应用三色单分子焦虑研究蛋白质相互作用的相关性

该程序的总体目标是以定量方式研究复杂蛋白质系统的动力学，重点是相关的相互作用，例如合作性。这种方法可以帮助回答定量生物学领域的关键问题，其中蛋白质复合物及其动态相互作用至关重要。该技术的主要优点是它允许将动态多色单分子 FRET 应用于生物学相关系统。

在组装流动室之前，在 40 微米厚的透明胶膜中切开一个流道，在薄膜的非粘合面上喷涂快速固定胶粘剂，并让胶粘剂干燥。要开始流通室组装，请获得一个 3 毫米厚的 PEG 生物素 PEG 功能化熔融石英载玻片，带有入口和出口孔。将天花板薄膜的喷涂胶粘剂涂层面涂在滑轨的功能化面上，使通道与入口和出口挂钩对齐。

将载玻片在热板上加热至 80 摄氏度 1 分钟。使用额外的显微镜载玻片将胶片压在载玻片上 30 秒，以均匀分布压力。然后让组件冷却一分钟。

撕下覆盖胶粘剂的保护膜。在裸露的粘合剂上放置盖玻片以形成流动室。将腔室加热至 80 摄氏度 1 分钟。

将盖玻片压在胶粘剂上 30 秒以密封腔室并让组装好的腔室冷却。在将流通室放在棱镜上之前，将一滴甘油滴在棱镜面上。将流通室安装在多色棱镜型 TIRF 显微镜的支架中。

完成后连接入口和出口管路。要开始配置仪器进行三色测量，请打开电子倍增 CCD 相机软件，将 EMCCD 传感器设置为尽可能低的温度。将相机垂直移位速度设置为 3.3 微秒，选择正常垂直时钟电压，将水平读出速率设置为 16 位 17 毫赫兹，将预放大增益设置为 3，将电子倍增器增益电平设置为 1000。

选择 External acquisition triggering（外部采集触发）。将曝光时间设置为 70 毫秒。电影录制持续时间为 750 个采集周期。

为测量文件创建一个新文件夹。在 EMCCD 软件中启用自动保存，并将影片帧文件格式设为 TIFF。将自动保存文件路径设置为新创建的文件夹。

然后打开控制声光可调谐滤波器的软件、激光控制软件和触发软件，将激光器与 AOTF、光学快门和相机同步。在进入棱镜之前，使用 AOTF 将激光功率调整到约 3 毫瓦。加载同步所有设备以进行交替激光激发的触发模式，然后将样品架安装在仪器中。

将入口管的末端放入含有实验缓冲液的微量离心管中。将出口管连接到设置为抽取模式的注射泵。用 150 μL 缓冲液冲洗腔室。

将 CCD 相机聚焦在功能化界面上，对准激发光束并漂白荧光污染物。然后将 300 微升每毫升 0.25 毫克的去糖基化亲和素和缓冲液溶液流入腔室中，孵育 1 分钟。用缓冲液从腔室中冲洗未结合的去糖基化亲和素。

然后让 300 微升 BSA 浓度为 0.5 毫克/毫升的缓冲液流过腔室，以阻止表面功能化缺陷。接下来，在含有 Hsp90 浓度的 BSA 缓冲液中加入 150 微升生物素化荧光标记的 Hsp90 ，以递增的浓度加载到流通室中，直到达到足够的表面密度。用 300 μL 含 BSA 的缓冲液从腔室中洗涤未结合的蛋白质。

将 150 微升标记的 AMP-PMP 和含 BSA 的缓冲液的 25 纳摩尔溶液装入腔室中，孵育 5 分钟。重复加载和孵育一次。然后使用压电步进器垂直于激发光束移动样品室，以根据需要改变视场。

如有必要，请调整图像焦点。如图所示，单击获取信号按钮，在相机软件中开始摄像机录制。在触发软件中启动激励采集周期以开始数据采集。

要开始数据分析，请打开分析软件并导入两台相机录制的动画。单击 find traces 以确定与潜在单个分子对应的荧光强度迹线。对于每个分子，计算具有相同激发颜色的该点的所有迹线的总和。

评估所有通道中的强度分布，以确定接头原始强度的大致平坦平台和所有激发颜色的单个漂白步骤。在适当的检测通道中寻找反相关行为，并在迹线中寻找红色荧光的出现。如果满足所有标准，请保存荧光迹线以供进一步分析。

只有指定的分子满足本例中的标准。排除没有平坦平台、显示闪烁事件而不是反相关或具有多个漂白步骤的痕迹。迹线选择是所有单分子技术中的关键步骤。

只应选择满足明确定义的条件的跟踪。这里的标准是反相关、单一漂白步骤和平坦平台。接下来，一个接一个地显示保存的分子，一组强度轨迹选择所有地板 4 都已漂白的时间间隔。

计算此时间间隔的光束背景强度，然后选择 Hsp90 上两种染料都存在的 FRET 效率范围，确保排除具有闪烁事件的迹线。计算部分荧光迹线。在迹线中排除信噪比低的分子。

接下来，生成部分荧光数据的绑定 2D 投影并启动相对种群计算工具。单击 Init。在感兴趣的峰值周围绘制一个多边形。

然后单击 count 以计算该峰值的相对总体。生成部分荧光数据的 3D 直方图并归一化直方图。超出 3D Gaussian 拟合的初始参数，并将状态总体添加到参数向量的末尾。

拟合数据并显示结果。在 3D 部分荧光空间中定义每个状态的位置和宽度后，初始化 Hidden Markov Model 接口。选择适当的状态数、输入信号的维数和输入类型。

优化 HMM 参数以确定转移概率的最大似然估计量。对数据子集重复总体选择、拟合和 HMM 优化。最后，计算转换概率的置信区间并折叠构象状态以简化数据以供进一步分析。

标记的报告核苷酸 AMP-PMP 存在下，用三色单分子 FRET 研究 Hsp90 蛋白的构象状态。5 种构象状态可通过荧光强度区分，其中 4 种状态在功能上是不同的。三色单分子 FRET 产生跨越 3D 空间的部分荧光数据。

2D 投影用于帮助分离状态，因为在实验条件下理论上预期的所有状态都可以通过它们在 2D 投影中的部分荧光来区分。这些状态的相对总体是根据 2D 投影确定的，并用作 3D 高斯拟合的约束。随后的集合 3D HMM 优化和建模提供了提取的状态转换概率。

计算每个提取速率常数的置信区间。在额外的 250 μmol 未标记 AMP-PMP 存在下重复实验阐明了一个核苷酸结合对 Hsp90 二聚体中第二个结合位点的影响。折叠结合和未结合的构象可以计算在存在和不存在额外的未标记 AMP-PMP 的情况下荧光 AMP-PMP 与 Hsp90 解离的平均停留时间。

观看此视频后，您应该对如何使用多色 FRET 和 TIRF 显微镜从动态蛋白质系统中提取动力学信息有很好的了解。这项技术为生命科学研究人员确定多蛋白质系统中的相关相互作用铺平了道路。这对于更深入地理解基本调控机制（如合作性）非常重要。