Name: otx1 和 otx2 作为鼻窦癌和嗅觉神经母细胞瘤的两种可能的分子标记物的鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解如何利用免疫组织化学和实时PCR技术鉴定鼻窦癌和嗅觉神经母细胞瘤的分子标记物otx1和otx2。该方法可在一天内获得结果，有助于提高肿瘤亚型诊断的准确性。

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本工作由因苏布里亚大学大型仪器中心、瓦雷多社区基金会、伦巴第山地基金会以及安娜·维拉和费利切·鲁斯科尼基金会资助。

所有研究均按照《赫尔辛基宣言》（1975年）进行，并获得瓦雷泽因苏布里亚大学伦理委员会的批准，且已取得书面知情同意。
1. 样品采集
<ol>
	<li>根据《头颈部肿瘤 WHO 分类》将所有人类福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本收集并划分为不同的亚组14。 
	注意：本研究使用的样本包括：作为对照的正常鼻窦黏膜（10 例）；内翻性乳头状瘤（IP，ICD-O 编码 8121/1）；鼻窦 ITAC（ICD-O 编码 8144/3，32 例）；NITAC（ICD-O 编码 8140/3，12 例）；腺样囊性癌（ACC，ICD-O 编码 8200/3）；多形性腺瘤（PA，ICD-O 编码 8941/3）；ON（ICD-O 编码 9522/3，13 例）；低分化神经内分泌癌（PDNEC，ICD-O 编码 8041/3，19 例）；神经内分泌肿瘤（NET，ICD-O 编码 8041/3）。</li>
</ol>
2. 免疫化学
<ol>
	<li>脱蜡和切片复水
	<ol>
		<li>将样本载玻片置于60 °C烘箱中加热30分钟，并使用梯度乙醇将3 µm厚的FFPE切片复水至水。</li>
		<li>将载玻片在二甲苯中短暂清洗10分钟，并重复此步骤一次；随后依次在100%乙醇中清洗5分钟（重复一次），再分别用95%、85%和75%乙醇依次清洗。最后用蒸馏水冲洗载玻片5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阻断内源性活性
	<ol>
		<li>将载玻片置于3%的水溶性过氧化氢溶液中12分钟，以阻断内源性活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原修复
	<ol>
		<li>采用微波处理法，在10 mM柠檬酸缓冲液（pH 6）中处理10分钟进行抗原修复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与一抗孵育
	<ol>
		<li>用TBS缓冲液（pH 7.4）洗涤切片，然后加入封闭液孵育10分钟。</li>
		<li>再次用TBS缓冲液（pH 7.4）洗涤切片，然后加入0.2% Triton X。</li>
		<li>在4 °C条件下与山羊抗人OTX2抗体（1:100稀释）孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与二抗孵育
	<ol>
		<li>室温下与生物素标记的兔抗山羊二抗（1:200稀释）孵育1小时，随后加入ABC-过氧化物酶复合物（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显色免疫反应
	<ol>
		<li>使用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐显色，并用哈里斯苏木精对细胞核进行复染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封片与成像
	<ol>
		<li>使用递增浓度的乙醇梯度脱水，并用萜类来源的透明剂透明（参见材料表）。将切片封固于封片介质中，置于显微镜载玻片上，通过光学显微镜观察切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RNA 提取与逆转录
<ol>
	<li>RNA 提取
	<ol>
		<li>通过执行免疫沉淀实验方案的第一步（参见第 2.1 节）从切片中提取 RNA，并将玻片保存在蒸馏水中。将未染色切片与相应的苏木精-伊红染色切片进行比对，以识别感兴趣的组织片段。</li>
		<li>使用专用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的商业化 RNA 提取试剂盒（见材料表），并按照制造商说明书进行 RNA 提取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 逆转录
	<ol>
		<li>使用商业化试剂盒按照操作说明将 RNA 逆转录为 cDNA（见材料表）。为进行多项分析，至少对 1,000 ng 总 RNA 进行逆转录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 实时 PCR 与数据分析
<ol>
	<li>实时荧光定量 PCR
	<ol>
		<li>使用基于探针的技术（参见材料表）和热循环仪进行定量实时荧光定量 PCR 分析（qRT-PCR）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR 反应体系的配制
	<ol>
		<li>在总反应体积为 25 µL 的体系中，加入 12.5 µL 基于探针的预混液、OTX1、OTX2 和 ACTB 探针各 1.25 µL（参见材料表）、50 ng cDNA，并用无核酸酶水补足体积。</li>
		<li>以 ACTB 基因为内参对照，对所有反应设置三个重复，用于基因表达水平的标准化。</li>
		<li>将反应板在 1,109 × g 离心 3 分钟，并在避光条件下于 4 °C 保存，直至进行实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>热循环仪程序设置
	<ol>
		<li>设置热循环仪程序：首先在 50 °C 进行 2 分钟的初始热启动，接着在 95 °C 保持 10 分钟；随后进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 秒，最后在 60 °C 延伸 1 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因表达水平分析
	<ol>
		<li>采用相对循环阈值（ΔCt）法对基因表达水平进行标准化处理，以 ACTB 基因为内参对照。</li>
		<li>使用 2-ΔCt 法计算基因表达水平，并绘制结果图表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计学分析
	<ol>
		<li>采用 Student's t-检验进行统计学分析，当 p &#60; 0.05 时认为差异具有统计学意义。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+genes+in+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+genet%22%5BJournal%5D)">Homeobox genes in the developing central nervous system.</a> Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).</li>
<li>Omodei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Brain+Transcription+Factor+OTX1+Occurs+in+a+Subset+of+Normal+Germinal-Center+B+Cells+and+in+Aggressive+Non-Hodgkin+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22American+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma.</a> American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).</li>
<li>Levantini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsuspected+role+of+the+brain+morphogenetic+gene+Otx1+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).</li>
<li>Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+homeobox+OTX2+and+OTX1+in+the+early+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).</li>
<li>Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+homeobox+gene+expression+in+cancer%3A+cause+or+consequence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence?</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).</li>
<li>de Haas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTX1+and+OTX2+expression+correlates+with+the+clinicopathologic+classification+of+medulloblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).</li>
<li>Terrinoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTX1+expression+in+breast+cancer+is+regulated+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53.</a> Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).</li>
<li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTX1+promotes+colorectal+cancer+progression+through+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).</li>
<li>Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+CRX+and+OTX2+expression+in+human+retina+and+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma.</a> J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).</li>
<li>Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+the+cell+cycle+in+mammary+gland+development+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+mammary+gland+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis.</a> J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).</li>
<li>Cordes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+phenotypic+analysis+of+poorly+differentiated+sinonasal+neoplasms%3A+an+integrated+approach+for+early+diagnosis+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification.</a> Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).</li>
<li>Stelow, E. B., Bishop, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+from+the+4th+Edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Head+and+Neck+Tumours%3A+Tumors+of+the+Nasal+Cavity%2C+Paranasal+Sinuses+and+Skull+Base%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Pathol%22%5BJournal%5D)">Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base.</a> Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).</li>
<li>Llorente, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinonasal+carcinoma%3A+clinical%2C+pathological%2C+genetic+and+therapeutic+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).</li>
<li>Sidransky, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Lester_Thompson/publication/7200778_World_Health_Organization_classification_of_tumours_Pathology_and_genetics_of_head_and_neck_tumours/links/09e415102df86bd4a2000000.pdf">World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors</a>. 9, WHO Press. (2005).</li>
<li>Radulesku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+surgery+for+sinonasal+tumors%3A+The+transcribriform+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Stomatol+Oral+Maxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach.</a> J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).</li>
<li>Muller, P. A. J., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/ncb2641">p53 mutations in cancer.</a> Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Holmila, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+TP53+gene+mutations+in+sinonasal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer.</a> Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究首次表明，基于mRNA水平，HB基因OTX1和OTX2在正常的鼻窦黏膜及黏膜下腺体、炎性息肉、鼻窦施耐德乳头状瘤以及不同类型的上皮性和神经外胚层肿瘤中均有表达，包括鳞状细胞癌、非肠型鼻窦腺癌、涎腺型肿瘤、神经内分泌肿瘤和嗅神经母细胞瘤。
修改与故障排除：
为避免RNA降解，我们在病理科进行了脱蜡操作。刮取切片后，所有样本迅速冷却并保存于干冰中，直至后续使用。所有后续分析均在层流安全罩内进行，使用一套专用的带有无菌吸头的移液器，以维持无菌实验条件并防止RNA污染。
该技术的局限性：
该技术的主要局限性在于样本的可获得性，因为鼻窦腔肿瘤通常较为罕见。提取的RNA量是另一个重要问题，因为从FFPE样本中提取RNA会得到片段化的RNA，难以进行分析。
相对于现有方法的意义：
鼻腔肿瘤的诊断通常包括X射线分析、鼻腔内窥镜检查、C...

OTX HB基因是果蝇orthodenticle基因（otd）在脊椎动物中的同源基因，编码转录因子，通常在胚胎形态发生过程中表达，但也可能在成体生物中表达并发挥不同功能。在胚胎发育过程中，它们调控细胞身份的确定、细胞分化以及体轴的定位¹。 OTX 家族包括 OTX1 和 OTX2 功能不同的基因 OTX1 参与大脑和感觉器官的发育。在成体生物中，该基因在感觉器官中表达，并在垂体前叶中以较低水平转录。2；它还在造血过程中发挥作用，在造血多能细胞和前体细胞中均有表达3. OTX2 参与头部前端的发育，其编码的蛋白质作为形态发生素，通过形成浓度梯度以时空特异性的方式激活或抑制其他基因的表达，从而调控细胞增殖与分化。在成体生物中， OTX2 仅存在于脉络丛和松果体中4.
突变 OTX 基因常与人类先天性、体细胞或代谢缺陷的表现相关。基因的获得或缺失突变可导致 OTX 如果基因无法正常调控细胞生长和/或分化，则可能促进肿瘤发生5. 在白血病和淋巴瘤以及许多实体瘤中（例如， 髓母细胞瘤6侵袭性非霍奇金淋巴瘤2，乳腺癌7结直肠癌8，以及视网膜母细胞瘤9），其表达失调的 OTX HB基因的作用已有充分文献记载10此外， OTX2 无眼症和小眼球症病例中已发现突变11 由于该基因在调控眼睛发育中起关键作用。
在实体肿瘤的背景下，发现分子和表型标志物是多种肿瘤诊断、分类和治疗的重要挑战11包括起源于鼻腔和鼻旁窦的肿瘤。事实上，尽管这些区域所占解剖空间有限，但其黏膜上皮、腺体、软组织、骨、软骨以及神经/神经外胚层和造血淋巴细胞常可成为组织学上复杂且多样的肿瘤类型的起源部位。涉及鼻-鼻窦区域的不同类型肿瘤表现出多种特征，其复杂性甚至超过上呼吸道消化道或其他多数身体部位常见的肿瘤表现。12鼻窦恶性肿瘤极为罕见，全球年发病率约为每10万居民中1例，因此限制了对肿瘤发生相关通路的研究以及替代治疗策略的测试。尽管如此，影像学技术、外科手术方法和放射治疗的进步已显著改善了鼻窦癌的临床管理。此外，细胞系、动物模型以及癌症遗传谱分析的发展目前构成了未来靶向抗癌治疗的基础。13迄今为止，尚无关于 OTX1 和/或 OTX2 鼻腔、鼻旁窦和鼻咽部肿瘤中的表达。由于我们先前已观察到 OTX1 和 OTX2 参与乳腺癌的发生发展7，我们想知道这些基因是否不仅存在于正常的鼻黏膜中，还可能存在于鼻腔肿瘤中。为实现这一目标，我们从病理科获得了 &#34;奥尔塞洛医院&#34; 在1985年至2012年间收集的Varese地区正常黏膜以及鼻腔和鼻窦腺癌样本，均根据世界卫生组织（WHO）头颈部肿瘤分类标准进行分类。我们选择通过实时PCR和免疫组织化学分析对这些样本进行检测，并对其进行了评估 OTX1 和 OTX2 表达情况以确定它们是否可作为此类肿瘤的分子标志物。

<table><tbody><tr><td>全核酸提取试剂盒（RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation）</td><td>Applied Biosystem</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit）</td><td>Applied Biosystem</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan通用PCR预混液，不含AmpErase UNG（TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG）</td><td>Applied Biosystem</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7000&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem</td><td>270001857</td><td></td></tr><tr><td>ACTB探针（ACTB probe）</td><td>Applied Biosystem</td><td></td><td>已停产。序列受版权保护</td></tr><tr><td>OTX1探针（OTX1 probe）</td><td>Applied Biosystem</td><td></td><td>已停产。序列受版权保护</td></tr><tr><td>OTX2探针（OTX2 probe）</td><td>Applied Biosystem</td><td></td><td>已停产。序列受版权保护</td></tr><tr><td>水溶液过氧化氢（Acqueous Hydrogen Peroxide）</td><td>Merk</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液（Citrate Buffer）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20276292</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通（Triton）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101473728</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk</td><td>108382</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗OTX2抗体（Goat Anti-OTX2 Antibody）</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>已停产。目录号不可用</td></tr><tr><td>兔抗山羊抗体（Rabbit Anti-Goat Antibody）</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA5000</td><td></td></tr><tr><td>ABC-过氧化物酶复合物（ABC-Peroxidase Complex）</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精（Harris Hematoxylin）</td><td>Bioptica</td><td>0506004/L</td><td></td></tr><tr><td>Pertek</td><td>Kaltek SRL</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>BioClear</td><td>Bioptica</td><td>W01030799</td><td></td></tr></tbody></table>

otx1 和 otx2 作为鼻腔鼻窦癌及嗅神经母细胞瘤两种潜在分子标志物的鉴定

Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas

OTX 同源盒（HB）基因在胚胎形态发生过程中以及成年生物体嗅觉上皮的发育过程中均有表达。这些基因发生的突变常与人类肿瘤的发生相关。目前尚无关于OTX基因与鼻腔肿瘤之间可能关联的研究数据。本研究的目的是探讨OTX1和OTX2是否可作为鼻腔肿瘤发展过程中的分子标志物。我们选取了鼻腔及鼻窦腺癌，通过免疫组织化学和实时PCR分析来研究OTX1和OTX2基因的表达情况。在所有鼻窦肠道型腺癌（ITACs）样本中，OTX1和OTX2均未表达。OTX1 mRNA仅在非肠道型腺癌（NITACs）中被检测到，而OTX2 mRNA仅在嗅觉神经母细胞瘤（ONs）中表达。我们证实，OTX1和OTX2基因的差异性表达可作为区分不同类型鼻窦肿瘤的有用分子标志物。

在正常黏膜中，我们观察到OTX基因在纤毛假复层呼吸型上皮细胞以及黏膜下腺体细胞中均呈现强而均匀的核阳性反应图1A）。我们在所有 NITAC 样本中均发现 OTX1 呈现核表达（图1B），而ITACs中免疫反应性较弱或几乎未见图1C）。所有视神经中均显示出强烈的免疫反应性（图1D）；在PDNECs中，OTX的表达在阳性细胞比例和表达强度上存在差异（图1E）。采用卡方检验和/或Fisher精确检验进行免疫组织化学统计分析，结果显示ITAC样本中OTX基因的缺失具有统计学显著性（n = 23， p &lt; 0.01).
实时荧光定量 PCR 分...

同源框基因是一类调控基因，常与成年个体中的肿瘤相关。我们通过免疫组织化学和实时PCR分析，研究了其在正常鼻黏膜、炎性鼻黏膜以及鼻窦肿瘤中的相对表达情况，旨在将其作为潜在的诊断和治疗靶点。

OTX1 和 OTX2 作为鼻腔鼻窦癌及嗅神经母细胞瘤两种潜在分子标志物的鉴定

OTX 同源框（HB）基因在胚胎形态发生期间以及成年生物体嗅觉上皮发育过程中均有表达。突变……

本实验的总体目标是通过简单高效的方法，识别鼻窦癌和嗅神经母细胞瘤中有用的分子标志物。该方法有助于回答嗅神经母细胞瘤和鼻窦癌领域中的关键问题，例如识别用于区分肿瘤亚型的分子标志物。该技术的主要优势在于，我们可在不到六小时内获得结果，医院报告也可在一天内完成。由我实验室的博士生Giorgia Millefanti博士演示RNA提取和实时PCR操作步骤。我实验室的另一位博士生Giovanni Micheloni将演示免疫组织化学操作步骤。开始实验前，根据世界卫生组织（WHO）头颈部肿瘤分类标准，收集所有人源FFPE样本并将其分为不同的亚组。将样本载玻片置于60摄氏度的烘箱中加热30分钟。接着，将三微米厚的FFPE切片在二甲苯中短暂清洗10分钟，以进行复水。然后，依次用100%、95%、85%和75%的酒精分别洗涤载玻片，每次洗涤5分钟。将载玻片在蒸馏水中冲洗五分钟。随后，将载玻片置于3%的水性过氧化氢溶液中12分钟，以阻断内源性活性。之后，使用10毫摩尔柠檬酸缓冲液处理载玻片，并微波加热10分钟，进行抗原修复。10分钟后，用TBS缓冲液洗涤切片。然后加入0.2% Triton X，在4°C下与山羊抗人OTX2抗体（按1:100比例稀释）共同孵育过夜。次日，加入生物素标记的兔抗山羊二抗（按1:200比例稀释），室温孵育切片1小时。然后，用ABC过氧化物酶复合物处理样本。随后，使用四盐酸二氨基苯显色以显发免疫反应，并用哈里斯苏木精对细胞核进行复染。接着，将切片置于梯度酒精中脱水，并用松油来源的透明剂进行透明处理。接下来，使用封片剂将切片固定在载玻片上。在RNA提取和反转录完成后，采用基于探针的技术和热循环仪进行定量实时PCR分析。配制PCR反应体系：取12.5 µL基于探针的预混液，每种OTX1、OTX2和ACTB探针各1.25 µL，50 ng cDNA，以及无核酸酶水，加至总体积为25 µL。使用 ACTB 基因作为内参对照，对所有反应进行三份重复实验，以标准化基因表达水平。随后，将反应板在 1109 ×g 条件下离心 3 分钟。然后将反应板避光保存于 4 °C，直至进行实验。进行实时 PCR 时，将样品放入仪器中。然后设置热循环仪程序：首先在 50 摄氏度下进行 2 分钟的初始热启动循环，接着在 95 摄氏度下保持 10 分钟，随后进行 40 个循环（每个循环包括 95 摄氏度下 15 秒和 60 摄氏度下 1 分钟的终末循环）。对于基因表达水平分析，采用比较循环阈值法（ΔΔCt 法），以 ACTB 基因为内参对照对基因表达水平进行归一化处理。采用比较循环阈值法评估基因表达水平，并绘制结果图表。随后使用学生t检验进行统计分析，以p<0.05作为具有统计学显著性的标准。在正常黏膜中，OTX基因在纤毛假复层呼吸型上皮细胞和黏膜下腺体细胞中均表现出强而均匀的核阳性反应。在所有非肠型腺癌样本中均检测到OTX1的核表达，而肠型腺癌中则显示微弱或无免疫反应性。所有嗅神经母细胞瘤均呈现强免疫反应性。在所有低分化神经内分泌癌中，OTX的表达在阳性细胞的比例和染色强度上存在差异。在进行该操作步骤时，重要的是要牢记使用无菌设备并在无菌条件下完成RNA提取的每一步。在实施该操作的同时，还可并行开展其他方法，如X射线分析、鼻腔内镜检查、CT扫描、磁共振成像以及活检，以验证本技术所获得的结果。该技术建立后，为肿瘤学领域的研究人员利用细胞模型深入探索该疾病奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用免疫组织化学和实时 PCR 技术识别分子标志物，以区分肿瘤亚型。请务必注意，操作这些试剂、仪器和样本可能具有极高危险性，在进行此类实验时，必须始终采取适当的防护措施，例如使用防护设备（DPI）。

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otx1 和 otx2 作为鼻窦癌和嗅觉神经母细胞瘤的两种可能的分子标记物的鉴定

本文介绍了一种从大鼠和人类鼻腔中获取嗅黏膜活检样本的方法。这些活检样本可用于识别脑部疾病的分子异常，或分离具有多向分化潜能的成体干细胞，后者可在脑损伤/脑疾病动物模型中用于细胞移植研究。...

从啮齿类动物或人类中分离鼻腔嗅觉干细胞

本研究开发并验证了一种用于研究双相情感障碍（BD）治疗反应神经元内分子特征的新平台。通过鼻腔活检获取双相情感障碍（BD）患者的嗅觉上皮组织，随后结合激光捕获显微切割与实时逆转录聚合酶链反应（Real Time RT...

通过鼻部活检联合激光显微切割获取的嗅觉神经元：研究精神疾病治疗反应的一种潜在方法

嗅觉感觉神经元表达多种轴突分选分子，以建立正确的神经环路。本方案描述了一种免疫组织化学染色方法，用于可视化嗅觉感觉神经元轴突末端处轴突分选分子的组合表达。...

用于可视化嗅觉感觉轴突分子身份编码的嗅球四重免疫染色

本文介绍了一种详细且高效的RNA原位杂交实验方案，特别适用于检测昆虫触角中低水平表达的气味受体（OR）基因及其他基因，所用探针为地高辛（DIG）标记或生物素标记的探针。...

通过RNA 原位杂交技术定位蝗虫触角中的嗅觉受体基因

生物信息学是一种处理大规模数据集的有效方法。通过应用生物信息学手段，研究人员能够快速、可靠且高效地获得具有洞察力的应用成果和科学发现。本文展示了生物信息学在卵巢癌研究中的应用，并通过实验成功验证了生物信息学分析的结果。...

整合生物信息学方法与实验验证以解析Notch信号通路在卵巢癌中的作用

在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学...

多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

我们建立了一种方法，可成功地将原本以整体封片方式固定的乳腺组织进行取材、处理、切片和染色，用于组织病理学评估。该方法可能促进在生殖和发育毒性试验指南研究中对乳腺腺体整体封片的采集与评估。...

切片乳腺组织整体标本以识别病灶

基因工程小鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。本文介绍了一种从小鼠泌尿生殖系统中识别并分离前列腺叶的方案，基于组织学特征对其进行区分，并分离和培养原代前列腺细胞 体外...

小鼠前列腺叶的鉴定、组织学表征及用于体外三维球体培养模型的分离

本方案描述了利用斑马鱼幼体作为宿主的病毒介导双荧光标记肿瘤异种移植模型的优化步骤。该异质性异种移植模型可模拟胰腺癌微环境的组织构成，在个性化的斑马鱼患者来源异种移植（zPDX）模型中为评估药物反应提供了更为精确的工具。...

利用斑马鱼幼虫作为宿主的胰腺癌患者来源异质性异种移植模型用于药物比较评估

本文介绍了一种整合性工作流程，用于鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）的表型和分子特征。我们将活细胞免疫染色与单个及成簇CTCs的机器人显微操作相结合，并利用基于单细胞的技术进行后续分析，评估其定植转移的能力。...

循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

了解如何利用免疫组织化学和实时PCR技术鉴定鼻窦癌和嗅觉神经母细胞瘤的分子标记物otx1和otx2。该方法可在一天内获得结果，有助于提高肿瘤亚型诊断的准确性。

OTX1 和 OTX2 作为鼻腔鼻窦癌及嗅神经母细胞瘤两种潜在分子标志物的鉴定

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