4.6: 基于色谱的生物大分子分离纯化方法

"色谱法"是指用于从复杂混合物中分离成分的广泛方法，这是确定生物分子的性质和活性之前必不可少的步骤。每种色谱技术都有不同的分离机制，具体取决于样品基质和目标化合物。本视频将重点介绍生物化学中两种常见方法的原理和作：体积排阻和亲和色谱。

体积排阻色谱法 （SEC） 基于样品中化合物的大小。将含有样品的流动相添加到具有多孔材料的色谱柱中：固定相。样品中的分子属于 3 类中的 1 类。

太大而无法进入孔隙的分子在色谱柱中的行进距离最短。分子量高于此"排除限"的任何物种都将同时退出色谱柱。小到可以自由进入孔隙的分子将保留最长时间，并将一起离开色谱柱。允许完全进入孔的分子量是"渗透极限"。

只有这些限制之间的分子才会彼此分离，因为它们需要不同的时间扩散进出孔隙。较小的分子在色谱柱上的保留时间较长，因为它们在固定相中停留的时间更长，而在这些限制内的较大分子则更早退出。

1 到 2 个数量级的分子量在这些限制范围内。考虑到这一点，选择色谱柱时，如果有广泛的所需化合物，则可以串联使用多个色谱柱。

现在您已经了解了 SEC 的理论，让我们看看它是如何实现的。

要开始 SEC 程序，必须用去离子水和色谱缓冲液平衡色谱柱。制备完成后，将含有样品的缓冲液注入色谱柱。然后以低流速将缓冲液推过。检测器监测从色谱柱中流出的物质，以确定是否存在所需的分析物。分子量高于排阻极限的大分子同时从色谱柱中流出。将色谱柱中的小部分收集在试管中。通过凝胶电泳或其他分析技术测试每个馏分的目标分子的质量。

现在让我们看一下亲和层析或 AC，这是纯化蛋白质的最有效方法之一。许多生物分子选择性地与某些配体结合，AC 通过将靶标特异性配体粘附到固定相上来利用这种特性。

当混合物流经色谱柱时，目标分子附着在配体上，其余分子流过。混合物通过色谱柱后，可以根据特异性通过两种洗脱方法之一收集目标分子。

生物特异性洗脱可以说具有"正常"或"反向作用"。在正常作用的生物特异性洗脱中，添加一种与粘附的配体竞争与目标生物分子结合的试剂。

在反向作用生物特异性洗脱中，试剂与靶标竞争以结合粘附的配体。第二种洗脱类型，非特异性洗脱，通过改变溶液的 pH 值、离子强度或极性来降低靶标与配体的结合。如果蛋白质不与可固定的配体结合，则该蛋白质可以表达包含"标签"的蛋白质：经过工程改造以与配体结合的短肽序列。

一种是固定化金属离子亲和层析法，简称"IMAC"，其中粘附的金属配体（如镍或钴）与修饰蛋白上的组氨酸残基结合。通过分子生物学技术，靶蛋白由重复的组氨酸残基产生，称为多聚组氨酸标签，它通过组氨酸上的咪唑侧链与金属结合。结合后，可以通过反向角色特异性洗脱用游离咪唑收集蛋白质，然后用于各种下游应用。现在您已经了解了亲和层析的理论，让我们看看实验室中的 IMAC 程序。

在 IMAC 中，固定相可以直接添加到流动相和样品的混合物中，从而允许结合 his 标记的蛋白质。然后将这些浆料倒入塔中，在那里，非结合化合物滴入废液中，而浆料则保留下来。冲洗浆料容器以收集残留树脂和样品，然后将其添加到色谱柱中。

搅拌填料以确保未结合的组分自由流动。添加的洗涤缓冲液有助于将它们冲走。去除所有未结合的组分后，用容器替换废液以收集目标蛋白。

加入含有咪唑的缓冲液，搅拌并静置以解绑目标分子。咪唑与金属结合，取代并释放标记的蛋白质。收集释放的蛋白质，并重复咪唑步骤以确保完全收集。为了进一步纯化样品，可以在分析前对样品运行 SEC。

现在我们已经了解了这两种技术的理论和过程，让我们看看它们在生化领域的一些应用方式。

纯化蛋白质的一个常见原因是研究它们在疾病中的作用。囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜传导调节蛋白 （CFTR） 缺陷引起的。在酵母中培养带有 his 标签的蛋白质后，亲和层析和尺寸排阻层析都可以分离蛋白质，然后研究其功能。

在某些情况下，多聚组氨酸标签的存在会改变蛋白质的结构，从而影响其功能。另一个常见的标签是麦芽糖结合蛋白或 MBP，它将与柱中结合的直链淀粉结合。然后使用麦芽糖来释放复合物。然后，可以切割 MBP 并用 SEC 去除，以产生所需的纯蛋白。

您刚刚观看了 JoVE 关于体积排阻和亲和层析的视频。它涵盖了技术的理论，介绍了一般程序，并涵盖了这些技术的一些用途。

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