠镊子切断头部。可选择保留一小块组织用于基因组 DNA 提取及后续基因分型。使用 55 号钟表匠镊子，沿后脑神经上皮下方并与其平行地切除包含后脑的组织，以将其与面部及前脑组织分离。将后脑和尾部头部组织腹侧朝下放置，背侧朝上，辨认被一层称为顶板的薄膜覆盖的第四脑室。使用55号钟表镊小心刺穿顶板，并用镊子剥离多余组织，沿中脑中线向前（头侧）方向，再向后（尾侧）沿后脑后部及脊髓方向进行操作。此时后脑应已暴露，形成类似“摊开书本”的制备状态。为进行整体免疫标记而准备后脑时，使用55号钟表匠镊子小心地剥离后脑剥离面残留的间充质组织及附着的脑膜。去除中脑和脊髓组织，仅保留后脑组织。为进行振动切片机和冷冻切片制备后脑时，使用55号钟表匠镊子去除中脑和脊髓组织。使用巴斯德移液管将小脑从塑料培养皿转移至圆底的 2 毫升离心管中。吸除全部 PBS 后，在 4 摄氏度条件下，用新解冻的含 4%（质量/体积）多聚甲醛的 PBS 溶液轻轻振荡固定小脑 2 小时。最后，用 PBS 清洗小脑 3 次。如有需要，将小脑在室温下用 PBS 中浓度依次降低的甲醇溶液进行复水，每个浓度处理五分钟。随后，将小脑转移至 PBS 中。在 4°C 条件下，用含 PBT 的 PBS 轻柔振荡孵育小脑 30 分钟以进行通透处理。然后将后脑在含有10%热灭活山羊血清的PBT中于4°C孵育一小时。接着，将后脑在含有1%热灭活血清和一抗的PBT中，于4°C过夜孵育，孵育条件同前。次日，在4°C条件下用PBT洗涤后脑，每次一小时。洗涤后，将小脑在含有针对所用一抗的相应荧光素偶联二抗的PBT中，于4摄氏度孵育过夜。从此步骤开始，需将小脑避光保存，以防止荧光素发生光漂白。用PBT再次如前所述洗涤后，将小脑在含4%甲醛的PBS中室温下后固定15分钟，以长期保存抗体结合效果。同时，用两层黑色电工胶带覆盖一张玻璃显微镜载玻片，并从胶带层上挖去一个小方块，形成一个足以容纳延髓的凹槽。将延髓用 PBS 短暂冲洗两次后，用巴斯德吸管将其转移至该凹槽中。吸去多余液体，并向凹槽中加入适量的抗荧光淬灭剂。然后缓慢用玻璃盖玻片覆盖后脑，避免在盖玻片下 trapped 气泡。用一层薄薄的指甲油密封盖玻片，并将其固定在载玻片上。将载玻片置于 4°C 避光保存，直至进行图像采集。将后脑嵌入用蒸馏水配制的3%（重量/体积）熔融琼脂糖中。使用振动切片机将后脑组织切成70微米厚的切片。用画笔将每片新切的组织转移至含有冰冷PBS的24孔板的一个孔中。按照文本方案中详述的方法对漂浮切片进行标记后，用 PBS 短暂洗涤。使用画笔小心地将漂浮切片转移至玻璃显微镜载玻片上。用吸水纸或纸巾吸去切片周围多余的 PBS。不要将切片置于含80%甘油的PBS中。然后缓慢加盖玻璃盖玻片，避免产生气泡。将载玻片置于4°C避光保存，直至进行图像采集。在冷冻前，将后脑置于含30%（重量/体积）蔗糖的PBS溶液中，于4摄氏度孵育，以进行冷冻保护。将后脑浸入光学切割温度包埋剂（OCT）中，随后将含有后脑的模具迅速转移至置于干冰上冷却至-40至-50摄氏度的异戊烷中，快速冷冻。接下来，使用冷冻切片机将转移的脑干切片切成10微米厚度。将脑干切片转移至带有静电黏附性的载玻片上。在室温下孵育载玻片15分钟，使切片干燥并黏附于载玻片上。然后用 PBS 清洗冷冻切片以溶解 OCT 包埋剂。使用 PAP 笔在冷冻切片周围标记疏水屏障。采用配备适用于水介质封片样本的物镜以及与免疫标记所用荧光染料相匹配的光学滤光片的落射荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜对样本进行成像。为了成像整个后脑或后脑切片，请使用10倍放大倍率的物镜。为了可视化后脑区域以进行定量分析，请使用40倍放大倍率。为了观察单个细胞，请使用63倍放大倍率的物镜。此处展示的是通过全胚胎免疫标记后脑的代表性结果，用于观察脑室区中正在分裂的神经前体细胞。这些图像通过在发育连续阶段使用有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3获得。在进行一小时EdU脉冲标记后，制备横断面振动切片，以标记经历间期核迁移的后脑神经前体细胞，以及位于脑室表面呈有丝分裂磷酸化组蛋白H3阳性的细胞。通过计算胚胎在给予BrdU后一天的后脑横断冷冻切片中，所有BrdU阳性细胞（红色和黄色）中呈Ki67与BrdU双阳性（黄色）的细胞所占百分比，可确定具有自我更新能力的神经前体细胞的总体比例。后脑振动切片也可用针对中间丝蛋白Nestin（又称RC-2）的抗体进行免疫标记，以显示神经前体细胞的终足和突起。观看本视频后，您应能充分掌握如何分析后脑的平铺制备样本或横断组织切片。一旦掌握该技术，可在一小时内完成多达 10 个后脑的分离。在初次尝试该操作时，建议使用冰冻 PBS，以便熟悉后脑显微解剖过程，因为冰冻 PBS 有助于脑组织与脑膜的分离，同时可确保组织完整性。完成该操作后，可对后脑单细胞悬液进行流式细胞术等后续方法，以将神经前体细胞与其他细胞类型分离。建立这一技术为发育神经生物学领域的研究人员探索哺乳动物神经发生机制开辟了道路，使他们能够利用后脑作为替代模型，取代传统上常用的脊髓和前脑模型。该方法不仅有助于深入了解哺乳动物后脑的神经发生过程，还可应用于其他发育中的脊椎动物，因为不同物种之间在结构和分子水平上具有高度相似性。该技术可能有助于发现调控神经发生的新机制，并帮助确定在脊椎动物脑轴其他部位已鉴定出的机制是否也在后脑区域重现。

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在新的脑区中对年轻神经元进行挑战，可以揭示环境如何塑造神经元命运和成熟过程的重要见解。本方案描述了一种从特定脑区分离中间神经元前体细胞，并将其同位或异位移植到出生后幼鼠脑内的实验方法。...

同龄期中间神经元前体细胞移植至出生后早期小鼠大脑

本方案介绍了一种从胚胎第17天小鼠脑组织中制备中枢神经系统细胞培养物的独特方法，适用于神经（免疫）学研究。该模型可通过多种实验技术进行分析，包括实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、显微镜检查、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术。...

建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

了解小鼠胚胎后脑作为研究神经发生的哺乳动物模型，通过整体器官和组织切片分析揭示神经发育机制。该方法利用免疫标记和成像技术，为发育神经生物学研究提供重要工具。

小鼠后脑作为研究胚胎期神经发生的模型

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