基于色谱的生物分子纯化方法
在生物化学中，基于色谱的纯化方法被用于从复杂混合物中分离化合物。生物化学家常用的两种此类方法是凝胶过滤色谱和亲和色谱。在凝胶过滤色谱中，填充有多孔微珠的色谱柱根据分子大小对混合物中的组分进行分离。而亲和色谱则利用含有针对特定目标分子的配体的固定相色谱柱，实现对生物大分子更特异性的分离。
本视频介绍了…
“色谱法”指用于从复杂混合物中分离出某一组分的各种方法，这是在确定生物分子的性质和活性之前必不可少的步骤。每种色谱技术具有不同的分离机制，具体取决于样品基质和目标化合物。本视频将重点介绍生物化学中两种常用方法——凝胶过滤色谱和亲和色谱的基本原理与操作过程。
凝胶过滤色谱法或尺寸排阻色谱法（SEC）基于样品中化合物的大小进行分离。将含有样品的流动相加入到装有多孔材料（即固定相）的色谱柱中。样品中的分子可分为以下3类。
过大而无法进入凝胶孔径的分子将沿最短路径通过层析柱。任何分子量超过此“排阻极限”的物质都将在同一时间从层析柱中流出。能够自由进入孔径的小分子将被保留最长时间，并一同从层析柱中洗脱。允许分子完全进入孔径的分子量称为“渗透极限”。
只有分子量介于这两个范围之间的分子才会彼此分离，因为它们扩散进入和离开孔隙所需的时间各不相同。较小的分子在柱中保留时间更长，因为它们在固定相中停留的时间更久；而在此范围内较大的分子则会较早流出。
跨越1到2个数量级的分子量均在此范围内。应根据此原则选择色谱柱，若目标化合物的分子量范围较宽，可串联使用多根色谱柱。
现在你已经了解了尺寸排阻色谱（SEC）的理论，接下来让我们看看它是如何操作的。
开始进行凝胶过滤层析（SEC）操作时，必须先用去离子水和层析缓冲液对层析柱进行平衡。准备就绪后，将含有样品的缓冲液注入层析柱中。随后以较低流速推动缓冲液通过层析柱。检测器监测从层析柱流出的组分，以确定目标分析物的存在。分子量超过排阻限的大分子会同时从层析柱中流出。从层析柱中流出的小分子组分被收集于各收集管中。每个组分均通过凝胶电泳或其他分析技术检测目标分子的质量。
现在让我们来看一下亲和层析（AC），这是纯化蛋白质最有效的方法之一。许多生物分子能够选择性地结合特定配体，亲和层析正是利用了这一特性，通过将针对目标分子的特异性配体固定在固定相上来实现分离纯化。
当混合物流经层析柱时，目标分子会结合到配体上，而其他组分则流过柱子。待混合物完全通过后，可根据特异性选择两种洗脱方法之一来收集目标分子。
生物特异性洗脱可分为“正向”或“反向”作用模式。在正向作用的生物特异性洗脱中，加入一种试剂，该试剂与已结合的配体竞争结合目标生物分子。
在反向作用的生物特异性洗脱中，一种试剂会与目标分子竞争结合固定的配体。第二种洗脱方式为非特异性洗脱，通过改变溶液的 pH、离子强度或极性来降低目标分子与配体之间的结合力。如果某种蛋白质无法结合可固定的配体，则可对该蛋白质进行表达修饰，使其包含一种“标签”：即一段经基因工程设计的短肽序列，可特异性结合该配体。
其中一种方法是固定化金属离子亲和层析，简称 IMAC，该方法利用结合在介质上的金属配体（如镍或钴）与修饰蛋白上的组氨酸残基结合。通过分子生物学技术，可使目标蛋白带有重复的组氨酸残基，称为多聚组氨酸标签（polyhistidine-tag），其通过组氨酸残基上的咪唑侧链与金属离子结合。蛋白结合后，可通过游离咪唑进行特异性洗脱，从而回收目标蛋白，并可用于多种后续实验。现在我们已经了解了亲和层析的基本原理，接下来让我们来看一下在实验室中如何进行 IMAC 操作。
在IMAC中，可将固定相直接加入流动相与样品的混合物中，以促进带his标签的蛋白质结合。然后将此悬浊液倒入层析柱中，未结合的组分随流出液进入废液，而悬浊液则保留在柱内。随后用冲洗液洗涤悬浊液容器，以收集残留的树脂和样品，并将其一并加入层析柱中。
搅拌树脂以确保未结合的组分能够自由流动。加入洗涤缓冲液有助于将其冲洗掉。当所有未结合的组分均被去除后，更换废液收集容器，改为使用容器收集目标蛋白。
加入含有咪唑的缓冲液，混匀并静置，以解离目标分子。咪唑与金属结合，取代并释放出带标签的蛋白质。收集游离的蛋白质，并重复咪唑洗脱步骤，以确保完全回收。为进一步纯化样品，可在分析前对样品进行尺寸排阻色谱（SEC）分离。
现在我们已经了解了这两种技术的原理和操作步骤，接下来让我们看看它们在生物化学领域中的一些应用方式。
纯化蛋白质的常见原因之一是研究其在疾病中的作用。囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein，简称CFTR）的缺陷引起的。在酵母中表达带有his标签的该蛋白后，可通过亲和层析和凝胶过滤层析分离纯化该蛋白，进而研究其功能。
在某些情况下，多聚组氨酸标签的存在可能会改变蛋白质的结构，从而影响其功能。另一种常见的标签是麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein, MBP），它能够与柱中固定的淀粉结合。随后使用麦芽糖将复合物洗脱下来。然后可通过凝胶过滤层析（SEC）切除并去除MBP，以获得纯净的目标蛋白质。
您刚刚观看了 JoVE 关于尺寸排阻色谱和亲和色谱的视频。该视频介绍了这些技术的原理，概述了一般操作步骤，并讲解了这些技术的一些应用。
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Q1: How does size-exclusion chromatography separate molecules in a mixture?
Size-exclusion chromatography separates molecules based on their size using a column packed with porous material. Large molecules cannot enter the pores and exit first, while small molecules enter the pores and exit last. Only molecules between the exclusion and permeation limits are separated from one another as they spend varying amounts of time diffusing in and out of the pores.
Q2: What are the three molecular weight categories in size-exclusion chromatography?
Molecules fall into three categories: those above the exclusion limit that cannot enter pores and exit together first; those below the permeation limit that freely enter pores and exit together last; and those between these limits that separate based on varying retention times. Molecular weights across one to two orders of magnitude typically fall within the separation range.
Q3: How does affinity chromatography use ligands to purify target proteins?
Affinity chromatography attaches target-specific ligands to the stationary phase. When a mixture flows through the column, target molecules selectively bind to the ligands while other components pass through. The target protein is then collected through elution methods that either compete with the ligand or change solution conditions like pH or ionic strength.
Q4: What is a polyhistidine tag and how is it used in immobilized metal affinity chromatography?
A polyhistidine tag is a short peptide sequence of repeating histidine residues engineered onto target proteins. In immobilized metal affinity chromatography, these tags bind to adhered metal ligands like nickel or cobalt via the imidazole side chain on histidine. The tagged protein is then released using free imidazole via reverse-role specific elution.
Q5: What steps are involved in the immobilized metal affinity chromatography procedure?
The IMAC procedure involves adding the stationary phase directly to the sample mixture to allow his-tagged protein binding. The slurry is poured into a column where unbound compounds drain to waste. After washing to remove unbound components, imidazole buffer is added to release the target protein by competing with the metal ligand.
Q6: Why might researchers combine size-exclusion and affinity chromatography in protein purification?
Researchers combine these techniques to achieve higher purity levels. After affinity chromatography isolates the target protein using ligand binding, size-exclusion chromatography can further purify the sample by separating based on molecular size. This sequential approach is particularly useful when protein tags like polyhistidine may affect protein structure or function.
Q7: How is gel electrophoresis used to evaluate fractions collected from size-exclusion chromatography?
After fractions are collected from the size-exclusion column, gel electrophoresis and other analytical techniques are used to test the quality and identity of the target molecule in each fraction. This verification step ensures that the desired biomolecule has been successfully isolated and separated from other components in the mixture.