4.5: 蛋白质结晶

蛋白质结晶是获得蛋白质的晶格状固体形式的过程。这些晶体对结构生物学家特别有价值，有助于蛋白质功能的研究。其他技术，如质谱或 SDS-PAGE，只能提供有关蛋白质一维结构的信息。蛋白质结晶由重组蛋白表达和 X 射线衍射技术补充。本视频将展示蛋白质结晶的原理、一般的实验室程序及其在生化领域的几种应用。

该过程所需的第一步是获得毫克级的非常纯的蛋白质，通常使用重组蛋白表达。将与目标蛋白对应的基因克隆到表达载体中，并将表达的蛋白与亲和标签（如多聚组氨酸）融合，以协助通过亲和层析进行纯化。要了解更多信息，请观看此系列中有关亲和层析的视频。

纯化的蛋白质形成晶体取决于许多因素的适当组合，包括 pH 值、离子强度、沉淀剂和蛋白质的浓度、温度和平衡速率。最常用的方法是蒸汽扩散，其中有两大类：悬滴和坐滴。含有纯蛋白质、缓冲液和沉淀剂的液滴（一种结合水分子的离子固体，会降低蛋白质的水分可用性并模拟较高的蛋白质浓度）位于封闭的微孔中，该微孔中含有相同缓冲液和沉淀剂的更高浓度混合物的储液罐。开始时，蛋白质和沉淀剂的浓度太低，不会引起结晶。在实验过程中，水从液滴中蒸发并聚集在储液器中;液滴中水量的减少会导致系统变得过饱和，并且可能会发生成核，然后结晶。水滴的净传输处于平衡状态，并且系统一直保持到该过程完成。

为了可视化 3D 结构，使用了 X 射线衍射。为了从晶体中获得 X 射线数据，将其放置在单色 X 射线束中，在那里它以各个角度暴露在光束下。每次曝光都会提供一个图像，其中每个点都是衍射的 X 射线，它从晶体中出来并由探测器记录。这些数据被组合起来，生成晶体内原子排列的模型。所得晶体结构展示了原子的 3 维位置，典型分辨率为 2 埃。

现在我们已经介绍了蛋白质结晶的原理，让我们看看一个通用的方案。

首先，将包含目标基因的表达载体转化到细胞中。将细胞孵育，在对数中期，通过添加诱导剂（如 IPTG）来触发基因 mRNA 的转录，从而启动表达。蛋白表达后，将粗材料悬浮在裂解缓冲液中，然后通过离心澄清。

然后将澄清的裂解物上样到镍柱上，带多聚组氨酸标签的蛋白质与柱结合，同时洗去所有其他生物分子。

一旦获得几毫克的纯蛋白质，就可以通过蒸汽扩散进行结晶。24 孔悬挂/坐式滴盘中装满了不同浓度的氯化钠和乙酸钠缓冲溶液。对于坐滴法，将等体积的蛋白质和储液槽溶液移液到每个孔上方的架子上，然后用透明胶带覆盖托盘。然后将托盘放入培养室中，第二天监测孔的生长情况，然后每隔几天监测一次。

一旦获得合适的晶体，就可以进行 X 射线衍射分析了。晶体安装在测角仪上，以将晶体定位在选定的方向。晶体用单色 X 射线光束以各个角度照射，产生衍射图案。该软件通过确定晶体中原子的位置，将在不同方向拍摄的二维图像转换为晶体内电子密度的三维模型。

现在我们已经回顾了一个程序，让我们回顾一下蛋白质结晶的一些有用应用，以及另一种结晶技术。

蛋白质结晶可用于计算机药物设计。流感病毒聚合酶碱性蛋白 2 的三维结构与哺乳动物的病毒感染有关，通过结晶和 X 射线衍射确定。蛋白质中的潜在结合位点被可视化，并使用对接程序，设计了一个三维分子，该分子将插入蛋白质的裂隙中。

蛋白质-DNA 复合物的共结晶也是一种有用的技术。DNA 结合蛋白调节多种生物学功能，例如转录和 DNA 聚合以及 DNA 修复;这些复合物的晶体结构可以深入了解蛋白质功能、机制和特异性相互作用的性质。大肠杆菌蛋白 SeqA 是 DNA 复制的负调节因子，与半甲基化 DNA 共结晶。

整合膜蛋白（如 G 蛋白偶联受体或 GCPR）难以结晶，因为它们可用于形成晶格接触的极性表面积有限，这导致了融合蛋白辅助蛋白质结晶的发展。将编码 ？2 肾上腺素能受体、 GCPR 和溶菌酶的基因插入到表达载体中。？2AR-溶菌酶融合蛋白的结晶是由于溶菌酶提供的天然疏水性 ？2AR 上的细胞外亲水表面增加，这是在晶格中形成堆积相互作用所必需的。

您刚刚观看了 JoVE 关于蛋白质结晶的视频。该视频描述了其原理、通用协议及其在生物医学领域的一些用途。感谢观看！