4.7: 二维凝胶电泳

二维或 2D 凝胶电泳是一种利用两种不同分离方法的技术，可以从单一混合物中分离数千种蛋白质。其中一种技术 SDS-PAGE 或十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳不能单独完全分离复杂的混合物。2D 凝胶电泳将 SDS-PAGE 与第二种方法（等电聚焦或 IEF）偶联，该方法根据等电点进行分离，从而可以分离细胞裂解物中的所有蛋白质。本视频将介绍 2D 凝胶电泳的原理、一般程序及其一些生物医学应用。

2D 凝胶电泳以 IEF 为第一维。每种蛋白质都有一个 pH 值，称为等电点或 pI，其中净电荷为零。当蛋白质受到电场作用时，它会向带相反电荷的电极移动。将目标样品上样到固定化 pH 梯度 （IPG） 试纸条上，这些试纸条嵌入了两性电解质，即包含酸性和碱性基团的分子。然后将电场施加到 pH 梯度条上，使蛋白质迁移，直到达到与其 pI 匹配的 pH 值，从而失去净电荷。

在运行第二维之前，用 SDS 处理包埋的蛋白质，使其变性并提供均匀的负电荷。完成后，将 IPG 条带置于聚丙烯酰胺凝胶上。施加的电场将蛋白质拉向阳极，较大的蛋白质在凝胶中的移动速度较慢。

根据 pI 和分子量分离蛋白质混合物后，使用染色剂可视化蛋白质组图谱，并鉴定感兴趣的蛋白质。

现在我们已经讨论了 2D 凝胶电泳的原理，让我们回顾一下典型的实验室程序。

在进行实验之前，必须将蛋白质溶解到培养基中。样品的溶解是通过将蛋白质与用于破坏氢键相互作用的离液剂、防止蛋白质电荷改变的非离子去污剂、用于破坏二硫键的还原剂和缓冲液的组合进行解聚来实现的。为了去除干扰性丰度蛋白质和其他分子，通过离心依次提取材料，并收集所得沉淀;然后用核酸内切酶处理，核酸内切酶是一种用于消耗任何会干扰实验的 DNA 的酶。

蛋白质溶解后，用胶条清洁溶液冲洗制备 IPG 胶条，并倒置晾干。然后为每个试纸条分配一个试纸条支架编号。准备好后，细胞提取物以从负极到正极缓慢滑动的运动加载到条带上。为了再水化，将湿印迹纸放在电极顶部和凝胶条下方;然后将 IPG 试纸条衬砌到 IEF 仪器上。施加高电流，蛋白质开始迁移。

完成第一维后，在灌注装置中制备 SDS-PAGE 凝胶。通过将 IPG 条正面朝下置于含 SDS 的平衡缓冲液中来处理 IPG 条带。电泳单元加入电泳缓冲液即可制备。使用镊子收集处理过的 IPG 条带，放置在凝胶板顶部，并用琼脂糖密封溶液密封。然后，电压源施加电场，该电场一直保持到移动最快的蛋白质距离凝胶底部 1 cm。

电泳完成后，必须对蛋白质进行可视化。传统上，这是通过用考马斯蓝或硝酸银染色来实现的。目标蛋白质可以从凝胶中转印，并通过 Western blot 分析进行分析。

第二种鉴定方法包括从凝胶中切除蛋白质，消化它们，而不是通过质谱分析它们。

现在我们已经回顾了程序，让我们看看 2D 凝胶电泳的一些用途。

该技术最常见的用途之一是识别参与疾病发生和进展的分子。与健康区域相比，2D 凝胶电泳与质谱相结合，可以检测病变区域特定蛋白质的上调或下调。

此外，2D 凝胶电泳有助于跟踪患者对潜在治疗药物的反应进展。可以在治疗后的不同时间点从患者身上采集标本。这样，2D 凝胶电泳结合 Western blot 或质谱分析，可以检测与炎症等阴性反应相关的蛋白质;或没有处于缓解状态的蛋白质。

2D 凝胶电泳的另一个用途是研究翻译后修饰 （PTM） 后的蛋白质结构和功能，PTM 是从 mRNA 翻译后添加到蛋白质中的蛋白质。PTM 可以调节多种功能，包括蛋白质信号传导、基因表达或引起氧化损伤。2D 凝胶电泳对甲基化或乙酰化等修饰敏感，这些修饰会导致 pI 和分子量发生变化。

您刚刚观看了 JoVE 关于 2D 凝胶电泳的视频。该视频介绍了该技术的原理、典型的实验程序及其在生物医学领域的几种应用。

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