4.11: 密度梯度超速离心法

密度梯度超速离心是分离和纯化生化实验中细胞结构的常用方法。该技术使用高速或超高速离心机在密度梯度中无损分离细胞成分。本视频介绍了密度梯度超速离心的原理，提供了使用蔗糖梯度的一般程序，并讨论了一些应用。

我们首先研究一下超速离心机和密度梯度的原理。悬浮液在液体溶剂中含有颗粒。由于重力作用，密度大于溶剂的颗粒沉淀出来，而密度小于溶剂的颗粒会漂浮。颗粒和溶剂之间的密度差越大，分离速度越快。

超速离心机包含一个称为转子的单元，它以高度受控的速度旋转，模拟强大的引力场。在该场内，颗粒和溶剂之间的密度差异被放大。

磁场的强度取决于旋转速度。即使是转速相对较低的小转子也能产生比地球引力场强数千倍的力。

如果一根试管包含几种不同密度的液体，离心将按密度顺序将它们分成不同的层，最稠密的液体最靠近碱。这种多种液体的分层称为"密度梯度"。有两种类型。在阶梯梯度中，密度递减的液体小心翼翼地层叠在一起。在连续梯度中，液体以不同的比例混合，因此密度从碱向上平滑降低。

细胞器可以通过"等密度梯度离心"使用阶梯梯度进行分离。这是最简单和最常见的离心程序。

该程序用于分离细胞结构。细胞器越密集，下降得越远——线粒体在顶部，核酸在底部。

现在，您已经了解了该技术背后的原理，让我们在实验室中了解一下。

在程序开始之前，应注意制造商的速度和密度额定值，并检查超速离心机是否腐蚀。该程序使用水平转子。

首先，通过匀浆细胞制备细胞材料，从而无损地释放其细胞器。匀浆可以通过初步的低速离心进行分离，以去除低密度组分。接下来，制备蔗糖溶液。

糖的添加量增加，因此每种溶液都比前一种溶液更浓缩，因此密度更高。溶液的确切密度将取决于要分离的成分，这些成分因生物体而异。待分离组分的溶液之间的密度应较大，最后一种溶液的密度大于分析物中密度最高的组分。应用中描述了分离比蔗糖密度更大的组分（如核酸）的技术。

现在在干净的离心管中创建蔗糖梯度。使用移液管吸取最浓的蔗糖溶液。将试管直立，将移液器吸头高贴在壁上，并稳定地向下分配液体。保持工作区域没有振动和其他干扰非常重要。

更换吸头后，按密度递减的顺序添加剩余的溶液。它们被小心分配以形成不同的层并避免混合。最后，在梯度顶部加入约半毫升细胞样品，并称量试管。这用于平衡重量分配，这是该过程的下一步。

离心应尽快开始。将试管放入转子中，然后通过将等重的空白溶液放入相对的槽中来平衡转子。将转子置于超速离心机中，并密封系统。设置温度、转速和时间。典型值为 4 ？C 以超过 100,000 x g 的力持续 16 小时。

离心后，将试管从转子中取出，注意保持其直立且不受干扰。不同的细胞成分已分馏成溶液层之间的离散条带。馏分可以用注射器收集。或者，可以用经过消毒的细针刺穿管底，并将流出液收集在无菌管中。细胞成分现已分离。它们可以储存在 -80 °C 下。

现在我们已经了解了基本过程，让我们看看一些应用程序。

一个典型的应用是植物细胞中多蛋白复合物的分离。在这个例子中，负责循环电子流的复合物从类囊体中分离出来，类囊体是光合作用中光反应的位点。该程序使用 14% 至 45% 蔗糖的离散溶液。在 4 °C 下以超过 100,000 x g 的速度离心 14 小时。

由于核酸的密度比蔗糖大，因此等密度离心无法无损地将它们与细胞器分离。

使用了一种不同的技术，称为"速率带离心"。它根据细胞器的沉降速率分离细胞器，沉降速率不仅取决于它们的密度，还取决于它们的构象。连续渐变用于根据此属性分隔分量。

程序步骤类似于 isopycnic 案例的步骤。在本例中，使用 5% 至 20% 的连续梯度分离 RNA-核糖体复合物，并以 230,000 x g 离心。离心在几个小时后中断，以防止共沉淀。

链可以根据密度彼此分离。

这是因为富含鸟嘌呤和胞嘧啶的链比富含腺嘌呤和硫胺素的链更致密。在这种情况下，梯度不能由蔗糖组成，因为蔗糖的密度低于核酸。相反，使用氯化铯梯度，通常为 1.65 至 1.75 g/mL，因为它们具有足够的密度和低粘度。

在这里，我们看到浮游生物 DNA 使用连续氯化铯梯度进行纯化。在真空下以超过 1,000,000 x g 的离心速度离心 18 小时。

您刚刚观看了 JoVE 关于使用蔗糖密度梯度进行超速离心的视频。现在，您应该了解密度梯度的工作原理、如何构建阶跃梯度以及如何加载和作超速离心机。感谢观看！