利用三色单分子FRET研究蛋白质相互作用的相关性

本实验的总体目标是以定量方式研究复杂蛋白质系统的动态行为，重点关注协同性等关联相互作用。该方法有助于回答定量生物学领域中的关键问题，其中蛋白质复合物及其动态相互作用具有核心重要性。该技术的主要优势在于，它能够将动态多色单分子FRET应用于具有生物学意义的系统。

在组装流动室之前，先在40微米厚的透明粘性薄膜上切割出流动通道，然后在该薄膜的非粘性面喷洒快干胶，并让胶水干燥。开始组装流动室时，取一片厚度为3毫米、经聚乙二醇生物素（PEG）功能化的熔融石英载玻片，该载玻片带有进样口和出样口。将已涂有喷雾胶的顶膜粘性面贴合到载玻片的功能化表面，使通道与进样口和出样口对齐。

将载玻片置于加热板上，在 80 摄氏度下加热一分钟。使用另一块显微镜载玻片均匀施压，将膜片压附在载玻片上，持续 30 秒。然后让组装物冷却一分钟。

揭下覆盖在粘合剂上的保护膜。将盖玻片置于暴露的粘合剂上，形成流动腔室。将腔室在80摄氏度下加热一分钟。

将盖玻片压在粘合剂上30秒以密封腔室，并让组装好的腔室冷却。在将流动腔室置于棱镜上方之前，先在棱镜表面滴加一滴甘油。将流动腔室安装在多色棱镜型全内反射荧光显微镜的样品 holder 中。

完成连接进样和出样管路。开始配置仪器以进行三色测量时，打开电子倍增CCD相机软件，将EMCCD传感器设置为尽可能低的温度。将相机垂直转移速度设为3.3微秒，选择正常垂直时钟电压，水平读出速率设为17毫赫兹（16位），前置放大增益设为3，电子倍增增益水平设为1000。

选择外部触发采集。将曝光时间设置为 70 毫秒，电影记录持续时间为 750 个采集周期。

为测量文件创建一个新文件夹。在EMCCD软件中启用自动保存功能，并将视频帧文件格式设置为TIFF。将自动保存的文件路径设置为新创建的文件夹。

然后打开控制声光可调滤波器的软件、激光控制软件，以及用于同步激光器、声光可调滤波器、光学快门和相机的触发软件。使用声光可调滤波器将进入棱镜前的激光功率调节至约3毫瓦。加载用于交替激光激发的触发模式，随后将样品架安装到仪器中。

将进样管末端放入含有实验缓冲液的微量离心管中。将出样管连接至设置为抽吸模式的注射泵。用 150 µL 缓冲液冲洗腔室。

将CCD相机聚焦于功能化界面，调整激发光束并对荧光污染物进行漂白。随后，将300微升浓度为0.25毫克/毫升的去糖基化亲和素缓冲溶液注入检测室，孵育1分钟。用缓冲液冲洗检测室，去除未结合的去糖基化亲和素。

然后，将300微升含有0.5毫克/毫升BSA的缓冲液流经反应室，以封闭表面功能化缺陷。接着，将生物素标记的荧光标记Hsp90以150微升为一份，逐步加入含BSA的缓冲液中，并逐渐提高Hsp90浓度，直至达到足够的表面密度。最后，用300微升含BSA的缓冲液冲洗反应室，去除未结合的蛋白质。

将150微升含有标记的AMP-PMP和BSA的缓冲液（浓度为25纳摩尔）加入样品室，孵育5分钟。重复加样和孵育一次。然后使用压电步进器将样品室垂直于激发光束移动，以按需改变观察视野。

如有必要，调整图像焦距。点击相机软件中的采集信号按钮（如图所示）开始相机录制。在触发软件中启动激发采集循环，以开始数据采集。

开始数据分析时，打开分析软件并导入两台相机记录的视频。点击“查找轨迹”以确定对应于潜在单分子的荧光强度轨迹。对于每个分子，计算同一激发光颜色下该位点所有轨迹的总和。

在所有通道中评估原始联合荧光强度是否大致呈平坦平台，并观察所有激发光颜色下是否均出现单一漂白步骤。检查相应的检测通道中是否存在反相关行为，以及荧光轨迹中是否出现红色荧光。若所有标准均满足，则保存该荧光轨迹以供进一步分析。

在此示例中，仅有指定的分子满足标准。应排除那些没有平坦平台期、显示闪烁事件而非反相关性，或具有多个漂白步骤的轨迹。轨迹筛选是所有单分子技术中的关键步骤。

仅应选择符合明确定义标准的轨迹。此处的标准包括反相关性、单步漂白以及平坦的平台期。接下来，依次显示保存的分子，并在一组强度轨迹中选择一个时间区间，该区间内所有荧光基团均已漂白。

计算该时间区间内的光束背景强度，然后选择Hsp90上两种染料均存在时的FRET效率范围，确保排除含有闪烁事件的轨迹。计算部分荧光轨迹。排除轨迹中信噪比过低的分子。

接下来，生成部分荧光数据的二维投影图，并启动相对种群计算工具。单击“Init”。在目标峰周围绘制一个多边形。

然后点击计数以计算该峰的相对种群数。生成部分荧光数据的三维直方图，并对直方图进行归一化处理。提取三维高斯拟合的初始参数，并将各态种群数添加到参数向量的末尾。

拟合数据并显示结果。在定义了三维部分荧光空间中每个状态的位置和宽度后，初始化隐马尔可夫模型界面。选择适当的状态数、输入信号的维度数以及输入类型。

优化隐马尔可夫模型（HMM）参数，以确定转移概率的最大似然估计值。对数据子集重复进行群体选择、拟合及HMM优化。最后计算转移概率的置信区间，并合并构象状态，以简化数据供进一步分析。

在标记的报告核苷酸AMP-PMP存在的情况下，通过三色单分子FRET研究了Hsp90蛋白的构象状态。根据荧光强度可区分出五种构象状态，其中四种状态具有不同的功能。三色单分子FRET获得了跨越三维空间的部分荧光数据。

采用二维投影来帮助区分不同状态，因为在实验条件下理论上预期的所有状态均可通过其在二维投影中的部分荧光信号加以区分。这些状态的相对占比通过二维投影确定，并作为三维高斯拟合的约束条件。随后进行的集成三维隐马尔可夫模型优化与建模，得到了提取出的状态转移概率。

为每个提取的速率常数计算了置信区间。在额外添加250 µM未标记AMP-PMP的条件下重复实验，阐明了Hsp90二聚体中一个核苷酸结合对第二个结合位点的影响。通过合并结合态与未结合态构象，可计算荧光标记AMP-PMP从Hsp90解离的平均停留时间，包括在有或无额外未标记AMP-PMP存在条件下的情况。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用多色FRET和全内反射荧光显微镜（TIRF）从动态蛋白质系统中提取动力学信息。该技术为生命科学研究人员确定多蛋白系统中的协同相互作用奠定了基础，对于深入理解协同性等基本调控机制具有重要意义。