OTX1 和 OTX2 作为鼻腔鼻窦癌及嗅神经母细胞瘤两种潜在分子标志物的鉴定

本实验的总体目标是通过简单高效的方法，识别鼻窦癌和嗅神经母细胞瘤中有用的分子标志物。该方法有助于回答嗅神经母细胞瘤和鼻窦癌领域中的关键问题，例如识别用于区分肿瘤亚型的分子标志物。该技术的主要优势在于，我们可在不到六小时内获得结果，医院报告也可在一天内完成。

由我实验室的博士生Giorgia Millefanti博士演示RNA提取和实时PCR操作步骤。我实验室的另一位博士生Giovanni Micheloni将演示免疫组织化学操作步骤。开始实验前，根据世界卫生组织（WHO）头颈部肿瘤分类标准，收集所有人源FFPE样本并将其分为不同的亚组。

将样本载玻片置于60摄氏度的烘箱中加热30分钟。接着，将三微米厚的FFPE切片在二甲苯中短暂清洗10分钟，以进行复水。然后，依次用100%、95%、85%和75%的酒精分别洗涤载玻片，每次洗涤5分钟。

将载玻片在蒸馏水中冲洗五分钟。随后，将载玻片置于3%的水性过氧化氢溶液中12分钟，以阻断内源性活性。之后，使用10毫摩尔柠檬酸缓冲液处理载玻片，并微波加热10分钟，进行抗原修复。

10分钟后，用TBS缓冲液洗涤切片。然后加入0.2% Triton X，在4°C下与山羊抗人OTX2抗体（按1:100比例稀释）共同孵育过夜。次日，加入生物素标记的兔抗山羊二抗（按1:200比例稀释），室温孵育切片1小时。

然后，用ABC过氧化物酶复合物处理样本。随后，使用四盐酸二氨基苯显色以显发免疫反应，并用哈里斯苏木精对细胞核进行复染。接着，将切片置于梯度酒精中脱水，并用松油来源的透明剂进行透明处理。

接下来，使用封片剂将切片固定在载玻片上。在RNA提取和反转录完成后，采用基于探针的技术和热循环仪进行定量实时PCR分析。配制PCR反应体系：取12.5 µL基于探针的预混液，每种OTX1、OTX2和ACTB探针各1.25 µL，50 ng cDNA，以及无核酸酶水，加至总体积为25 µL。

使用 ACTB 基因作为内参对照，对所有反应进行三份重复实验，以标准化基因表达水平。随后，将反应板在 1109 ×g 条件下离心 3 分钟。然后将反应板避光保存于 4 °C，直至进行实验。

进行实时 PCR 时，将样品放入仪器中。然后设置热循环仪程序：首先在 50 摄氏度下进行 2 分钟的初始热启动循环，接着在 95 摄氏度下保持 10 分钟，随后进行 40 个循环（每个循环包括 95 摄氏度下 15 秒和 60 摄氏度下 1 分钟的终末循环）。对于基因表达水平分析，采用比较循环阈值法（ΔΔCt 法），以 ACTB 基因为内参对照对基因表达水平进行归一化处理。

采用比较循环阈值法评估基因表达水平，并绘制结果图表。随后使用学生t检验进行统计分析，以p<0.05作为具有统计学显著性的标准。在正常黏膜中，OTX基因在纤毛假复层呼吸型上皮细胞和黏膜下腺体细胞中均表现出强而均匀的核阳性反应。

在所有非肠型腺癌样本中均检测到OTX1的核表达，而肠型腺癌中则显示微弱或无免疫反应性。所有嗅神经母细胞瘤均呈现强免疫反应性。在所有低分化神经内分泌癌中，OTX的表达在阳性细胞的比例和染色强度上存在差异。

在进行该操作步骤时，重要的是要牢记使用无菌设备并在无菌条件下完成RNA提取的每一步。在实施该操作的同时，还可并行开展其他方法，如X射线分析、鼻腔内镜检查、CT扫描、磁共振成像以及活检，以验证本技术所获得的结果。该技术建立后，为肿瘤学领域的研究人员利用细胞模型深入探索该疾病奠定了基础。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用免疫组织化学和实时 PCR 技术识别分子标志物，以区分肿瘤亚型。请务必注意，操作这些试剂、仪器和样本可能具有极高危险性，在进行此类实验时，必须始终采取适当的防护措施，例如使用防护设备（DPI）。