蛋白质结晶，获得一个坚实的格子的生物分子，阐明了蛋白质的结构，并使蛋白功能的研究。结晶涉及干燥组合的许多因素，包括 ph 值、 温度、 离子强度、 蛋白质浓度下的纯化的蛋白。一旦获得晶体，可以通过 x 射线衍射和电子密度模型计算阐明蛋白质结构。
本视频介绍了蛋白质结晶和显示的一般程序。的过程中，涵盖了蛋白的表达和纯化、 结晶和 x-射线衍射。蛋白质结晶的应用包括在硅片药物设计、 绑定现场测定和膜蛋白结构分析。
蛋白质结晶是获得格构式固体形式的一种蛋白质的过程。这些水晶是结构生物学家，协助蛋白功能的研究尤为重要。其他技术，如质谱法或 SDS-PAGE，只能提供信息的一维结构的蛋白质。蛋白质结晶被辅的重组蛋白的表达和 x 射线衍射技术。本视频将显示在生化领域的蛋白质结晶，一般实验室程序，和几个及其应用原则。
在过程中所需的第一步是蛋白的获得毫克量的很纯，通常使用重组蛋白的表达。对应于感兴趣的蛋白质的基因表达载体，克隆并表达的蛋白融合到亲和标记，例如聚-组氨酸，协助亲和层析纯化。要了解更多信息，见此集合的视频上亲和层析。
纯化蛋白形成晶体是依赖于许多因素，包括 ph 值、 离子强度、 沉淀剂浓度和蛋白质、 温度和速率平衡的适当结合。使用的最常见方法是蒸气扩散，其中有两种类别: 挂滴和坐在下降。液滴含纯蛋白、 缓冲区和沉淀剂、 离子固体，束缚水分子，减少蛋白质的水供应和模仿蛋白质浓度越高，处于封闭微孔与储层更高浓度的相同的缓冲区和沉淀剂混合物。在开始时，蛋白质和沉淀剂的浓度是太低，不足以引起结晶。在实验过程中，水从液滴蒸发和收集在储层中;水在滴减少会导致系统变得饱和，和成核，其次是结晶，可以发生。水从液滴的净转移处于平衡状态，和系统维护过程完成之前。
若要可视化的三维结构，使用了 x 射线衍射。要获得晶体的 x 射线数据，它被放在单色 x 射线，在那里它被暴露在各个角度梁。每次曝光提供的图像，在每个地方是衍射 x 射线，从晶体产生、 由探测器注册。数据相结合，制作一个模型在晶体内部原子的排列。由此产生的晶体结构演示原子，典型分辨率为 2 埃的 3 维位置。
既然我们已经涵盖了蛋白质结晶的原则，让我们看看一个广义的协议。
开始执行程序将包含感兴趣的基因表达载体转化为细胞。孵育细胞和阶段中期日志，表达式由添加诱导剂，如 IPTG，触发基因的 mRNA 转录启动。后蛋白表达，原油材料悬浮在裂解缓冲液中，然后用离心法澄清。
阐明了裂解液然后装到镍列和应运而生标记蛋白将绑定到列，而所有其他生物分子都冲走了。
一旦获得了几毫克的纯蛋白质，它是准备由蒸气扩散的结晶。24 井挂/坐滴托盘充满不同浓度的氯化钠和钠醋酸缓冲溶液。坐滴方法，相同体积的蛋白质和储层的解决方案吸取到每口井，上方的架子上，然后托盘布满了透明胶带。托盘然后放在孵化室，并在井监视增长第二天，然后每隔几天。
一旦它获得了适当的水晶是准备 x 射线衍射分析。水晶被安装在测角仪定位在所选的方向位置的晶体。水晶被照明用的 x 射线在所有的角度，产生衍射图案单色光束。该软件将转换的二维图像，在不同的方向，对三维模型的测定原子在晶体中的位置晶体中的电子密度。
我们已经讨论了一种程序，让我们回顾一些有用的应用程序的蛋白质结晶和另一种结晶技术。
可用于蛋白质结晶硅药物设计中。流感病毒聚合酶碱性蛋白 2，其中已链接到病毒感染在哺乳动物中，三维结构测定结晶和 x 射线衍射。潜在的蛋白结合位点的可视化，并使用对接程序，设计了一个三维分子，会插入在蛋白质中的裂缝。
合作的结晶的蛋白质-DNA 复合物也是一个有用的技术。DNA 结合蛋白调节种类繁多的生物功能，如转录和 DNA 聚合和 DNA 修复;和这些配合物的晶体结构可以洞察蛋白质的功能、 机制及特异性相互作用的性质。大肠杆菌蛋白 SeqA，负性调节因子的 DNA 复制，是与半甲基化 DNA 位共同结晶。
一体式膜蛋白质如 G 蛋白偶联受体或 GCPRs，很难结晶由于其数量有限的极性表面积供形成晶体的晶格接触，导致融合蛋白辅助蛋白质结晶的发展。编码 β 2 肾上腺素能受体、 GCPR 和溶菌酶基因被插入表达载体。Β2AR 溶菌酶融合蛋白质结晶过程被达到由于增加胞外亲水表面自然疏水 β2AR，提供的溶菌酶，成型包装的相互作用在晶体点阵的必要条件。
你刚看了朱庇特的视频对蛋白质结晶。这段视频描述其原则、 广义的议定书 》，和一些及其在生物医学领域的应用。谢谢观赏 ！
蛋白质结晶是获得蛋白质的晶格状固体形式的过程。这些晶体对结构生物学家特别有价值，有助于蛋白质功能的研究。其他技术，如质谱或 SDS-PAGE，只能提供有关蛋白质一维结构的信息。蛋白质结晶由重组蛋白表达和 X 射线衍射技术补充。本视频将展示蛋白质结晶的原理、一般的实验室程序及其在生化领域的几种应用。
该过程所需的第一步是获得毫克级的非常纯的蛋白质，通常使用重组蛋白表达。将与目标蛋白对应的基因克隆到表达载体中，并将表达的蛋白与亲和标签（如多聚组氨酸）融合，以协助通过亲和层析进行纯化。要了解更多信息，请观看此系列中有关亲和层析的视频。
纯化的蛋白质形成晶体取决于许多因素的适当组合，包括 pH 值、离子强度、沉淀剂和蛋白质的浓度、温度和平衡速率。最常用的方法是蒸汽扩散，其中有两大类：悬滴和坐滴。含有纯蛋白质、缓冲液和沉淀剂的液滴（一种结合水分子的离子固体，会降低蛋白质的水分可用性并模拟较高的蛋白质浓度）位于封闭的微孔中，该微孔中含有相同缓冲液和沉淀剂的更高浓度混合物的储液罐。开始时，蛋白质和沉淀剂的浓度太低，不会引起结晶。在实验过程中，水从液滴中蒸发并聚集在储液器中;液滴中水量的减少会导致系统变得过饱和，并且可能会发生成核，然后结晶。水滴的净传输处于平衡状态，并且系统一直保持到该过程完成。
为了可视化 3D 结构，使用了 X 射线衍射。为了从晶体中获得 X 射线数据，将其放置在单色 X 射线束中，在那里它以各个角度暴露在光束下。每次曝光都会提供一个图像，其中每个点都是衍射的 X 射线，它从晶体中出来并由探测器记录。这些数据被组合起来，生成晶体内原子排列的模型。所得晶体结构展示了原子的 3 维位置，典型分辨率为 2 埃。
现在我们已经介绍了蛋白质结晶的原理，让我们看看一个通用的方案。
首先，将包含目标基因的表达载体转化到细胞中。将细胞孵育，在对数中期，通过添加诱导剂（如 IPTG）来触发基因 mRNA 的转录，从而启动表达。蛋白表达后，将粗材料悬浮在裂解缓冲液中，然后通过离心澄清。
然后将澄清的裂解物上样到镍柱上，带多聚组氨酸标签的蛋白质与柱结合，同时洗去所有其他生物分子。
一旦获得几毫克的纯蛋白质，就可以通过蒸汽扩散进行结晶。24 孔悬挂/坐式滴盘中装满了不同浓度的氯化钠和乙酸钠缓冲溶液。对于坐滴法，将等体积的蛋白质和储液槽溶液移液到每个孔上方的架子上，然后用透明胶带覆盖托盘。然后将托盘放入培养室中，第二天监测孔的生长情况，然后每隔几天监测一次。
一旦获得合适的晶体，就可以进行 X 射线衍射分析了。晶体安装在测角仪上，以将晶体定位在选定的方向。晶体用单色 X 射线光束以各个角度照射，产生衍射图案。该软件通过确定晶体中原子的位置，将在不同方向拍摄的二维图像转换为晶体内电子密度的三维模型。
现在我们已经回顾了一个程序，让我们回顾一下蛋白质结晶的一些有用应用，以及另一种结晶技术。
蛋白质结晶可用于计算机药物设计。流感病毒聚合酶碱性蛋白 2 的三维结构与哺乳动物的病毒感染有关，通过结晶和 X 射线衍射确定。蛋白质中的潜在结合位点被可视化，并使用对接程序，设计了一个三维分子，该分子将插入蛋白质的裂隙中。
蛋白质-DNA 复合物的共结晶也是一种有用的技术。DNA 结合蛋白调节多种生物学功能，例如转录和 DNA 聚合以及 DNA 修复;这些复合物的晶体结构可以深入了解蛋白质功能、机制和特异性相互作用的性质。大肠杆菌蛋白 SeqA 是 DNA 复制的负调节因子，与半甲基化 DNA 共结晶。
整合膜蛋白（如 G 蛋白偶联受体或 GCPR）难以结晶，因为它们可用于形成晶格接触的极性表面积有限，这导致了融合蛋白辅助蛋白质结晶的发展。将编码 ？2 肾上腺素能受体、 GCPR 和溶菌酶的基因插入到表达载体中。？2AR-溶菌酶融合蛋白的结晶是由于溶菌酶提供的天然疏水性 ？2AR 上的细胞外亲水表面增加，这是在晶格中形成堆积相互作用所必需的。
您刚刚观看了 JoVE 关于蛋白质结晶的视频。该视频描述了其原理、通用协议及其在生物医学领域的一些用途。感谢观看！
Chapters in this video
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Overview
0:50
Principles of Protein Crystallization
3:16
Protocol for Protein Expression, Crystallization, and X-Ray Diffraction
5:15
Applications
7:20
Summary
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