Name: 用生物层干涉法捕获小分子离子通道蛋白的相互作用动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习使用生物层干涉法测定hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质配体PIP2的相互作用动力学。该方法具有高通量、样品用量少的优势，可为离子通道药物筛选提供可靠工具。

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本工作由生物身份识别中心和上海交通大学医工交叉研究基金（YG2016QN66）、国家自然科学基金（31271217）以及国家重点基础研究发展计划（2014CB910304）资助。

注意：通过将含有在远端C末端带有FLAG标签的hEAG1 DNA序列的pCDH慢病毒质粒转染至HEK-293T细胞，随后进行嘌呤霉素抗性筛选，构建稳定表达FLAG标记的hEAG1通道蛋白的HEK-293T细胞系，具体方法如前所述15。
1. 从 HEK-293T 细胞中亲和纯化 FLAG 标签标记的人源 hEAG1 通道蛋白
<ol>
	<li>迅速将稳定表达 hEAG1 通道的细胞从液氮中取出并放入温水（37 °C）中解冻。将细胞（约 5 × 106 冻存细胞）接种至 10 cm 培养皿中。在含 8 mL 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 4 mM L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养过夜，并于次日更换培养基。</li>
	<li>使用荧光显微镜检测这些 HEK-293T 细胞的 GFP 荧光，以确认在培养体系中高比例的细胞稳定表达 hEAG1 通道。在室温下用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶对生长中的细胞进行指数期消化 1 分钟，然后加入 2 mL 含血清的培养液终止消化。将 400 μL 细胞悬液转移至含有 15 mL 完全 DMEM 培养基的 15 cm 培养皿中。共准备四个 15 cm 培养皿。</li>
	<li>在培养 2–3 天、细胞融合度达到约 90% 时收获细胞。
	<ol>
		<li>移除细胞的生长培养基，并用 4 mL 磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH = 7.4）洗涤细胞两次。</li>
		<li>洗涤后弃去 PBS。</li>
		<li>使用细胞刮刀将每个培养皿中的细胞刮入 2 mL 1× PBS 中，并用 1 mL 移液器将刮下的细胞转移至 15 mL 离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 420 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>倾去并弃除上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于总共 4 mL 裂解缓冲液（10 mM HEPES、1.5 mM MgCl2、10 mM NaCl、1% NP-40，pH 7.0，含完全蛋白酶抑制剂）中，冰上孵育 30 分钟，每隔 10 分钟充分涡旋混匀一次。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至 5 mL 管中，置于冰上备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备抗 FLAG M2 亲和树脂。
	<ol>
		<li>通过轻柔倒置充分悬浮树脂（以储存缓冲液中的 50% 悬浮液形式提供），确保抗 FLAG M2 亲和凝胶瓶内为均匀的凝胶珠悬浮液。</li>
		<li>立即取 400 μL 悬浮液转移至预冷的 1.5 mL 管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 8,000 × g 离心 30 秒，小心弃去上清液以洗去储存缓冲液。</li>
		<li>向树脂中加入 500 μL 1× PBS，并用 1 mL 移液器重悬沉淀。然后在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 30 秒，小心弃去上清 PBS。重复此洗涤步骤以彻底清除储存缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤 1.3.8 制备的 500 μL 蛋白提取物上清液加入树脂沉淀中以重悬沉淀，并将悬液转移至新的预冷 5 mL 管中。重复此操作以确保无凝胶珠残留。将剩余的蛋白提取物加入混合液中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 8 rpm 摇床孵育混合物过夜，以捕获 FLAG 融合蛋白。</li>
	<li>孵育 12 小时后，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并用 500 μL 1× PBS 洗涤沉淀三次。置于冰上备用。</li>
	<li>使用 3× FLAG 肽洗脱 FLAG hEAG1 蛋白。
	<ol>
		<li>配制 3× FLAG 洗脱液。将 3× FLAG 肽溶解于 500 μL 储存液（0.5 M Tris-HCl，1 M NaCl，pH = 7.5）中，终浓度为 8 μg/μL。</li>
		<li>将 10 μL 3× FLAG 洗脱液加入 390 μL PBS 中，配制成终浓度为 200 ng/μL 的溶液。</li>
		<li>向步骤 1.8 制备的凝胶珠中加入 400 μL 3× FLAG 洗脱液。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 8 rpm 摇床孵育样品 2 小时。</li>
		<li>以 8,000 × g 离心树脂 30 秒。</li>
		<li>将上清液转移至新的 1.5 mL 管中，于 4 °C 保存以备立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用BCA蛋白检测试剂盒和蛋白质印迹法测定并验证纯化的FLAG融合hEAG1的浓度
<ol>
	<li>根据制造商说明书，使用BCA蛋白检测试剂盒测定纯化蛋白的浓度。</li>
	<li>取30 μL样品进行Western分析，使用ANTI-FLAG抗体检测目标蛋白是否已成功纯化，方法如前所述15。</li>
</ol>
3. 为BLI实验用生物素标记纯化的通道蛋白
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 5 mg/mL 的生物素储存液。每次检测（两个生物传感器）时，在 20 μg 纯化蛋白中加入 3 倍摩尔过量的生物素，以在 PBS 中实现纯化蛋白优先的 N 端生物素标记。</li>
	<li>将样品置于冰上避光孵育至少 30 分钟。</li>
	<li>配制样品稀释（SD）缓冲液：含 0.02% 吐温-20 和 0.1% 牛血清白蛋白（BSA，pH 7.4）的 PBS。</li>
	<li>通过超滤法将纯化的通道蛋白缓冲液置换为 SD 缓冲液。使用截留分子量为 30 kDa 的超滤装置，加入 SD 缓冲液后，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟，以去除未结合的生物素。</li>
	<li>从超滤装置的离心管中移除滤出液，向滤膜装置中加入 200 μL SD 缓冲液，并在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。重复此操作至少三次。</li>
	<li>为收集完成缓冲液置换的样品，将滤膜装置反向插入 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 5 分钟。将样品置于冰上，立即使用。</li>
</ol>
4. 检测用PIP2溶液的制备
<ol>
	<li>按照先前所述方法17，将PIP2溶于去离子H2O中，配制成1 mM的储备液，并在冰上超声处理30分钟。将该溶液储存于玻璃小瓶中，置于-20 °C保存；在实验前通过剧烈涡旋震荡，将其稀释至所需终浓度。</li>
</ol>
5. BLI 检测
<ol>
	<li>打开设备并检查 &#34;仪器状态&#34; 确认设备已就位的窗口 &#34;准备就绪&#34; 在进行生物发光成像（BLI）研究前，需至少预热设备30分钟。</li>
	<li>确保在打开数据采集软件之前已关闭仪器门，并选择 &#34;新的动力学实验&#34; 在实验向导中。</li>
	<li>在96孔板上通过右键单击定义将要使用的孔，选择缓冲液、加载液和样品。对于样品孔，应以摩尔浓度输入生物素化FLAG融合hEAG1蛋白的浓度单位（10 μg，0.09 μM）。</li>
	<li>定义检测步骤，包括基线、加载、结合和解离。选择一个检测步骤，双击相应的列。对照传感器设置相同的检测定义。将转速设为1,000 rpm。基线步骤持续1分钟，加载、结合和解离步骤分别持续5–10分钟。在室温（约24 °C）下进行实验。 
	注意：主要有两种操作流程：将生物素化通道蛋白加载至传感器，以及检测其与小分子化合物的相互作用。这两种流程可连续进行（基线、加载、基线、结合与解离）。或者，也可分步进行，以便在蛋白加载失败时避免浪费待测化合物。</li>
	<li>点击包含传感器的列，然后点击 &#34;填充&#34; 用于指示传感器托盘中传感器的位置。</li>
	<li>检查所有计划步骤，查找错误并返回修正。</li>
	<li>设置数据文件的位置并点击 &#34;开始&#34; 开始实验。 
	注意：传感器需在SD缓冲液中预湿至少10分钟，若此步骤已完成，则继续下一步 &#34;延迟实验开始&#34; 应跳过该设置。否则，在预润湿传感器前设置600秒延迟。</li>
	<li>将一块黑色96孔板放入托盘底部，并将板的A1角插入托盘的凹槽中以固定板。在96孔板的A行2个孔和B行2个孔中，每孔加入200 μL检测缓冲液，用于加载传感器。</li>
	<li>另准备一块黑色96孔板作为样品板，根据步骤5.3中的程序设定，在B行各孔中加入200 μL SD缓冲液作为对照，A行各孔中加入200 μL生物素标记的hEAG1蛋白溶液（10 μg）。 
	注意：避免引入气泡。</li>
	<li>打开仪器门，将传感器托盘和样品板分别插入左侧和右侧的板架中。根据左侧板架的形状，检查传感器托盘和样品板是否已正确放置 &#34;A1&#34; 右培养皿架右上角的标记。关闭门并开始检测。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>打开数据分析软件，加载包含检测数据的文件夹。点击 &#34;处理&#34; 进入处理菜单界面后，我们可以看到彩色的原始动力学曲线。</li>
	<li>下 步骤1: &#34;数据选择&#34;，点击 &#34;传感器选择&#34;。在 &#34;传感器托盘 #1&#34;，仅点击用SD缓冲液润湿的传感器孔，然后右键单击 &#34;更换传感器类型&#34; 到 &#34;参考传感器&#34;. 在“样本板图”上&#34;，指定所有非特异性结合孔，然后右键单击 &#34;更换孔板类型&#34; 到 &#34;参照孔&#34;.</li>
	<li>勾选方框前 &#34;减法&#34; 步骤2的要点 &#34;双参照&#34;.</li>
	<li>在 步骤 3: &#34;对齐 Y 轴&#34;，选择 &#34;基线&#34; 作为比对步骤。对于 &#34;时间范围&#34;，输入该基线的最后10秒 即 从：0.1 至：59.8</li>
	<li>在 步骤 4: &#34;步骤间校正&#34;，选择 &#34;与基线对齐&#34; 以最小化结合与解离步骤之间的信号漂移。</li>
	<li>在 步骤 5: &#34;过程&#34;在大多数情况下，选择Savitzky-Golay滤波函数并继续操作 &#34;处理数据&#34;.</li>
	<li>在第7步中保存原始数据，以便使用其他软件进行进一步的数据分析。 &#34;保存结果&#34;.</li>
	<li>点击 &#34;分析 | 曲线拟合&#34;.
	<ol>
		<li>对于 &#34;分析步骤&#34;，选择 &#34;结合 | 解离&#34;。对于 &#34;模型&#34;，选择1:1。 
		注意：我们选择1:1模型是因为它在原始数据上拟合良好，并且避免了在1:2或2:1模型下由于自由度较高而可能出现的过拟合问题。但此处还提供其他选项，可根据不同分析物的结合模型，适当地选择用于其他拟合分析。</li>
		<li>对于 &#34;拟合&#34;，选择“全球（完整）”。对于 &#34;分组&#34;，选择 &#34;颜色&#34;选择 &#34;Rmax 未与传感器关联&#34; 以实现对最大信号响应（Rmax）的独立拟合。</li>
		<li>点击 &#34;拟合曲线！&#34; 开始非线性回归分析。本研究中采用了Hill方程和单指数函数。</li>
		<li>点击 &#34;数据导出 | 保存报告&#34; 以保存拟合结果。或点击 &#34;数据导出 | 导出拟合结果&#34; 以保存原始数据，供后续使用其他软件进行绘图和数据分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

膜离子通道已被证实为目前超过13%已知药物的主要治疗靶点，这些药物用于治疗包括心血管和神经系统疾病在内的多种人类疾病18膜片钳记录是测量离子通道在小分子作用下功能的金标准，已广泛用于离子通道配体的筛选。然而，此类电生理学方法无法证明小分子是否直接与通道结合。19，因为小分子可能作用于其他与该通道相互作用的蛋白质或细胞内信号通路。与广泛使用的放射性配体结合实验及其他常见的无标记生物传感器方法相比，BLI在实验装置相对简单、结合相不受限制、高通量、实验设计更接近体内系统以及所需固定化蛋白量少（仅需少量）等方面具有显著优势 &#956;g），并可提供有关动力学数据的详细信息5,6,20.
为了最大程度地模拟体内情况，我们从哺乳动物稳定表达系统中纯化了&#160;具有功能活性的hEAG1通道蛋...

利用小分子靶向细胞表面可及的离子通道蛋白，在配体筛选和生物药物发现方面具有巨大潜力1,2,3因此，需要一种合适的工具来研究离子通道与&#160;小分子及其相应功能。膜片钳记录技术已被证明是在离子通道功能检测中具有独特性和不可替代性的方法。然而，确定小分子是否直接作用于离子通道还需要借助其他技术。传统上，放射性配体结合实验被用于观察小分子与其靶向离子通道蛋白之间的结合动力学。但由于该技术需要进行放射性标记与检测，其应用受到限制。此外，研究中对小分子配体进行标记的先决步骤，使其无法应用于许多尚未发现特异性配体的离子通道。一些无标记技术，如核磁共振波谱法、X射线衍射、微尺度热泳动（MST）4 表面等离子共振（SPR）已被用于检测蛋白质与小分子之间的相互作用。然而，由于难以获得全长蛋白质、动力学分辨率低、通量低以及成本高等因素，这类检测通常无法提供足够的信息5与这些技术相比，生物膜干涉技术（BLI）正作为一种新兴的无标记方法出现，通过将微量蛋白质样品固定在生物传感器表面并检测光学信号的变化，从而克服上述在检测蛋白质-小分子相互作用时的局限性。6,7作为一种有前景的生物传感器平台，BLI技术已被用于观察小分子与天然水溶性蛋白质（如人源单克隆抗体CR8020）之间的相互作用。8 详细的检测步骤已在之前的文章中报道过9尽管离子通道蛋白在发现新治疗靶点中的关键作用已被公认，但基于BLI的离子通道蛋白-小分子相互作用检测方法尚未见报道。
人类 ether-à-go-go 人源电压门控钾通道（hEAG1）在多种癌细胞和中枢神经系统中均有表达，这使得该通道成为多种癌症和神经疾病潜在的治疗靶点10,11,12,13,14我们实验室的电生理学研究已证实磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP₂）的抑制作用。2在hEAG1通道上的作用15根据我们的结果，建议检测PIP2 直接利用BLI技术研究hEAG1与小分子化合物的相互作用，可作为其他类型离子通道蛋白与小分子化合物相互作用的研究模型，尤其适用于缺乏特异性配体的通道。根据BLI检测的操作说明，我们制备了生物素标记的hEAG1蛋白，并将其固定在链霉亲和素（SA）生物传感器探针表面，随后与PIP进行相互作用分析2 溶液以观察蛋白质与脂质之间的直接结合。在PIP结合后2 hEAG1蛋白包被的表面，表面层的厚度增加，这与光谱位移直接相关，并可实时测量16结合动力学可通过结合阶段的正向偏移和解离阶段的负向偏移来确定。根据这一原理，我们利用亲和纯化方法从HEK-239T稳定表达系统中纯化出具有功能活性的hEAG1离子通道蛋白，以保持其 体外 功能状态，随后检测了不同浓度 PIP 结合的动力学2，并在电生理测量中观察到相似的动力学数据15生物发光成像与电生理测量结果的高度一致性首次证明了生物发光成像（BLI）作为离子通道膜蛋白与小分子相互作用分析工具的适用性。

<table><tbody><tr><td>DMEM/高糖培养基</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1×）</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>1697550</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>150 mm × 25 mm</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 替代物</td><td>Amresco</td><td>E109</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610476</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610440</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600332</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯-20-山梨醇单月桂酸酯</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 亲和凝胶</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG 肽</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/Fort&amp;eacute;Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>数据采集软件</td><td>Pall/Fort&amp;eacute;Bio</td><td>Version 7.1</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Pall/Fort&amp;eacute;Bio</td><td>Version 7.1</td><td></td></tr><tr><td>生物传感器/链霉亲和素</td><td>Pall/Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5019</td><td></td></tr><tr><td>微量滴定板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS-LC-LC-生物素</td><td>ThermoFisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>ThermoFisher</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白 Marker</td><td>ThermoScientific</td><td>318120</td><td></td></tr><tr><td>超滤装置</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC503008</td><td>截留分子量 30 kDa</td></tr><tr><td>磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>P9763</td><td></td></tr><tr><td>单克隆 ANTI-FLAG M2 抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>1:2000 稀释</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 HRP 标记二抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>1:5000 稀释</td></tr><tr><td>增强型 BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>04693159001</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600 成像系统</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western blot 系统</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过生物层干涉技术检测离子通道蛋白与小分子相互作用动力学

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

生物膜层干涉技术（BLI）是一种用于检测蛋白质-蛋白质及蛋白质-小分子相互作用的有效工具。本文首先介绍了这种新型无标记技术在研究人源EAG1（hEAG1）通道蛋白与小分子PIP2相互作用中的应用。由于hEAG1通道在多种癌症中异常高表达，并且存在一些与神经系统疾病相关的功能获得性突变，因此被认为是一个潜在的治疗靶点。我们从哺乳动物稳定表达系统中纯化了&#160;hEAG1通道蛋白，并利用BLI技术检测其与PIP2的相互作用。成功测定hEAG1蛋白与PIP2之间的结合动力学表明，BLI技术可作为离子通道药理学中新型小分子配体筛选的一种潜在高通量方法。

我们从稳定过表达hEAG1的HEK-293T细胞中纯化了FLAG融合的hEAG1通道蛋白。该融合蛋白的功能已通过膜片钳技术得到验证，纯化蛋白的质量和特异性通过Western blot确认（图1）。将纯化的通道蛋白进行生物素标记，用于通过实时BLI检测与脂质（PIP2）的相互作用。BLI结合检测的实验配置如图2所示。典型的hEAG1与PIP2结合曲线如图3所示。本实验中，将3 μM PIP2溶解于PBS缓冲液中（PIP2的结构见补充图1），并采用双参考减法分析信号，以扣除非特异性结合（传感器与PIP2之间的结合）、背景信号（生物素标记的hEAG1蛋白与PBS之间的相互作用）以及由传感器差异引起的信号漂移（传感器与PBS之间的结合）。结合曲线经全局拟合，显示...

本方案描述了纯化的hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质配体磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）之间的相互作用。实验结果表明，生物膜干涉技术（BLI）可能成为一种用于新型小分子离子通道配体筛选的潜在方法。

生物层干涉技术（BLI）检测是一种用于测定蛋白质-蛋白质及蛋白质-小分子相互作用的重要工具。本文首先描述……

本生物膜干涉（BLI）检测的总体目标是测量纯化的hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质之间可能发生的相互作用。该方法有助于解答离子通道药理学领域中的关键问题，例如：感兴趣的小分子是否能够直接与该离子通道相互作用，以及该相互作用的动力学特征如何？该技术的主要优势在于其无需人工干预且通量高。仅需少量固定化的蛋白质。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为成功的检测涉及多个步骤，包括蛋白质表达、纯化、标记、传感器的精确调校以及数据分析。在培养稳定表达hEAG1的HEK293 T细胞两到三天后，移除培养基以收获细胞，并用四毫升PBS洗涤细胞两次。弃去 PBS。每皿用 2 毫升 PBS 重悬细胞，使用 1 毫升移液器将细胞转移至 15 毫升离心管中。在 4 摄氏度条件下，以 420 ×g 离心 5 分钟。然后，倾去上清液，并用4 mL裂解缓冲液重悬沉淀。将悬液置于冰上孵育30分钟，每隔10分钟彻底涡旋震荡裂解物一次。接着，将细胞裂解物在4 ℃条件下以12,000 ×g离心10分钟。然后，将上清液转移至一个5毫升离心管中，并置于冰上以备立即使用。为制备抗FLAG M2亲和树脂，通过轻柔倒置充分悬浮树脂，确保抗FLAG M2亲和凝胶瓶中的凝胶珠形成均匀的悬浮液。立即取400 µL悬浮液转移至预冷的1.5毫升离心管中。然后，在4 °C条件下以8,000 × g离心悬浮液30秒，并小心弃去上清液以去除保存缓冲液。为重悬树脂沉淀，向树脂中加入500 µL蛋白质提取物上清液，并将悬浮液转移至一个新的预冷的5 mL离心管中。用移液器吸取额外的500 µL蛋白质提取物加入原管中，以收集任何残留的树脂珠，再将提取物转移至5 mL离心管中。将混合物在摇床上以 8 rpm 的速度于 4 °C 过夜孵育，使 FLAG 融合蛋白与树脂结合。然后在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并用 500 µL 1× PBS 将沉淀洗涤三次。置于冰上以备立即使用。将10微升3×FLAG洗脱液加入390微升PBS中，终浓度为200纳克/微升。然后，向先前制备的凝胶珠中加入400微升3×FLAG洗脱液。将样品置于摇床培养箱中，在 8 rpm 和 4 °C 条件下孵育 2 小时。然后在 8000 ×g 条件下离心 30 秒。将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，并于 4 °C 保存以立即使用。根据制造商说明书使用BCA蛋白检测试剂盒测定纯化蛋白的浓度。然后，取30微升样品进行Western Blot分析，使用抗Flag抗体确认目标蛋白已被成功纯化。为用生物素标记纯化蛋白，需在PBS中配制5毫克/毫升的生物素储存液。每次测试两种生物传感器时，向20微克纯化蛋白中加入三倍摩尔过量的生物素，以在PBS中实现纯化蛋白优先的N端生物素标记。将样品置于冰上避光孵育至少30分钟。为去除未结合的生物素和缓冲液，将蛋白置换至SD缓冲液中。将蛋白质转移至截留分子量为30千道尔顿的超滤装置中。然后加入SD缓冲液，在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。从离心管中移除超滤液。向滤膜装置中加入200微升SD缓冲液，再次离心样品。重复此步骤至少三次。通过翻转滤膜装置收集完成缓冲液置换的样品，并将其置于1.5毫升离心管中。将样品在 2,000 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。立即将样品置于冰上备用。为进行 BLI 检测，在研究开始前 30 分钟，通过开启仪器对设备进行预热。开始前请检查仪器状态窗口，确认设备处于就绪状态。在打开数据采集软件之前，确保仪器门已关闭；在实验向导中选择“新建动力学实验”。通过右键单击定义96孔板上要使用的孔，并选择缓冲液、负载和样品。对于样品孔，PIP2 的浓度单位应以摩尔（molars）输入。要定义检测步骤时，选择一个步骤，然后双击相应的列。对照传感器将设置相同的检测定义副本。将转速设为 1,000 rpm。基线步骤选择 1 分钟，上样、结合和解离步骤分别选择 5 至 10 分钟。在室温下进行检测。单击包含传感器的列，然后单击填充以指示传感器在传感器板中的位置。仔细检查所有计划步骤以查找错误，并返回进行更正。在整个BLI实验操作中，研究人员可能会忽略检查所有计划步骤这一步骤。然而，必须仔细检查所有计划步骤是否正确。设置数据文件的存储位置，然后单击“开始”以启动检测。按照文本方案运行检测并分析数据。如在稳定表达hEAG1的HEK293T细胞的膜片钳实验中所见，电压依赖性外向钾电流表明功能性hEAG1通道在细胞中高表达。利用抗FLAG抗体对纯化的蛋白样品进行hEAG1的蛋白质印迹分析，显示了纯化蛋白的质量和特异性。纯化的通道蛋白经生物素标记后，用于与脂质PIP2进行实时BLI相互作用分析。此处展示的是hEAG1与PIP2之间典型的结合曲线。hEAG1以浓度依赖的方式与PIP2结合。累积的PIP2浓度对应于生物传感器的数据轨迹。该代表性实验展示了不同浓度 PIP2 条件下光学干涉信号的变化。最终，通过拟合不同 PIP2 浓度下测得的光学干涉信号峰值，采用 Hill 方程进行曲线拟合，确定了 hEAG1 与 PIP2 之间的平衡解离常数。一旦掌握，若操作得当，该技术可在约一小时内完成。在尝试此操作步骤时，非常重要的一点是仔细回顾所有计划中的步骤，以确保该操作流程的正确性。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如膜片钳技术），以回答更多科学问题，例如鉴定小分子结合后该离子通道的功能变化。该技术一经建立，便为离子通道配体筛选领域的研究人员探索离子通道药物发现中的新型配体铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备离子通道蛋白，以及如何利用生物膜干涉技术（BLI）检测其与小分子的相互作用。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

用生物层干涉法捕获小分子离子通道蛋白的相互作用动力学

在本视频中，我们演示了生物层干涉技术（BLI），用于实时检测配体与目标分析物之间的分子间相互作用。BLI通过测量白光从生物传感器表面固定化配体层反射后产生的干涉图样变化，来监测溶液中分析物与配体相互作用时所引起的变化。...

生物层干涉技术检测配体与分析物之间的相互作用

本文所述方案介绍了利用生物膜干涉技术（Bio-layer...

生物层干涉技术用于测定蛋白质-蛋白质相互作用动力学及变构配体效应

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

转录因子（TF）与RNA聚合酶的相互作用通常通过下拉实验进行研究。我们采用生物层干涉技术（BLI）来表征GrgA与衣原体RNA聚合酶之间的相互作用。与下拉实验相比，BLI能够检测实时的结合与解离过程，具有更高的灵敏度，并且定量能力更强。...

应用生物层干涉技术（BLI）研究转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。...

使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

本文介绍了一种利用基于链霉亲和素的生物层干涉技术（BLI）系统研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。文中概述了使用基本或高级结合动力学方法测定相互作用的平衡结合亲和力（KD）所需的关键步骤和注意事项。...

利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

HCN通道与其辅助亚基之间的相互作用已被确定为重度抑郁症的治疗靶点。本文介绍了一种基于荧光偏振的方法，用于筛选该蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂。...

识别HCN1与TRIP8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法

蛋白质-蛋白质相互作用可发生在细胞的细胞核和细胞质中。为了研究这些相互作用，通常采用传统的共免疫沉淀法和现代的邻近连接技术。在本研究中，我们比较了这两种方法，以可视化NF90-RBM3相互作用在细胞核和细胞质中的分布情况。...

通过免疫共沉淀法在核组分和胞质组分中可视化蛋白质-蛋白质相互作用 原位 邻近连接实验

我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子力学性质及其机械解折叠路径的详细步骤与策略。同时，我们展示了代表性结果，以作为筛选和判断高质量单个蛋白质分子记录的参考依据。...

使用原子力显微镜对单个蛋白质分子进行力谱分析

机械敏感性离子通道通常通过膜片钳记录技术，以流体流动/剪切力敏感性进行研究。然而，根据实验方案的不同，流体流动对离子通道调控的研究结果可能会出现误差。本文提供了预防和纠正此类误差的方法，并给出了相应的理论依据。...

使用开放式膜片钳移液管测量非搅动边界层中的离子浓度：流体流动对离子通道调控的意义

学习使用生物层干涉法测定hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质配体PIP2的相互作用动力学。该方法具有高通量、样品用量少的优势，可为离子通道药物筛选提供可靠工具。

通过生物层干涉技术检测离子通道蛋白与小分子相互作用动力学

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