通过生物层干涉技术检测离子通道蛋白与小分子相互作用动力学

本生物膜干涉（BLI）检测的总体目标是测量纯化的hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质之间可能发生的相互作用。该方法有助于解答离子通道药理学领域中的关键问题，例如：感兴趣的小分子是否能够直接与该离子通道相互作用，以及该相互作用的动力学特征如何？该技术的主要优势在于其无需人工干预且通量高。

仅需少量固定化的蛋白质。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为成功的检测涉及多个步骤，包括蛋白质表达、纯化、标记、传感器的精确调校以及数据分析。在培养稳定表达hEAG1的HEK293 T细胞两到三天后，移除培养基以收获细胞，并用四毫升PBS洗涤细胞两次。

弃去 PBS。每皿用 2 毫升 PBS 重悬细胞，使用 1 毫升移液器将细胞转移至 15 毫升离心管中。在 4 摄氏度条件下，以 420 ×g 离心 5 分钟。

然后，倾去上清液，并用4 mL裂解缓冲液重悬沉淀。将悬液置于冰上孵育30分钟，每隔10分钟彻底涡旋震荡裂解物一次。接着，将细胞裂解物在4 ℃条件下以12,000 ×g离心10分钟。

然后，将上清液转移至一个5毫升离心管中，并置于冰上以备立即使用。为制备抗FLAG M2亲和树脂，通过轻柔倒置充分悬浮树脂，确保抗FLAG M2亲和凝胶瓶中的凝胶珠形成均匀的悬浮液。立即取400 µL悬浮液转移至预冷的1.5毫升离心管中。

然后，在4 °C条件下以8,000 × g离心悬浮液30秒，并小心弃去上清液以去除保存缓冲液。为重悬树脂沉淀，向树脂中加入500 µL蛋白质提取物上清液，并将悬浮液转移至一个新的预冷的5 mL离心管中。用移液器吸取额外的500 µL蛋白质提取物加入原管中，以收集任何残留的树脂珠，再将提取物转移至5 mL离心管中。

将混合物在摇床上以 8 rpm 的速度于 4 °C 过夜孵育，使 FLAG 融合蛋白与树脂结合。然后在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并用 500 µL 1× PBS 将沉淀洗涤三次。

置于冰上以备立即使用。将10微升3×FLAG洗脱液加入390微升PBS中，终浓度为200纳克/微升。然后，向先前制备的凝胶珠中加入400微升3×FLAG洗脱液。

将样品置于摇床培养箱中，在 8 rpm 和 4 °C 条件下孵育 2 小时。然后在 8000 ×g 条件下离心 30 秒。将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，并于 4 °C 保存以立即使用。

根据制造商说明书使用BCA蛋白检测试剂盒测定纯化蛋白的浓度。然后，取30微升样品进行Western Blot分析，使用抗Flag抗体确认目标蛋白已被成功纯化。为用生物素标记纯化蛋白，需在PBS中配制5毫克/毫升的生物素储存液。

每次测试两种生物传感器时，向20微克纯化蛋白中加入三倍摩尔过量的生物素，以在PBS中实现纯化蛋白优先的N端生物素标记。将样品置于冰上避光孵育至少30分钟。为去除未结合的生物素和缓冲液，将蛋白置换至SD缓冲液中。

将蛋白质转移至截留分子量为30千道尔顿的超滤装置中。然后加入SD缓冲液，在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。从离心管中移除超滤液。

向滤膜装置中加入200微升SD缓冲液，再次离心样品。重复此步骤至少三次。通过翻转滤膜装置收集完成缓冲液置换的样品，并将其置于1.5毫升离心管中。

将样品在 2,000 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。立即将样品置于冰上备用。为进行 BLI 检测，在研究开始前 30 分钟，通过开启仪器对设备进行预热。

开始前请检查仪器状态窗口，确认设备处于就绪状态。在打开数据采集软件之前，确保仪器门已关闭；在实验向导中选择“新建动力学实验”。通过右键单击定义96孔板上要使用的孔，并选择缓冲液、负载和样品。

对于样品孔，PIP2 的浓度单位应以摩尔（molars）输入。要定义检测步骤时，选择一个步骤，然后双击相应的列。对照传感器将设置相同的检测定义副本。

将转速设为 1,000 rpm。基线步骤选择 1 分钟，上样、结合和解离步骤分别选择 5 至 10 分钟。在室温下进行检测。

单击包含传感器的列，然后单击填充以指示传感器在传感器板中的位置。仔细检查所有计划步骤以查找错误，并返回进行更正。在整个BLI实验操作中，研究人员可能会忽略检查所有计划步骤这一步骤。

然而，必须仔细检查所有计划步骤是否正确。设置数据文件的存储位置，然后单击“开始”以启动检测。按照文本方案运行检测并分析数据。

如在稳定表达hEAG1的HEK293T细胞的膜片钳实验中所见，电压依赖性外向钾电流表明功能性hEAG1通道在细胞中高表达。利用抗FLAG抗体对纯化的蛋白样品进行hEAG1的蛋白质印迹分析，显示了纯化蛋白的质量和特异性。纯化的通道蛋白经生物素标记后，用于与脂质PIP2进行实时BLI相互作用分析。

此处展示的是hEAG1与PIP2之间典型的结合曲线。hEAG1以浓度依赖的方式与PIP2结合。累积的PIP2浓度对应于生物传感器的数据轨迹。

该代表性实验展示了不同浓度 PIP2 条件下光学干涉信号的变化。最终，通过拟合不同 PIP2 浓度下测得的光学干涉信号峰值，采用 Hill 方程进行曲线拟合，确定了 hEAG1 与 PIP2 之间的平衡解离常数。一旦掌握，若操作得当，该技术可在约一小时内完成。

在尝试此操作步骤时，非常重要的一点是仔细回顾所有计划中的步骤，以确保该操作流程的正确性。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如膜片钳技术），以回答更多科学问题，例如鉴定小分子结合后该离子通道的功能变化。该技术一经建立，便为离子通道配体筛选领域的研究人员探索离子通道药物发现中的新型配体铺平了道路。

观看本视频后，您应能够充分理解如何制备离子通道蛋白，以及如何利用生物膜干涉技术（BLI）检测其与小分子的相互作用。