检测暴露于有机氯农药的肝细胞线粒体功能的实验方案

这是一个混乱的调用回答一个关键问题，你也有一个领域的功能，如ATP水平和氧气消耗率。新的或一页旧，这种技术是，它很容易执行，它是一个细胞线粒体功能的特殊评估很多。为了开始这个实验，在玻璃底部培养皿中播种2万个 HepG2 细胞。

在37摄氏度的培养箱中加入β-六氯环氧烷或B-HCH，24小时加入5%的二氧化碳。通过将无水DMM细胞培养基中添加无水DMSO，准备一毫摩尔线粒体绿色荧光探针溶液。然后将溶液每盘一毫升添加到玻璃底部培养皿中的细胞中。

并在37摄氏度下孵育45分钟。孵育后，从细胞中去除线粒体绿色荧光探针溶液。在37摄氏度的DMEM细胞培养基下，每盘新鲜准备的菜中加入一毫升。

要检测线粒体中的绿色荧光，在共和显微镜下观察细胞。为了评估细胞ATP的水平，种子在6个井板中的20，000个 HepG2细胞。加入乙基六氯多氯二羊，在37摄氏度下孵育24小时。

向每个井的细胞中加入200微升的解液缓冲液。在摄氏4度下以12，000次G离心5分钟，然后按照文本协议中所述进行收集上一代。向板中加入 100 微升 ATP 检测缓冲液。

在室温下将100微升收集的细胞上一提液添加到96井板中，然后按照文本协议中描述的发光计检测细胞ATP。为了评估线粒体膜电位，如前所述，在六个井板中生长 HepG2 细胞，并添加乙基六氯二线。在37摄氏度下用0.5毫升0.25%EDTA消化细胞，收集细胞，一分钟。

加入一毫升DMEM停止消化，并将消化的细胞转移到1.5毫升管。将管子在1000倍G下离心三分钟，然后丢弃上流液。用0.5毫升细胞培养基和0.5毫升JC1线粒体膜电位染料稀释细胞颗粒。

在37摄氏度下孵育20分钟。接下来，在4摄氏度下以600倍G离心管3分钟，然后根据文本协议清洗细胞颗粒。离心冲走洗颗粒后，取出上经剂。

并在0.5毫升JC1染色缓冲液中重新悬浮颗粒。通过流式细胞分析 JC1 染色细胞，检测绿色和红色荧光。检测到 JC1 单体时，将激励光设置为 490 纳米，将发射光设置为 530 纳米。

检测到 JC1 聚合物时，将激发光设置为 525 纳米，将发射光设置为 590 纳米。为了分析耗氧率，将 HepG2 细胞在 96 井细胞培养板中播种，密度为每 100 微升 4，500 个细胞。在37摄氏度下孵育24小时后，确保每一个井中的细胞都覆盖着中等的细胞。

在运行 OCR 软件之前，请将带墨盒的微孔板和细胞培养板加载到文本协议中描述的细胞外通量分析仪中。打开 OCR 软件并在应用下拉菜单中，选择细胞 mito 压力测试套件，然后单击"启动应用"按钮。接下来，单击运行压力测试按钮。

当出现细胞压力测试屏幕时，在细胞种子编号框中输入每井播种的细胞数量，以及基底细胞OCR框中的平均OCR。输入每个试剂的最终工作浓度，然后注射试剂。单击下一个按钮。

当出现组信息屏幕时，通过选择颜色并指定名称，将组分配给未分配的井。然后单击相应的油井。单击下一个按钮，在显示的压力测试注入布局屏幕中，单击"开始"以在分析仪上运行压力测试。

完成运行后，按照软件中的提示操作，然后取出并丢弃墨盒和电池板。线粒体绿色荧光染色的平均强度在接触β-HCH的HpG2细胞中降低。这表明线粒体数量减少，受损线粒体增加，农药浓度增加。

此外，HepG2细胞中的ATP水平随着乙氯二氯六基暴露浓度的增加而降低，表明这些细胞中线粒体的功能下降。JC1 染色线粒体膜电位（MMP）后，流式细胞仪在完整的 HepG2 细胞中显示高红色绿色 JC1 荧光。这是因为存在红色荧光JC1聚合体，这是高MMP的标志。

在使用β-六氯危险症治疗的细胞中，红绿色JC1荧光由于存在绿色荧光JC1单体而减少，这是低MMP的标志。最后，随着乙氯二制六氯六基六氯基暴露浓度的增加，氧气消耗率也有所下降，进一步表明这种农药损害了适当的线粒体功能。哦，好吧，尝试这个程序，重要的是记住，看到细胞适合测试它。

其发展，为基础功能领域的研究探索相关生物体的相关医学作用铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何检测数量或质量、容量、现在的成员或喷口表下的潜在功能有一个很好的了解。